实验二绿豆芽的蛋白质含量测定

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1、龙志敏20093022012109制药一班实验二绿豆芽的蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250比色法)一、实验目的1、了解考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理，掌握其测定方法。2、熟练掌握分光光度计的使用技术。二、实验原理考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，该结合物在595nm波长下有最大光吸收。在一定的蛋白质浓度范围内(0～1000μg/mL)，其吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于可溶性蛋白质的定量测定。三、仪器、试剂和材料1、仪器设备分析天平、10mL塑料离心管、5mL

2、移液管、研钵、量筒、50mL离心管、10mL容量瓶、离心机、722型分光光度计2、试剂（1）标准蛋白质原液：称取100mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，即为1mg/mL的标准蛋白质原液。（2）考马斯亮蓝G-250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL95%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。3、材料：绿豆芽四、操作步骤（一）绿豆芽蛋白质样品的制备1、准确称取新鲜绿豆芽下胚轴2g，放入研钵中，加入2mL蒸馏水研成匀

3、浆，转移至50mL离心管中，再用6mL蒸馏水充分洗涤研钵，洗涤液收集于同一量筒中，定容至10ml,混匀；2、冰浴中放置10-20min以充分提取；3、从量筒中取1ml至离心管，12000rpm离心5min，将上清液倒入10mL量筒，以蒸馏水定容至10mL，即得绿豆芽蛋白质样品溶液。（二）标准曲线制作2、高浓度标准曲线的制作（0～1000μg/mL）取6支1.5mL的离心管，按表1.2加入试剂，配制不同浓度的蛋白质标准液试管号0123451mg/mL的标准蛋白质原液(mL)00.20.40.60.81.0蒸馏水(

4、mL)1.00.80.60.40.20蛋白质含量(μg)02004006008001000OD595nm00.1960.3460.4870.6020.781另取6支10mL的离心管，编号标记，从上述各管中分别吸取0.1mL溶液，加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂，盖上离心管盖子，充分混匀，放置3min后在595nm波长下比色测定（比色应在lh内完成），记录各管测定的光密度值OD595nm。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，制作蛋白质浓度为0～1000μg/mL的标准曲线如下：（三）绿豆芽蛋白

5、质样品溶液浓度的测定另取2支10mL的离心管，分别加入0.lmL绿豆芽蛋白质样品溶液，加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂，盖上离心管盖子，充分混匀，放置3min后在595nm波长下比色，记录吸光度，如下表：试管号12绿豆芽蛋白质样品溶液（ml）0.10.1OD595nm0.2240.235计算吸光度平均值得：（0.224+0.235）/2=0.229五、结果与分析所测样品提取液的吸光度为0.229，代进标准曲线方程：Y=0.0008X得其相应的蛋白质含量为286.25μg计算绿豆芽蛋白质含量=14.3μg六、注

6、意事项1、蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合的反应迅速，反应在2min左右达到平衡，其结合物在室温下1h内保持稳定。因此，比色应在出现蓝色3min～lh内完成，不可放置太久。2、考马斯亮蓝染色能力强，所用比色皿应及时清洗，否则会污染比色皿，影响吸光值测定。切不可使用石英比色皿测定。3、高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂对测定有干扰。七、思考题1、做好本实验的关键问题有哪些？答：研磨绿豆芽要充分；冰愈离心时间要足；比色应在出现蓝色3min～lh内完成2、如何正确使用分光光度计？答：1

7、.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。　　2.将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。）　　3.根据所需波长转动波长选择钮。　　4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。　　5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。　　6.盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的t=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。　　7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用

8、软布或软纸擦净。