基于质谱分析的定性蛋白质组学方法

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1、基于质谱分析的定性蛋白质组学方法齐孟文中国农业大学现代质谱是蛋白质分析与研究的基本实验技术，这里简要介绍有关蛋白质鉴定的质谱原理、实验平台，及其质谱解析算法，以期对相关领域的技术线路和实验方法有一基本了解。1.现代生物质谱的一般结构生物质谱得益于两种软电离技术的发展，即基质辅助激光解吸电离(MALDI)和电喷雾电离（ESI）。图.MALDI电离原理示意图，一般得到单价的正离子。孙汉昌，2011，蛋白质组质谱数据处理关键问题与技术研究。图.ESI电离的示意图，一般得到多价态的离子。图片来自，孙汉昌，2011，蛋白

2、质组质谱数据处理关键问题与技术研究。2.定性蛋白组学的实验平台图.ABI4700质谱仪组成、常用实验策略和数据处理。图片来自张记阳，2007，蛋白质组学中串联质谱数据搜库结果质量控制方法研究。图.LTQ-Orbitrap质谱平台及常用实验流程。图片来自张记阳，2007，蛋白质组学中串联质谱数据搜库结果质量控制方法研究。3.蛋白质组学的实验策略在基于质谱技术的蛋白质组学研究中，有两种基本的实验策略：自底向上策略(Bottom-up)和自顶向下策略(Top-down)。自顶向下策略是以蛋白质分子整体作为分析对象，通

3、过蛋白质的肽质量指纹（peptidemassfingerprinting,PMF）对蛋白进行鉴定的方法。为了有效地克服质量简并的现象，减少搜索目标的范围，一般选择高精度和高分辨率的质谱，如傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（2ppm，50000）。该策略具有较高的序列覆盖度和翻译后修饰特征的保持，适合于翻译后修饰及特殊的蛋白质异构体的分析。不足的是，(1)实验样品蛋白质需要高度纯化；(2)在目前的实验条件下，较难分析大分子量的蛋白质。自底向上策略,称之为鸟枪法,是利用串联质谱数据，即肽碎片指纹（peptidefrag

4、mentfingerprinting，PFF）来鉴定肽段序列，然后再推断组装样品中包含的蛋白质,是常用的高通量分析策略。由于肽碎片携有呈几何增长的组合信息，可以消除质量简并之忧，对质谱的质量分辨率要求不高，多用于对复杂样品的混合物进行高通量分析。图.自底向上策略和自顶向下策略示意图。孙汉昌，2011，蛋白质组质谱数据处理关键问题与技术研究。4.串联质谱生产特点及解析利用低能惰性气体诱导碰撞,使肽骨架各种键断裂，生成N端的-a，b-，-c类和C端的x-，y-，-z类6种系列离子，低能CID主要产生y-，b-,其次

5、是-a离子。另外两个骨架键断裂往往会形成内部碎片,如氨基一酰基离子(amino-acyliumion),亚氨(immnonim)离子等。碎片离子还有可能丢失一个中性分子基团(比如水或者氨分子)形成新的离子，高能量CDI则还可导致侧链的断裂而得到其它类型的离子。AnIntroductiontoBioinformaticsAlgorithmswww.bioalgorithms.infob2-H2Ob3-NH3a2b2a3b3HONH+3

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7、R1OR2OR3OR4

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17、H--N---C---C---N-

18、--C---C---N---C---C---N---C--COOH

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25、图.CID作用下肽键的断裂方式HHHHHHHy3y2y1y3-H2Oy2-NH3图.部分离子示意举例不同类系列间存在一定的联系,如质量和的关系a+x=b+y=c+z,和ax,b和y以及c和z称为互补的离子,互补ii-nii-nii-ni-nii-nii-n离子的质量和等于母离子的质量。相邻的离子，比如b和b+1，y和y+1等则iiii称为连续离子,连续离子之间的质量差正好是一个氨基酸的质量,某类离子与其失水失氨离子称为同源离子,同源

26、离子之间相差某些分子基团，如CO,H2O,NH3等,因此其质量的差值也可计算出来。AnIntroductiontoBioinformaticsAlgorithmswww.bioalgorithms.infob2-H2Ob3-NH3a2b2a3b3HONH+3

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28、R1OR2OR3OR4

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38、H--N---C---C---N---C---C---N---C---C---N---C--COOH

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45、HHHHHHHy3y2y1y3-H2Oy2-NH3图.示意失去中性分子集团而产生的离子类型。图.连

46、续离子构成阶梯式质量序列5.实验质谱预处理基本流程质谱仪产生的图谱{mz/，I}，包含质荷比和信号强度的信息，由于酶切和CID碎裂都遵从一定的物理化学规律，蛋白质和肽段产生的质谱都具有特定的模式，这是利用质谱数据进行蛋白质和肽段鉴定的理论基础。从数据采集的角度来说，原始质谱是质谱仪按照固定的时间间隔采集得到的模式谱，其构成包括序列离子，内部碎裂离子，以及电子和化学噪声。电子噪声是随机分