SN∕T 1723.1-2022 马铃薯金线虫和马铃薯白线虫检疫鉴定方法

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ICS65.020.20CCSB16SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1723.1—2022代替SN/T1723.1—2006SN/T1723.2—2006马铃薯金线虫和马铃薯白线虫检疫鉴定方法DetectionandidentificationofGloboderarostochiensis(Wollenvveber)SkarbilovichandG.pallida(Stone)Behrans2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布

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2SN/T1723.1—2022.t/.—»—刖百本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件代替SN/T1723.1—2006《马铃薯白线虫检疫鉴定方法》、SM/T1723.2—2006《马铃薯金线虫检疫鉴定方法》，除结构调整和编辑性改动外•主要技术变化如下：-本文件将SN/T1723.1和SN/T1723.2在原文件基础上进行合并；-符号和缩略语增加了DGOஹEx.P.ஹGranek比值、GubஹTailஹVMB-增加了分子生物学检测所必需的仪器、用具和药品；-抽样进行修改•并引用SN/T2122为规范；-增加了球抱囊线虫属形态学鉴定.包括雌虫、雄虫、2龄幼虫、球抱囊线虫属与近似属的区别；-增加了马铃薯金线虫、马铃薯白线虫与近似种的区别.替代原文件中马铃薯金线虫与马铃薯白线虫的区别；-增加了分子生物学鉴定；—结果判定在原有文件的基础上.增加了主要鉴定特征.增加了形态学特征不足以判定时结合分子生物学检测结果进行判定；-附录A在原文件基础上作了适当的合并和修改.线虫分布更新.并新增线虫为害症状的描述；-附录C系新增球抱囊线虫属与近似属区别的具体内容；-附录F系新增马铃萼金线虫、马铃薯白线虫与近似种区别的具体内容.代替S\/T1723.2中的附录C（马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的主要区别）；-附录G和附录H系新增了分子生物学鉴定的具体内容。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国上海海关、中华人民共和国重庆海关、中国检验检疫科学研究院。本文件主要起草人：宋绍禅、俞禄珍、滕少娜、葛建军、王旭、戚龙君。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：-SN/T1723.1-2006,2006年首次发布.本次为第一次修订；$N/T1723.2—2006,2006年首次发布。I

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4S^7T1723.1—2022马铃薯金线虫和马铃薯白线虫检疫鉴定方法1范围本文件规定了进境植物检疫中马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的检疫鉴定方法。本文件适用于输华的马铃薯种萼、食用马铃薯、带根或土的茄属植物及其他带根或土的植物繁殖材料中马铃萼金线虫和马铃薯白线虫的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件比不可少的条款•其中.注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件.其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4符号和缩略语下列符号和缩略语适用于本文件。DGO:背食道腺开口至口针基部球的距离（）;Ex.P.:体前端至排泄孔的距离
/m(;Granek比值（格氏比值）：肛门到阴门膜孔边缘的最近距离/阴门膜孔直径;Gub引带长度஻m(;L虫体体长+fzm(n测计的线虫样本数目；Spi交合刺长度+pim(;Stylet：□针长度஻m(;Tail：尾长஻m）;VMB体前端至中食道球瓣的距离5基本信息5.1马铃薯金线虫学名：Globoderarostochiensis+Wollenweber,1923）,Skarbilovich,1959o异名：HeteroderaschachtiirostochiensisWollenweber,1923;HeteroderaschachtiisolaniZim9mermann,1927.英文名Goldenpotatocystnematode»yellowpotatocystnematode,goldennematode1

5SN/T1723.1—2022分类地位：线虫门(Nematoda),色矛纲(Chromadorea),色矛亚纲(Chromadoria),小杆目(Rhabo-litida),垫刃亚目(Tylenchina).垫刃总科(Tylenchoidea),纽带线虫科(Hoplolaimidae),异皮线虫亚科(Heteroderinae)、球胞囊线虫属(Globodera)o马铃萼金线虫其他信息应符合附录A的规定。5.2马铃薯白线虫学名:Globoderapallida(Stone)Behrans,1975。异名：HeteroderapallidaStone,1973o英文名Whitepotatocystnematode,palepotatocystnematode஺分类地位：同马铃薯金线虫。马铃萼白线虫其他信息应符合附录A的规定。6方法原理马铃萼金线虫和马铃薯白线虫的形态学特征是其检疫鉴定的主要依据.寄主范围、地理分布、生物学和生态学特征、传播途径是鉴定的辅助依据。马铃薯金线虫和马铃萼白线虫的寄主、分布、生活史和传播途径见附录A஺7仪器、用具及试剂7.1仪器、用具生物显微镜、体视显微镜、恒温箱、漂浮筒、网筛(20目、100目、500目)、酒精灯、烧杯、三角瓶(1000ml.ஹ2000ml.)ஹ竹针、0号狼毛笔、毛刷、PCR仪、离心机、微量移液器、电泳仪、凝胶成像系统等。7.2试剂酒精、丁香油、过氧化氢(40%)、中性树胶、福尔马林(40%)、冰乙酸、甘油、三乙弹胺、乳酚油、乳酸(40%)、硫酸镁、TagDNA聚合酶、dNTPஹ引物、灭菌双蒸水等。8抽样与现场检疫8.1抽样出口国和我国签订双边协定的.按双边协定的要求抽样和取样；未签订双边协定的.按SN/T2122的要求抽样和取样。8.2现场检疫检查马铃薯种萼、食用马铃薯薯块的带土情况。肉眼观察薯块基本不带土壤•则对进境的马铃薯薯块进行随机取样.带回实验室检验；肉眼观察发现薯块带有土壤.应将土壤及萼块带回实验室检验。查看带根、土的茄属植物及其他带根、土的植物繁殖材料的带土情况.收集上述植物繁殖材料和运输工具上可能携带的土壤.连同植物繁殖材料一并带回实验室检验。取样后立即置于密封塑料袋中•标记后及时送实验室。2

