SN∕T 5554-2022 玉米矮花叶簿检疫鉴定方法[商检]

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ICS65.020.20CCSB16中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5554—2022玉米矮花叶病毒检疫鉴定方法DetectionandidentificationofMaizedwarfmosaicvirus2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布

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2SN/T5554—2022前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国上海海关、中华人民共和国哈尔滨海关、中华人民共和国长春海关、中华人民共和国湛江海关、浙江大学、中国农业科学研究院植物保护研究所。本文件主要起草人:于翠、田沂民、刘洪义、李海滨、龙阳、刘丽玲、吴建祥、刘忠梅、周雪平。Ⅰ

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4SN/T5554—2022玉米矮花叶病毒检疫鉴定方法1范围本文件规定了玉米矮花叶病毒的DAS-ELISA、RT-PCR检测、免疫电镜及鉴别寄主测定等检测和鉴定方法。本文件适用于进出境及田间监管期禾本科植物材料包括种子、种苗及其蚜虫等传毒介体携带的玉米矮花叶病毒的检测和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4玉米矮花叶病毒基本信息中文名:玉米矮花叶病毒。英文名:Maizedwarfmosaicvirus。缩写:MDMV。分类地位:马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒。MDMV的其他信息见附录A。5原理PCR仪、酶标仪、电子天平(1/1000g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、冷冻离心机、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、漩涡振荡器、球磨仪、电子透射显微镜。6仪器、设施、用具和试剂6.1仪器PCR仪、酶标仪、电子天平(1/1000g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、冷冻离心机、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、漩涡振荡器、球磨仪、电子透射显微镜。1

5SN/T5554—20226.2设施隔离温室(10℃~30℃)。6.3用具可调式微量移液器(2、10、100、200、1、5)及相应的无RNA酶的吸头、μLμLμLμL000μL000μL无RNA酶的离心管、PCR管和研钵等。6.4试剂除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯。血清检测试剂盒、液氮、植物总RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR检测试剂盒、琼脂糖、PBS缓冲液等。血清学和分子生物学试剂配制按照附录B和附录C执行。7抽样和待检样品制备7.1抽样抽样按照SN/T2122的规定执行。7.2待检样品制备7.2.1种子类样品若样品中存在畸形、不成熟的种子,则从中挑取出来单独作为一个样品进行检测;若无明显异常,则随机取适量种子,研磨仪研磨成粉后,按照1∶10(质量:体积)加入抽提缓冲液(符合B.1.5)混合均匀,,或取约0.13000g低速离心取100μL上清液用于DAS-ELISA或核酸检测g干粉样品直接提取RNA。7.2.2种苗类样品对于有症状的种苗类样品单独检测,重点选取表现症状的幼嫩叶片;无症状样品至少选取20株的幼嫩叶片进行混样检测。样品研磨后按照1∶10(质量:体积)加入提取缓冲液混合均匀,制备的汁液分别盛装于1.5mL离心管中,3000g低速离心后吸取上清液用于DAS-ELISA或核酸检测,或直接将叶片利用液氮进行研磨,取约0.1g干粉样品直接提取RNA。8检测与鉴定8.1检测鉴定流程检测流程见图1,在检测过程中应设置合适的对照。当首次检出或某一地区首次发生时,应在分子检测结果的基础上,进一步采用其他方法进行验证。2

6SN/T5554—2022图1MDMV检测鉴定流程图8.2双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA)取7.2中制备的待检样品用于血清学检测。试验设置2个阳性对照孔、2个阴性对照孔、2个空白对照孔作为质量控制,并根据送检样品数量设置待检测样品孔数,要求每个待测样品至少设2次重复。具体检测步骤按照附录B执行。8.3RT-PCR检测取7.2中制备的待检样品上清液100μL或0.1g粉末用于植物总RNA提取并进行RT-PCR检测。试验用健康的植物组织作阴性对照,用受MDMV侵染的植物样品作阳性对照,用灭菌双蒸水作空白对照,每个反应体系设置两个平行。具体操作按照附录C执行。8.4免疫电镜免疫电镜检测按照SN/T1840中的方法进行观察。3