6S^7T1723.1—20229实验室检验9.1土壤的收集使用毛刷将马铃薯等块茎和根上的土壤刷下来.尤其注意收集芽眼等内凹表面的土壤；若马铃薯种薯等繁殖材料的带土量板小，可使用少量水将块茎粘附的少量土洗刷下来。9.2线虫的分离9.2.1Fenwick-Oostenbrink漂浮法此方法一般用于检验100ml,以上的泥土，具体的分离步骤如下：将现场采集到的土样铺于干净的浅瓷盘内.置于通风无阳光处风干.用手（或用小的圆木棍）将泥土轻轻压碎.用孔径为3mm的标准筛过筛.除去泥土中混杂的植物组织和粗砂等杂物后备用；将漂浮筒和下筛淋湿：漂浮筒内灌满清水；在上筛中放置风干的土壤样品100ml.左右.用强水流冲洗.使土样全部被淋洗至漂浮筒内；进入筒内的土粒因较重而逐渐下沉.而较轻的泡囊和一些有机杂物则陆续向上漂浮.经1min〜2min后漂浮于筒口水面之上：再由上筛加水至漂浮筒内.使漂浮于筒口的抱囊和杂物沿水槽流到下筛（100目）上面；将下筛内含抱囊的残留物冲洗至1000ml.的三角瓶内.往瓶内加清水.直至瓶口处；静置片亥k待漂浮物浮于液面时•将漂浮物倒入装有滤纸的漏斗中过滤.待滤纸晾干后即可镜检。9.2.2简易漂浮法收集的土壤在100ml.以下时可采用此方法分离抱囊。将上述泥土倒入2000ml,的三角瓶中.加少量水（可用10%的硫酸镁溶液代替水作漂浮液使用效果更佳）后至水深5cm左右充分摇晃使之呈悬浮液.然后边加水边摇动,加水直至接近瓶口处。静置片亥h待三角瓶颈部的水变清时•将三角瓶瓶口的漂浮物通过20目和100目的套筛。彻底冲洗20目筛网.使所有的抱囊被冲到10。目的筛网上。将100目筛网上的收集物轻轻地倒入装有滤纸的漏斗中过滤.待滤纸晾干后即可镜检。9.2.3直接过筛法马铃萼薯块上马铃薯抱囊线虫的分离使用该方法。将洗涤马铃薯萼块的泥水洗涤液倒入20目100目500目的三层套筛中.然后用水喷淋冲洗.使杂质留在20目的粗筛内.而他囊则会被冲到100目的网筛中.500目的网筛用于收集抱囊线虫的2龄幼虫和雄虫。将100目筛网上的抱囊和残余物冲洗入三角瓶内.一并倒入装有滤纸的漏斗中过滤.待滤纸晾干后镜检。将500目筛网上的收集物冲洗到小培养皿中镜检。9.3镜检晾干后的滤纸可在体视显微镜下检查•寻找褐色近球形泡囊，若发现泡囊.则用竹针或0号狼毛笔将其挑至凹玻片上或装有白色滤纸的小培养皿中.制作阴门锥标本.并在生物显微镜下对抱囊的阴门锥进行鉴定。抱囊的阴门锥标本制作方法按附录B的规定执行。3

7S^7T1723.1—202210形态学鉴定10.1球抱囊线虫属线虫形态学鉴定10.1.1抱囊球形.有通颈.无阴门锥.角质层厚、表面有网状花纹.有D层。阴门位于体末端.阴门区的环膜孔明显.很少有下桥和泡状突•肛门区无膜孔。所有卵都存留在体内.无卵囊.10.1.2雄虫体弯.侧线4条；交合刺长于30஻mஹ远末端尖；尾短、呈半球形。10.1.32龄幼虫侧线4条.尾圆锥形、端尖.尾后部的透明区长约占尾长的1/2.尾感器点状。10.1.4球抱囊线虫属与近似属的区别球抱囊线虫属与刻点抱囊线虫属、仙人掌抱囊线虫属、泡囊线虫属Iletero-dera的主要区别特征为抱囊的形状及肛门-阴门区域的膜孔类型（见附录C(。10.2马铃薯金线虫形态学鉴定10.2.1形态特征10.2.1.1雌虫近球形.具突出的颈.虫体球形部分的角质层具有网状脊.无侧线。口针锥部约占口针长的50%,有时略弯曲.口针基部球圆形.明显向后倾斜.口针套管从头架延伸到口针长约75%处。排泄孔明显.位于颈基部。阴门膜孔略凹陷,阴门横裂状。肛门位于阴门膜孔之外.肛门与阴门间角质层有约20个平行脊。（见附录D(10.2.1.2抱囊近球形.具突出的颈.无突出的阴门锥；新泡囊的阴门区可能是完整的.但较老的酒囊标本的部分或全部阴门膜孔丢失，形成1个单环膜孔型
singlecircularfenestra(阴门膜孔。无阴门桥、下桥及其他残存的虫体腺体结构；无泡状突.但阴门区域可能有一些小而不规则黑色素沉积物。角质层花纹与雌虫相似.无亚晶层。（见附录D(10.2.1.3雄虫蠕虫形.尾短、钝圆。热力杀死固定时•虫体弯曲.后部卷曲90°〜180°,呈“C”形或"S”形•角质膜具规则环纹.侧区4条侧线延伸至尾末端.两条外侧线具横纹但内侧线无横纹。头部圆、缢缩.具6个〜7个环纹.头骨架高度骨化。口针强壮.基部球向后倾斜.口针锥部约占口针长的45%,口针套管从头架延伸到口针长约70%处。中食道球椭圆形.中间有明显的新月形瓣门.无明显的食道-肠瓣状结构。半月体2个体环长，位于排泄孔前2个〜3个体环处,半月小体1个体环长.位于排泄孔后9个〜12个体环处。单精巢.泄殖腔开口小，具突起的唇。交合刺强壮.弓形，末端尖.引带小。（见附录D(10.2.1.42龄幼虫蠕虫形.但在卵内折叠成4折•角质层环纹清晰.侧区侧线4条.偶尔有网格化。头部圆、激缢缩.具4