7SN/T5554—20228.5鉴别寄主测定在室温(20℃~25℃)条件下,栽种于隔离检疫温室中的玉米(Zeamays)、高粱[Sorghumbicolor(L.)Moench]、假高粱(Sorghumhalepense)等鉴别寄主植物真叶长出后可作为指示植物用于摩擦接种。对经DAS-ELISA或RT-PCR检测阳性的植株或种子,加入适量接种缓冲液研磨后接种指示植物。接种7d~10d后,根据寄主植物产生的症状,判定是否接种成功。具体操作见附录D。9结果判定样品检测时,检测流程及结果判定按下述原则进行。———RT-PCR初步筛检,若检测结果为阴性,则判定样品不携带MDMV;若一对引物检测结果为阳性,则采用产物序列测定分析或另一对引物再次检测,若验证结果为阳性,则判定样品携带MDMV;若验证结果为阴性,则判定样品不携带MDMV。———ELISA检测仅用于有明显症状的植株样品,若ELISA检测结果阳性,则还需RT-PCR进行复验,若验证结果阳性,则判定样品携带MDMV;若验证结果为阴性,则判定样品不携带MD-MV。10样品与记录结果保存10.1经检测确定携带玉米矮花叶病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种子保存在干燥条件下,其他病叶等样品保存在-20℃冰箱中,有条件的保存在-80℃冰箱中。做好登记和标记工作。10.2记录包括:样品来源,种类,取样人员,实验的时间、地点、方法和结果,检验检疫员的签字等。酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的光密度OD值,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片,RT-PCR检测应有电泳结果照片及序列测定分析数据4

8SN/T5554—2022附录A(资料性)玉米矮化叶病毒其他相关资料A.1寄主范围MDMV的寄主仅限于禾本科植物,包括玉米、甜玉米(Zeamayssubsp.mays)、高粱、假高粱、燕麦(Avenasativa)、扁穗雀麦(Bromuscatharticus)、孟仁草(Chlorisbarbata)、两耳草(Paspalumcon-jugatum)、御谷(Pennisetumglaucum)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、苏丹草(Sorghumsudanense)、侧钝叶草(Stenotaphrumsecundatum)、摩擦禾(Tripsacumdactyloides)、臂行草属(Urochloaplantag-(Mill.)inea)、黍(Panicummiliaceum)、粟[Setariaitalicavar.germanicaSchred]、狗尾草[Setaria(L.)viridisBeauv.]等15种禾本科作物及杂草,而试验寄主则多达290多种,其中假高粱是MDMV田间永久毒源。A.2为害症状玉米矮花叶病是玉米上发生严重的一种病害,受害植株雄穗不发达,分枝减少甚至退化,果穗变小,秃顶严重,有的不结实。MDMV在玉米和高粱上引起的症状相似,受病毒侵染的植株表现为褪色、矮化、不育,有时提早枯死,症状严重度主要取决于品种的感病性及侵染时间的早晚,早期侵染导致严重及更明显的症状。普通玉米常比甜玉米及玉米自交系症状要轻。花叶通常出现在尚处于叶鞘中而未展开的心叶基部,先是在主脉两侧出现褪绿斑点和条斑,然后整个成长叶片布满病斑,条斑和条点相连形成沿叶脉扩展的褪绿条纹或线条,感染后新长出的叶片变为褪绿和黄化(见图A.1)。图A.1MDMV侵染玉米的症状(引自CABI)A.3分布地区MDMV在欧洲、美洲、非洲和澳大利亚等玉米产地均有分布。近年来研究者的鉴定结果表明发生5

9SN/T5554—2022于中国的玉米矮花叶病害的病原为甘蔗花叶病毒,而不是玉米矮花叶病毒。欧洲:捷克、克罗地亚、俄罗斯、德国、希腊、法国、匈牙利、意大利、西班牙、乌克兰、罗马尼亚、塞尔维亚和黑山。美洲:加拿大、美国、墨西哥、古巴、洪都拉斯、海地、阿根廷、巴西、智利、秘鲁、委内瑞拉、哥伦比亚。亚洲:中国、格鲁吉亚、伊朗、伊拉克、韩国、哈萨克斯坦、土耳其、菲律宾、巴基斯坦、乌兹别克斯坦。非洲:埃及、尼日尔、尼日利亚、津巴布韦、南非、摩洛哥、埃塞俄比亚、肯尼亚、喀麦隆、摩洛哥、赞比亚、毛里求斯。大洋洲:澳大利亚。A.4传播方式超过20种蚜虫能够以非持久性方式传播MDMV。能够传毒的蚜虫种类包括玉米蚜[Rhopalosi-(Fitch)]、桃蚜[Myzus(Sulzer)]、禾缢管蚜[Rhopalosiphum(Linnae-phummaidispersicaepadi(Gill.)]、甘蓝蚜[Brevicoryne(Linnaeus)]和苹果us)]、早熟禾缢管蚜[Rhopalosiphumpoaebrassicae缢管蚜[Rhopalosiphum(Sand.)]等。蚜虫获MDMV时间10fitchiis~30s,持毒时间一般为30min~240min,但少数蚜虫的持毒时间可超过19h,使得MDMV能长距离传播。增加获毒时间,可延长持毒时间,蚜虫的不同生物型在传毒效率上也不同。病毒浓度和病株组织的老、嫩会影响蚜虫的传播。MDMV发生高峰与蚜虫介体大量迁飞相一致。蚜虫迁飞发生于5月~7月,有时甚至到8月。此外已证明MDMV还能由锈菌(Puccinia的夏孢子传播。sorghi)除蚜虫和锈菌夏孢子传播外,MDMV也可经种子传播。由带毒玉米种子长出玉米矮花叶病的植株的概率约为0.5%,而带毒率则因玉米品种不同而有变化。对种子不同成熟阶段进行解剖分析确认病毒的存在部位,发现传粉21d后,种皮都能检出MDMV,而胚或胚乳则只偶尔能检出MDMV。病毒不能侵染胚意味着病毒传给下一代的机率大大降低。MDMV汁液接种传播。A.5病毒粒体和基因组特征MDMV病毒粒子弯曲线状,大小约为750nm×14nm(见图A.2),沉降系数为165S~175S,MD-(ssRNA),约9MV病毒粒体中核酸占5%~6%,蛋白占94%~95%,基因组为单链正义RNA500外壳蛋白分子量约30bp,kDa。病毒侵染后在植物细胞内产生风轮状及卷筒状内含体。图A.2粗提纯的玉米矮花叶病毒粒体(2%磷钨酸负染色)6

10SN/T5554—2022A.6与玉米矮花叶病害相关的其他病毒玉米矮花叶病又名花叶条纹病、花叶病毒病、黄绿条纹病,是世界上玉米产区普遍发生的病毒病害之一,玉米矮花叶病的发生流行严重影响了玉米生产,约翰逊草花叶病毒(Johnsongrassmosaic、玉米矮花叶病毒(Maize、甘蔗花叶病毒(sugarcanevirus,JGMV)dwarfmosaicvirus,MDMV)mosa-和高粱花叶病毒(sorghum种不同的病毒都能引起玉米矮化花icvirus,SCMV)mosaicvirus,SrMV)4叶症状。4种病毒都可侵染玉米和高粱,但MDMV能够侵染假高粱,不能侵染甘蔗,相反SCMV能侵染甘蔗,却不能侵染假高粱。A.7玉米矮花叶病毒株系MDMV的株系众多,以前一般认为可分为A、B、C、D、E、F、O和KS18个株系,近年来通过细胞病理学、寄主范围及基因组特征等明确将MDMV-B株系划为SCMV,MDMV-O和KS1划到JGMV。7

11SN/T5554—2022附录B(规范性)双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA)B.1材料与试剂B.1.1酶标板的要求使用质量有保证厂商生产的产品。B.1.2包被抗体特异性的玉米矮花叶病毒抗体。B.1.3酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的玉米矮花叶病毒抗体。B.1.4底物对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。B.1.51×PBST缓冲液(pH7.4)氯化钠(NaCl)8.0g磷酸二氢钾(KH)0.22PO4g磷酸氢二钠(Na)1.152HPO4g氯化钾(KCl)0.2g吐温-200.5mL溶于900mL双蒸水中,并定容至1000mL,4℃储存。B.1.6样品抽提缓冲液(pH7.4)亚硫酸钠(Na)1.32SO3g聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW24000~40000)20.0g溶于900mL的1×PBST中,并用1×PBST定容至1000mL,4℃储存。B.1.7包被缓冲液(pH9.6)碳酸钠(Na)1.592CO3g碳酸氢钠(NaHCO)2.933g溶于900mL双蒸水中,并定容至1000mL,4℃储存。B.1.8酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4)牛血清白蛋白(BSA)2.0g聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW24000-40000)20.0g溶于900mL1×PBST中,并用1×PBST定容至1000mL,4℃储存。8