8S^7T1723.1—20224个〜6个环纹。头骨架高度骨化.前、后头状体分别位于第2或第3个和第6个〜8个体环处。口针强壮.□针锥部小于口针长的50%，口针基部球略向后倾斜.食道腺叶在腹面延伸至排泄孔后约35%体长处•排泄孔位于约20%体长处.半月体2个体环长，位于排泄孔前1个体环处.半月小体小于1个体环长•位于排泄孔后5个〜6个体环处。尾部逐渐变细.直至尾端.透明尾约占尾长的1/2〜2/3。(见附录D)10.2.2测计值(Rostock种群,Stone.1973)10.2.2.1雌虫(n=25)：Stylet-(22.9+1.2),um.DG()—(5.7+0.9)gm.头部缢缩宽=(5.2+0.7).VMB-(73.2+14.6)pim,中食道球魅门至排泄孔距离=(65.2±20.2);xm,Ex.P.=(145.3±17.4),m,中食道球直径=(30.0±2.8)fxm,阴门膜孔直径=(22.4±2.8)pim,阴门裂长=(9.7±1.9)ptm,肛门至阴门盆距离一(60.0±10.1);zm,肛门至阴门间角质层脊数=(21.6±3.5)。10.2.2.2抱囊("=25)：/,(不包括颈)=(445±50)/m,体宽=(382±61)颈长一(104±19)஻m.阴门膜孔直径=(18.8+2.2)//m.肛门至阴门膜孔距离(66.5+10.3)/im,Granek比值=(3.6+0.8)„10.2.2.3雄虫(n=50)L=(l197±100),um.排泄孔处体宽=(28.1±1.7),um.头部缢缩宽=(11.8±0.6)-m,头高=(6.8±0.3)/m,Stylet=(25.8±0.9)*m,DG()=(5.3±0.9)jxm•VMB=(98.5+7.4)*m,中食道球瓣门至排泄孔距离=(73.8±9.0)*m,Ex.P.=(172.3±12.1)步m,尾长=(5.4±1,1)*m，泄殖腔处体宽=(13.5±0.4),um,Spi=(35.5+2.8)Mm.Gub-(10.3+1.5)஻m஺10.2.2.42龄幼虫("=50)：/,=(468±20.pan,排泄孔处体宽=(18.3±0.5)pim,头部缢缩宽=(9.9±0.4)-m,头高=(4.6±0.6)Mm.VMB-(69.2+1.9)Mm.Stylet=(21.8+0.7)iUm.DGO=(2.6+0.6)“m,中食道球瓣门至排泄孔距离(31.3+2.3)*m,Ex.P.=(100.5+2.4)pim,尾长—(43.9+11.6),um.肛门处体宽=(11.4±0.6),um.透明尾长=(26.5±1.8),um஺10.3马铃薯白线虫形态学鉴定10.3.1形态特征10.3.1.1雌虫虫体近球形.具突出的颈部。白色.一些群体经4周〜6周奶油色阶段.当雌虫死亡时，变成亮褐色。头部具有融合的唇和1个或2个明显的唇片。颈部环纹不规则.大多数体壁变成网纹型脊.头骨架发育弱。无侧线。口针锥部约占口针长的50%.与针杆部区别明显•□针基部球向后倾斜.口针套管从头架延伸到口针长约75%处。中食道球大.几乎球形•瓣门新月形。排泄孔明显.位于颈基部。双卵巢充满整个体腔。阴门横裂.周围角质层轻微环形凹陷.形成阴门膜孔。阴门口位于两个细的唇突状新月形区域之间。肛门与阴门膜孔间角质层约有12个平行的脊.少数交叉相连。(见附录E)10.3.1.2抱囊新抱囊亮褐色•近球形•具突出的颈。新酒囊的阴门区可能是完整的•但较老的酒囊标本的部分或5