12SN/T5554—2022B.1.9底物缓冲液(pH9.8)二乙醇胺97mL氯化镁(MgCl)0.12g溶于800mL双蒸水中,用浓盐酸(HCl)调pH至9.8,定容至1000mL,4℃储存。注:以上缓冲液也可以使用商品化试剂,稀释操作步骤按使用说明进行。B.1.10反应终止液氢氧化钠(NaOH)120g溶于1000mL的无菌蒸馏水中,浓度3mol/L。B.2检测B.2.1根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上,包括2个阳性对照孔、2个阴性对照孔、2个空白对照孔和多个待检测样品孔。待测样品孔重复两次。,封口膜包好,37孵育2B.2.2每孔加入100μL的MDMV的包被抗体溶液℃h~4h(或4℃冰箱过夜)。,每次B.2.3将酶联板孔中溶液控干,用200μL的1×PBST洗涤液洗涤酶联板3次3min,然后在干净毛巾或滤纸上扣干。,对照孔中也各加入100B.2.4将100μL制备的待测样品溶液加入到设计的待检测孔中μL相应的阴性对照、阳性对照和空白对照。封口膜包好,37℃孵育2h~3h(或4℃冰箱过夜)。B.2.5洗涤,步骤同B.2.3。,封口膜包好,B.2.6用酶标抗体稀释缓冲液按照要求稀释酶标抗体,每孔加入100μL酶标抗体溶液并于37孵育2℃h~4h。B.2.7洗涤,步骤同B.2.3。,室B.2.8将ρNPP溶于底物缓冲液中,使最终浓度为1mg/mL。每孔加入100μL配好的底物溶液温孵育0.5h~2h。必要时每孔加入50μL的3mol/L氢氧化钠溶液终止反应。波长下检测各孔的吸收值并记录。B.2.9酶标仪405nmB.3结果判定B.3.1质量控制要求缓冲液孔和阴性对照孔的OD值小于0.15,阴性对照孔的OD值小于0.05时,按0.05计算。405405阳性对照有明显的颜色反应,孔的重复性以样品OD值的平行允许率控制,按照公式(B.1)进行计算:OD1-OD2)P=×100%…………………………(B.1(OD)×1/21+OD2式中:P———平行允许率,%;OD1———重复样品1;OD2———重复样品2;当重复检测样品OD值平行允许率(P)小于20%时,判定检测结果有效。B.3.2若满足不了B.3.1的质量要求,则不能进行结果判定。B.3.3在满足了B.3.1的质量要求后,则按如下原则作出判定:———样品OD与阴性对照OD值之比明显大于2,结果判定为阳性;4054059

13SN/T5554—2022———样品OD与阴性对照OD值之比小于2,判为阴性;405405———样品OD与阴性对照OD值之比在阈值附近,判为可疑样品,应重新检测或其他方法405405验证。10

14SN/T5554—2022附录C(规范性)一步法RT-PCR检测C.1试剂C.1.1电泳缓冲液TAE(50×)三羟甲基氨基甲烷(Tris)242g冰乙酸52.1mL0.5mol/L乙二胺四乙酸钠(EDTA)100mL用时加蒸馏水稀释至1×TAE。C.1.2植物总RNA提取试剂TRizoL裂解液、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇或直接购买商品化植物总RNA提取试剂盒。C.1.3一步法RT-PCR检测试剂商品化一步法RT-PCR检测试剂盒。C.1.4引物序列2对特异性扩增MDMV外壳蛋白基因的引物可供选择:第1对引物:MDMV482F:5’-YGCATCTCCAACTTTCAGACA-3’MDMV482R:5’-CCTCACTCACTTGCVGACA-3’退火温度58℃,预计扩增片段长度为482bp。第2对引物:MDMV-194F:5’-GTRCAGAAAGARTACGAACT-3’MDMV-194R:5’-TGCATRATYTGTCTGAAAGTTG-3’退火温度58℃,预计扩增片段长度为194bp。注:Y表示C或者T;R表示A或者G;V表示G、A或者C。C.2核酸提取使用Trizol法提取总RNA。称取0.1g植物叶片组织加液氮研磨成粉末状,迅速将其移入灭菌的1.5mL离心管中,加入1mLTrizol试剂,剧烈振荡摇匀3min;4℃,12000g离心10min;取上清液,加入0.2mL三氯甲烷,上下颠倒混匀,室温静置3min;4℃,12000g离心10min;取上层水相,加等体积的异丙醇,颠倒混匀;4℃,12000g离心10min,弃上清液;加75%的乙醇洗涤沉淀;4℃,7500g离心2min,弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后,溶于30μLDEPC处理的超纯水中,用微量分光光度仪测核酸的浓度和纯度,-20℃保存备用。注:或者按照商品RNA提取试剂盒进行操作。C.3一步法RT-PCR扩增C.3.1PCR反应体系反应体系见表C.1,每个样品设2个平行处理。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的11