9SN/T1723.1—2022全部阴门膜孔丢失.形成1个单环膜孔型阴门膜孔。无阴门桥、下桥及其他残存的虫体腺体结构；无泡状突.但阴门区域可能有一些小而不规则的黑色素沉积物。肛门明显。角质层花纹比雌虫更清晰.无亚晶层。(见附录E)10.3.1.3雄虫蠕虫形.尾短、末端钝圆。热力杀死呈“C”或"S”形.后部卷曲90°〜180°。角质层具明显的环纹.侧区4条侧线延伸至尾部末端.外侧线有时有横纹但内侧线无横纹。头部缢缩•具6个〜7个环纹.头骨架高度骨化。口针发育良好.口针基部球向后倾斜.口针锥部约占口针长的45%.口针套管从头架延伸到口针长约70%处。中食道球椭圆形.具有明显的新月形瓣门。食道腺核3个.背食道腺核大多数明显.食道腺延伸至排泄孔附近.约占体长的15%。半月体2个体环长.位于排泄孔后2个〜3个体环处。单精巢.泄殖腔小，泄殖腔口具小的环形唇•有2个强壮的交合刺.引带小。(见附录E)10.3.1.42龄幼虫蠕虫形.但在卵内折叠成4折。角质层环纹规则.侧区4条侧线.偶尔有完整的横纹。头部圆形.轻微缢缩.具4个〜6个环纹。口针强壮.口针基部球侧面观前表面明显向前突出.口针锥部约占口针长的50%。食道腺向后延伸至约35%体长处。排泄孔位于约20%体长处。半月体明显，2个体环长，位于排泄孔前1个体环处；半月小体位于排泄孔后5个〜6个体环处。尾部渐变细.末端细圆.透明尾约占尾长的1/2。(见附录E)10.3.2测计值(Epworth种群，Stone.1973)10.3.2.1雌虫(«=25):Stylet=(27.4+1.1)஻m.头部缢缩宽=(5.2+0.5)ptm,DGO=(5.4+1.1).VMB=(67.2士18.7)jzm,中食道球瓣门至排泄孔距离=(71.2士21.9).m,Ex.P.=(139.7±15.5).m,中食道球直径=(32.5±4.3)fxm,阴门膜孔直径=(24.8±3.7)/m,阴门裂长=(11.5士1.3)pim,肛门至阴门盆距离=(44.6±10.9)“m,阴门与肛门间角质层的脊数=(12.5±3.1)。10.3.2.2抱囊("=25)：/,(不包括颈)=(579±70),um.体宽=(534±66),um•颈长(118±20)஻m.阴门膜孔直径=(24.5±5.0)jxm,肛门至阴门膜孔距离=(49.9±13.4)஻m,Granek比值=(2.1±0.9)。10.3.2.3雄虫(«=50)/.=(1198士104)pim,排泄孔处体宽=(28.4士1.3)pim,头部缢缩宽=(12.3±0.5)Nm,头高一(6.8±0.3)Mm,Stylet=(27.5+1.0)iUm.DG()=(3.4+1.0)஻m.VMB-(96.0+7.1),um.中食道球瓣至排泄孔距离(81.0±10.9)P.-(176.4+14.5)//m.尾长=(5.2±1.4),um.泄殖腔处体宽一(13.5+2.1),um,Spi=(36.3+4.1)Mm,Gub-(11.3+1.6)஻m஺10.3.2.42龄幼虫(ti=50)：L=(486+23)pcm,排泄孔处体宽=(19.3±0.6)ptm,头部缢缩宽=(10.6±0.5)km,头高=(5.5±0.1)Mm,Stylet=(23.8+1.0)pim,DGO=(2.7±0.9)fxm,VMB=(68.7+2.7)^m.中食道球瓣至排泄孔距离=(39.9±3.3)/im.Ex.P.=(108.6+4.1),um,尾长(51.1±2.8),um,肛门处体宽一(12.l±0.4),um.透明尾长=(26.6±4.1)即。6

10S^7T1723.1—202210.4马铃薯金线虫、马铃薯白线虫与近似种的区别马铃薯金线虫、马铃薯白线虫与近似种的区别见附录F஺11分子生物学鉴定特异PCR方法具体操作步骤按附录G的规定执行。序列分析方法具体操作步骤按附录H的规定执行。12结果判定以抱囊或雌虫的形态学特征作为鉴定的主要依据，2龄幼虫和雄虫的形态学特征作为鉴定的辅助依据.符合上述形态特征和测计值的.可鉴定为目标线虫。徇囊或雌虫的形状、颜色、肛门-阴门区特征以及2龄幼虫口针长度和基部球形状是主要鉴定特征。形态学特征不足以判定时.结合分子生物学检测结果互相印证.才能做出准确的鉴定结论。13样品保存13.1样品保存样品经登记.经手人签字,妥善保存2个月。如发现马铃萼金线虫或马铃薯白线虫.该样品至少需保存6个月.以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，发现马铃薯金线虫或马铃薯白线虫的样品.需作销毁处理。13.2线虫保存截获的马铃薯金线虫或马铃薯白线虫的他囊、雌虫、雄虫和幼虫可制作成标本.永久保存。肛门-阴门区等重点形态特征拍照保存。7

11S^7T1723.1—2022附录A（资料性）马铃薯金线虫、马铃薯白线虫的其他信息A.1寄主A.1.1马铃薯金线虫寄主马铃薯金线虫的寄主范围较窄.仅马铃薯、茄子和番茄是其主要的农业寄主作物。此外.茄属的90种植物是其寄主.包括与马铃薯近缘的植物及具有不同抗性水平的Solanuintuberosumsubsp.andi-gena»S.vernei和S.。在欧洲，某些野生杂草如S.sarachoides»S.dulcamara及曼陀罗可延续马铃薯金线虫的种群。A.1.2马铃薯白线虫寄主马铃萼白线虫的寄主范围较窄,最主要的农业寄主作物有马铃薯、茄子和番茄。A.2分布A.2.1马铃薯金线虫分布欧洲：阿尔巴尼亚、亚美尼亚、奥地利、白俄罗斯、比利时、波黑、保加利亚、克罗地亚、塞浦路斯、捷克、丹麦、爱沙尼亚、法罗群岛、芬兰、法国、格鲁吉亚、德国、希腊（克里特岛）、匈牙利、冰岛、爱尔兰、意大利（西西里）、拉脱维亚、列支敦士登、立陶宛、卢森堡、马耳他、荷兰、挪威、波兰、葡萄牙（亚速尔、马德拉群岛）、罗马尼亚、俄罗斯（俄罗斯中部、西伯利亚东部、远东地区、俄罗斯北部、俄罗斯南部、俄罗斯西部）、塞尔维亚、斯洛伐克、斯洛文尼亚、西班牙（巴利阿里群岛、加那利群岛）、瑞典、瑞士、土耳其、乌克兰、英国（海峡群岛、英格兰、北爱尔兰、苏格兰）。亚洲：印度（喀拉拉邦、泰米尔纳德邦）、印度尼西亚（爪哇）、伊朗、日本（北海道、九州岛）、黎巴嫩、阿曼、巴基斯坦、菲律宾、斯里兰卡、塔吉克斯坦、中国（四川、贵州、云南）。非洲：阿尔及利亚、埃及、肯尼亚、利比亚、卢旺达、塞拉利昂、南非、突尼斯。大洋洲：澳大利亚（维多利亚）、新西兰、诺福克岛。北美洲：加拿大（亚伯达、不列颠哥伦比亚、纽芬兰、魁北克）、墨西哥、美国［纽约、特拉华（已根除），中南美洲：智利、哥伦比亚、厄瓜多尔、玻利维亚、巴拿马、秘鲁、委内瑞拉。A.2.2马铃薯白线虫分布欧洲：奥地利、比利时、波黑、保加利亚、克罗地亚、塞浦路斯、捷克、丹麦、爱沙尼亚、法罗群岛、芬兰、法国、德国、希腊（克里特岛）、匈牙利、冰岛、爱尔兰、意大利、卢森堡、马耳他、荷兰、挪威、葡萄牙（马德拉群岛）、罗马尼亚、塞尔维亚、斯洛文尼亚（已根除）、西班牙（巴利阿里群岛、加那利群岛）、瑞典、瑞士、土耳其、英国（海峡群岛、英格兰、北爱尔兰、苏格兰）。亚洲：印度（喀拉拉邦、泰米尔纳德邦）、日本（北海道）、巴基斯坦。非洲：阿尔及利亚、肯尼亚、突尼斯、摩洛哥.大洋洲：新西兰。北美洲：加拿大（纽芬兰）、美国（爱达荷州）。中南美洲：阿根廷、玻利维亚、智利、哥伦比亚、哥斯达黎加、厄瓜多尔、马尔维纳斯群岛、巴拿马、秘鲁、委内瑞拉。8

12S^7T1723.1—2022A.3侵染循环和生活史马铃薯金线虫和白线虫是固定性内寄生线虫。以糅质的抱囊在土壤内越冬、滞育及度过不良环境.抱囊内通常含有大量的卵。在生长季节•温、湿度适宜条件下.在寄主根部分泌物的刺激下•卵壳脂蛋白膜的渗透性发生变化从而打破卵的滞育情况.刺激卵孵化。感病和抗病品种中的根渗物具有相似的刺激孵化作用效果。孵化的二龄幼虫从寄主植物根尖附近及新侧根侵入.进入植物根内并移动寻找适合取食位点.成为固定性取食.并在中柱鞘、皮层或内皮层细胞上取食。幼虫注射腺体分泌物并诱导头部周围寄主细胞增大.融合形成合胞体转移细胞。合胞体提供线虫发育所需的营养.此后幼虫在此营固定性内寄生生活。合胞体内的细胞质变浓密.呈颗粒状.其细胞壁向内生长.临近的输导组织内表面增加.使得营养源源不断地从植物其他组织传递到合胞体。幼虫持续不断地从合胞体细胞获取营养直至完成发育.2龄幼虫经第2次蜕皮后变成3龄幼虫.此时开始出现性别分化称之为3龄雌性幼虫和3龄雄性幼虫：再经第3次蜕皮成4龄雌性幼虫和4龄雄性幼虫。4龄雄性幼虫卷曲在第3次蜕皮的角质层内.再经第4次蜕皮变成雄成虫.离开植株进入土内.与雌成虫交配数次.此时雄成虫不再取食.但可在土壤内存活10d左右。4龄雌性幼虫虫体呈腊肠状.经第4次蜕皮后变成雌成虫。雌成虫的后端不断膨大.撑破根表皮露出根外•仅头和颈部固着于根内。雌成虫释放性激素吸引雄成虫交配、受精.卵在雌成虫体内发育。雌虫显露于根表时呈白色（马铃薯金线虫不久变为金黄色.经4周〜6周进入金黄色阶段），在雌虫完全成熟时.其表皮变硬、呈褐色从而成为保护壳.这就是抱囊.内含大量的卵。当马铃薯收获后.抱囊从根表面脱落掉入士中.其内的卵休眠成为下一季作物的初侵染源；鞋质的泡囊壁粗糙而且厚•比较坚硬•保护内部的卵•使得该线虫在土壤内越冬、滞育及度过不良环境。在无寄主茄属植物存在的情况下.抱囊可在土壤中存活多年并仍有侵染能力。A.4传播途径马铃薯金线虫以2龄幼虫在土壤内作质距离的移动.农事操作、农具和交通工具可将农田中的土壤带走.从而近距离传播马铃萼金线虫；马铃萼种薯、苗木、花卉鳞球茎、消费或加工用马铃薯块茎上沾附的土壤可将马铃薯金线虫的抱囊传播到新的马铃薯生产地区。因此.抱囊传播是马铃薯金线虫远距离传播的主要途径。马铃萼白线虫传播途径同马铃薯金线虫。A.5症状马铃薯金线虫和白线虫危害寄主植物根系。由于根系受害.植株对水分和营养物质的吸收能力降低，地上部表现矮化、叶小而黄.嫩叶凋萎.受害重的植株则叶片全部枯死,植株早死。地下根系小.发育不良.结薯小而少。在马铃薯开花期.取植株根系.仔细观察受害植株的根部可见到大量的小突起.即病原线虫的雌虫和酒囊.成熟的马铃薯金线虫雌虫呈金黄色•马铃薯白线虫雌虫呈白色；此后逐步变成深褐色抱囊（见图A.1、图A.2(஺马铃薯收获后.根系泡囊遗落到土壤中。9