15SN/T5554—2022反应总体积进行适当调整。检测时以含该病毒的材料作为阳性对照,以健康植物材料作为阴性对照,以水代替模板作为空白对照。表C.1一步法RT-PCR反应体系名称储存液浓度/(umol/L)加样量/μLRnaseFreeddH2O7.52×1stepbuffer—12.5上游引物51.0下游引物51.0酶—1.0RNA模板—2.0总体积—25C.3.2RT-PCR反应参数普通RT-PCR反应参数见表C.2,不同仪器可根据要求将反应参数作适当调整。表C.2普通RT-PCR反应参数反转录变性扩增条件循环次数延伸94℃,30s50℃,30min94℃,3min58℃,30s35(35~50)72℃,10min72℃,30sC.3.3PCR扩增产物的电泳检测用电泳缓冲液配制2.0%的琼脂糖凝胶(55℃~60℃时,加入4SGreenPlus无毒核酸染料至终浓度为0.5/mL,也可在电泳后进行染色)。在电泳槽中加入电泳缓冲液,使液面刚刚没过凝胶。将μg9μLPCR扩增产物,加1μL10×上样缓冲液上样。恒压5V/cm~6V/cm电泳40min~50min。凝胶成像系统中观察电泳结果,拍照并记录结果。注:也可采用其他核酸染料。C.4结果判定如果阴性对照和空白对照未出现条带,阳性对照出现预期大小的条带,样品未出现预期大小的条带,则可判定样品不携带玉米矮花叶病毒。如果阴性对照和空白对照未出现条带,阳性对照出现预期大小的条带,任一引物扩增样品获得预期大小条带,可判定PCR结果阳性,但还需通过序列测定和Blast分析进一步确认。12

16SN/T5554—2022附录D(资料性)鉴别寄主测定D.1接种缓冲液0.05mol/L、pH7.2的磷酸缓冲液。D.2接种玉米矮花叶病毒的鉴别寄主包括玉米、高粱和假高粱。寄主植物在隔离温室种植,选择具有4片~5片真叶、长势良好的植株。将320目的金刚砂均匀撒在叶片上,在叶片上滴1滴接种物,用带手套的手指轻轻涂抹。接种不同样品,手套要同步更换。或者直接用手涂抹,但是接种不同样品,手要用碱性肥皂彻底清洗干净。接种后的植株立即用大量自来水冲洗干净,然后放置隔离温室,15d后可进行症状观察或实验室检测。D.3症状表现玉米:花叶和黄化,并伴随出现紫红色的症状,植株矮化。花叶通常出现在尚处于叶鞘中而未展开的心叶基部,先是主脉两侧出现褪绿斑点和条斑,然后整个叶片布满病斑,感染后新长出的叶片变为褪绿和黄化。高粱:出现红色条纹、褪绿、矮化、分蘖增多和坏死症状。最初花叶处于叶鞘里心叶的基部,先是褪绿斑或条斑,后合并而扩展为褪绿条纹或线纹。假高粱:症状类似高粱,不同长度和密度的褪绿条纹沿叶脉扩展,常变为紫红色,随着假高粱叶片成熟,花叶症状消失,仅在顶部2,3叶表现明显的花叶症状。D.4结果判定若寄主植物出现上述典型症状,则可判定寄主植物接种成功;若未出现上述典型症状,则可送实验室进行ELISA或RT-PCR进一步验证。13

17SN/T5554—2022参考文献[1]https://www.plantwise.org/KnowledgeBank/datasheet/8157#SymptomsSection.玉米矮花叶病毒研究进展[J].微生物学通报,2022,29(5):77-81.[2]蒋军喜,李桂新,周雪平.玉米矮花叶病流行学研究进展[J].玉米科学,2003,11(2):89-92,95.[3]王海光,马占鸿.玉米矮花叶病毒北京分离物复制酶基因的克隆及序列分析[J].[4]陈红运,范在丰,邓丛良,等.植物病理学报,2002,32(1):33-36,42.[5]JiangJX,ZhouXP.MaizedwarfmosaicdiseaseindifferentregionsofChinaiscausedbySugarcanemosaicvirus[J].Archivesofvirology,2002,147:2437-2443.赵玖华,王升吉,等.山东省玉米病毒病病原鉴定与防治研究[J].玉米科学,2007,[6]尚佑芬,15(5):128-132.等.玉米矮花叶病研究概述[J].山西农业科学,2014,[7]闫彩清,李凌雨,王学雄,42(11):1230-1232.等.江苏玉米矮花叶病病原鉴定[J].江苏农业科学,2013,:[8]缪倩,任春梅,吴丽莉,41(2)118-121.一个引起玉米矮花叶病的甘蔗花叶病毒基因组全序列测定及其结构分[9]程晔,陈炯,陈建平.析[J].中国科学C辑,2001,31(6):497-504.[10]KannanM,IsmailI,andBunawanH.MaizeDwarfMosaicVirus:FromGenometoDis-easeManagement[J].Viruses,2018,10(9):492-514.14