13SN/T1723.1—2022注：图片来自https：/；www.forestryimages,org/browse,detail.cfm?imgnum=21310776图A.1马铃薯白线虫注：图片来自https//gd.eppo.int/taxon/HETDRO/photos0图A.2马铃薯金线虫10

14S^7T1723.1—2022附录B（资料性）抱囊线虫阴门锥标本的制作将分离到的泡囊在乳酚油或清水中浸泡24h；在塑料载玻片一侧的水滴中放置已浸泡过的抱囊.于体视显微镜下用解剖刀切下泡囊的后端（阴门锥及其边缘）部分；用竹针或0号狼毛笔轻轻剔除阴门锥内的沾附物和卵：用40%的过氧化氢漂白几分钟（本步骤适用于厚壁或深色的胞囊.操作时应细心观察•以免漂白过度）后•用解剖刀适当修整阴门锥的边缘；将修整后的阴门锥移至塑料载玻片的另一侧・先用无菌水冲洗已净化了的阴门锥•然后再依次通过70%、95%和100%的酒精和丁香油处理.使之脱水和透明；在凹穴载玻片的凹穴内加一滴中性树胶.稍微涂平后将处理好的阴门锥（3枚〜4枚）埋人该薄层树胶内（注意用竹针将阴门锥扶正.使其外表面向上）；待凹穴载玻片中的树胶干固后.再在其四周加适量的中性树胶•盖上盖玻片（加进去树胶的量以在加盖盖玻片后树胶正好铺满盖玻片下面所占的空间为宜）。11

15S^7T1723.1—2022附录C（资料性）球抱囊线虫属与近似属的区别C.1异皮线虫亚科抱囊分类检索表1.柠檬形泡囊..........................................................非球抱囊线虫属球形抱囊...........................................................................22.抱囊尾部具2个大的、分开的、大小相似的膜孔........................非球抱囊线虫属抱囊尾部具1个大的阴门膜孔............................................球泡囊线虫属注：引自PM7/40(4)GloboderaroslochiensisandGloboderapallida«C.2异皮线虫亚科胞囊的形状及肛门阴门区特征异皮线虫亚科抱囊的形状及肛门-阴门区特征见图C.1〜图C.3஺bed。得9wo/wVulva说明：1—球形〈球抱囊线虫属）；2—卵形（刻点抱囊线虫属）；3—柠檬形，有简化的阴门锥（部分抱囊线虫属，仙人掌抱囊线虫属）；4—柠檬形，有突出的阴门锥（大多数抱囊线虫属）；a—肛门区域形成膜孔；阴门区域形成膜孔，阴门膜孔环形（刻点抱囊线虫属）；b—肛门区域不形成膜孔；阴门区域形成膜孔，阴门膜孔环形〈球抱囊线虫属，仙人掌抱囊线虫属）；c—肛门区域不形成膜孔；阴门区域形成双膜孔，膜孔大于半圆（抱囊线虫属）；d—肛门区域不形成膜孔；阴门区域形成双膜孔，膜孔小于半圆（抱囊线虫属建注：引自PM7/40（4）GloboderaroslochiensisandGloboderapallida图C.1孑包囊的形状及肛门-阴门区的膜孔类型12

16SN/T1723.1—2022a(球殉囊线虫属b(胞囊线虫属c(刻点抱囊线虫属注1:标尺=350ptms注2：引自PM7.40（4）GloboderarostochiensisandGloboderapallida图C.2异皮线虫亚科不同形状的抱囊a(球泡囊线虫属b(刻点抱囊线虫属注1：a(为阴门区形成膜孔，肛门区不形成膜孔；b(为阴门区形成膜孔，肛门区形成膜孔.注2：绿色箭头指示阴门区，黑色箭头指示肛门区。注3：引自PM7.40（4）GloboderarostochiensisandGloboderapallida图C.3肛门-阴门区膜孔示意13

17SN/T1723.1—2022附录D（资料性）马铃薯金线虫的形态特征图说明：A—2龄幼虫整体：B—2龄幼虫头部区域；C—2龄幼虫中部侧区；D—2龄幼虫食道区域；E—雄虫食道区域；F—雄虫尾部：G-----雄虫虫体中部侧区：H-----抱囊；I-----雌虫头部和颈部；J—雄虫整体。注：引自Stone,1973o图I).1马铃薯金线虫(G/o8oderarostochiensis)14

18附录E（资料性）马铃薯白线虫的形态特征图说明：A—雌虫前端颈部区域;G—2龄幼虫头部：O—雄虫尾区腹面观；B雌虫头部；H2龄幼虫尾部；P雄虫尾部侧面观；C—雌虫头部顶面观；IJ—2龄幼虫头部顶面观;Q-----雄虫虫体中部侧区;D雌虫整体；KஹL2龄幼虫侧区；RஹS雄虫头部顶面观；E—2龄幼虫整体；M-----雄虫前端；T—雄虫整体。F2龄幼虫前端；N雄虫头部；注：引白Slone,1972,图E.1马铃薯白线虫G/o力oderapallida）

19S^7T1723.1—2022附录F(资料性)马铃薯金线虫、马铃薯白线虫与近似种区别F.1球抱囊线虫属分种检索表1.抱囊角质层薄、透明............................................................G.mali抱囊角质层厚、颜色深...............................................................22.2龄幼虫口针平均长度《26,um.................................................................................................................32龄幼虫口针平均长度＞26iim...................................................................................................................43.2龄幼虫口针平均长度＜19,um......................................................................................G.leptonepia2龄幼虫口针平均长度＞19,um..............................................................................................................54.2龄幼虫唇区4个唇环...................................................G.zelandica2龄幼虫唇区3个唇环................................................G.sandveldensis5.2龄幼虫透明尾长＞31,um....................................................................................................G.bravoae2龄幼虫透明尾长431,um.......................................................................................................................66.Granek比值平均值通常＞2,大多寄生于茄科植物....................................7Granek比值平均值42,大多寄生于菊科植物............................................127.形态特征同时符合：2龄幼虫DGO平均值＞5.5Granek比值平均值＜3;2龄幼虫唇区有4个〜6个唇环.□针基部球圆形至轻微向前突出......................................8上述所有特征不同时符合；2龄幼虫DG஺平均值T5.5,um.............................................................98.抱囊壁不具有网状的花纹.脊紧密；肛门和阴门盆之间角质层脊10个〜18个.平均13个；雄虫交合刺末端尖、刺状.................................................G.ellingtonae抱囊壁具有网状的或复杂迷宫状图案：肛门和阴门盆之间角质层脊5个〜15个,平均7个〜8个；雄虫交合刺末端圆.......................................................G.tabacum9.抱囊的末端区域大多具有泡状突；2龄幼虫唇区有3个唇环.透明尾平均长＞282m.........................................................................................................................................................................G.capensis抱囊无泡状突•最多少数种类具有小的阴门体：2龄幼虫唇区有4个〜6个唇环.透明尾平均长＜28Mm...........................................................................................................................................................1010.2龄幼虫□针基部球前表面向前突出至前表面较平；2龄幼虫口针平均长＞23//mGranek比值＜3.......................................................................................................................................................112龄幼虫□针基部球圆形至略向后倾斜；2龄幼虫口针平均长＜23Granek比值23……..................................................................................................................................................G.rostochiensis11.Granek比值平均=2.1〜2.5...........................................................................................G.pallidaGranek比值平均=2.8.........................................................................................................G.mexicana12.2龄幼虫唇区5个〜6个唇环........................................................132龄幼虫唇区3个唇环...............................................................1413.2龄幼虫口针平均长＞25pim,雄虫引带长=11.2/m〜12.9.m........................G.miUefolii2龄幼虫口针平均长V25ptm.雄虫引带长=6.0rtd〜9.9ptm..............................G.artemisiae14.抱囊有泡状突............................................................G.capensis抱囊无泡状突........................................................G.agulhasensis注:参考PM7.40(4)GloboderarostochiensisandGloboderapallidao16

20S^7T1723.1—2022F.2马铃薯金线虫、马铃薯白线虫与近似种的区别马铃薯金线虫、马铃薯白线虫与近似种的区别见表F.1和图F.1〜图F.2஺表F.1马铃薯金线虫、马铃薯白线虫与近似种的形态特征及测计值2龄幼虫抱囊口针基部球种名体长口针基部球口针长度肛门阴门之间宽度Granek比值形状/xm角质层脊数马铃薯金线虫圆至略向后468(423〜305)3〜421.8(19〜23)16—31(>14)1.3—9.503)G.rostochiensis倾斜马铃薯白线虫484(440〜325)4〜5明显向前突出23.8(22〜24)8—20«14)1.2~3.5«3)G.pallida烟草抱囊线虫圆至稍向前477(410〜327)4〜524(22〜26)5-15«10)1〜4.2CV2.8)G.labacum突出蓍草抱囊线虫492(472〜515)4〜5圆至向前突出25(24〜26)4—11«10)1.6(1.3〜1.9)G.miliefolii艾蒿球抱囊线虫圆至略向后413(357—490)3〜523(18〜29)5-16«10)1.0(0.8-1.7)G.arlemisiae倾斜注：弓I自PM7/40(4)GloboderarostochiensisandGloboderapallidaaG.rostochiensis(i.{MilIida(i.achilleae(i.tabacuni注：引自PM7/40(4)GloboderarostochiensisandGloboderapallida图F.1马铃薯金线虫、马铃薯白线虫与近似种的肛门-阴门区（示角质层脊数）17

21SN/T1723.1—2022(i.roxiochiensixG.palhdaG.achilleae(i.tubucum注：弓I自PM7/40(4)G/o6oJeraroslochiensisandGlobuderapallida6图F.2马铃薯金线虫、马铃薯白线虫与近似种的2龄幼虫口针18

22S^7T1723.1—2022附录G（资料性）特异PCR方法G.1引物序列引物序列见表G.1。表G.1引物序列线虫种类引物名称引物序列5'-3'扩增产物参考文献上游引物ITS5GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG马铃薯金线虫434bp下游引物PITSr3AGCGCAGACATGCCGCAABulman&Marshall?1997上游引物ITS5GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG马铃薯白线虫265bp下游引物PITSp4ACAACAGCAATCGTCGAGG.2DNA提取使用商用DNA提取试剂盒.按照说明书操作.提取球抱囊线虫属的成虫或幼虫.甚至是单条线虫的D\A.对他囊也适用；也可使用实验室成熟稳定的D\A提取方法。G.3PCR检测反应体系（25pL(：10XPCRBuffer+Mg2-free(2.5fxL.25mmol/LMgCl22L,2.5mmol/LdNTPMix2".10fxmol/L引物各0.55U/jzLTaqDNA聚合酶0.4模板DNA2piL,ddH2+(补足。反应程序94࠷3min;94࠷30s,60࠷30s,72࠷45s,35个循环；72࠷5min஺扩增产物在L5%琼脂糖凝胶1XTAE缓冲液中电泳.EB或核酸染料染色后用凝胶成像系统分析。G.4结果判定PCR扩增产物检测.在阴性对照和空白对照没有产生预期大小条带、阳性对照产生预期大小条带（见表G.1）情况下.待检样品如出现与阳性对照大小一致的条带.则该样品检测结果为阳性；如果检测样品未出现与阳性对照大小一致的条带.则该样品检测结果为阴性。对形态学观察符合球抱囊线虫属特征的线虫.经马铃薯金线虫特异PCR检测为阳性.形态学特征相符可判定为马铃萼金线虫；经马铃薯白线虫特异PCR检测为阳性.因烟草泡囊线虫有交叉反应,应结合形态学特征.排除烟草抱囊线虫可能后.可判定为马铃薯白线虫。需注意：因上述引物对球抱囊线虫属不是特异的（异皮线虫亚科含卵或幼虫的其他属抱囊可能会观察到交叉反应）•故本方法仅用来初步测试已被鉴定是球泡囊线虫属的线虫。19

23S^7T1723.1—2022附录H(资料性)序列分析方法II.1引物序列通用引物序列见表H.1。表H.1引物序列扩增区域引物名称引物序列5'-3'扩增产物参考文献上游引物D2AACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG28srRNA-D2D3782bp〜784bpDeLeyelal,1999下游引物D3BTCGGAAGGAACCAGCTACTA上游引物F194CGTAACAAGGTAGCTGTAGFerriselal,1993rDNA-ITS1040bp〜1043bp下游引物5368rTTTCACTCGCCGTTACTAAGGVrain?1993II.2DNA提取见附录G.2。II.3PCR检测反应体系(254.)：见附录G.3中的反应体系。反应程序：94℃3min94℃30s,55℃30s,72࠷90s,40个循环；72℃10min஺扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶1XTAE缓冲液中电泳.EB或核酸染料染色后用凝胶成像系统分析。PCR产物送往测序公司进行双向直接测序.直接测序结果不好时可选择克隆测序。II.4序列分析用Mega或ChromasPro等软件,分别对测序得到的峰图文件进行比对、拼接.去除引物区.获得相应的DNA序列。为确保D\A条形码序列的可靠性.需对测序质量进行评估.去除测序结果两端的低质量序列.序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。登录NCBI网站中的BLAST(basiclocalalignmentsearchtool)页面(https:〃blast,ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对。在BasicBLAST中选择nucleotideblast.在EnterQuerySequence中粘贴需要鉴定的序列，点击左下角BLAST஺查看待测线虫序列与其他已知序列的相似性.可进一步在网站中下载已登录的近似种的部分序列.并使用MEGA或其他系统发育分析软件构建系统发育树。H.5结果判定在BLAST结果中查看序列相似性最高(maxident)的物种.一般为与查询序列最接近的物种，若BLAST比对结果显示.待测线虫序列与已知的某种线虫序列相似性达98%〜99%以上.而与其他近似种的相似性更低.则待测线虫很可能是该种线虫.应结合形态特征进一步判定,形态学特征相符可判20

24S^7T1723.1—2022定为目标线虫。如BLAST比对结果显示与多种不同种线虫的相似性都比较低或者都比较高.则难以直接判断具体物种.相似性比较高的应进一步结合系统发育树综合判断。根据待测序列与已知序列在系统发育树上的位置确定其分类地位。若系统发育树显示待测线虫与已知所有某种线虫均聚集在同一进化分支♦基本可判定该种线虫为目标线虫•进一步应结合形态学特征进行判定。21

25SN/T1723.1—2022参考文献[1]EPPOPM7/40(4)GlohoderarostochiensisandGloboderapallida.[2]SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法.[3]谢辉.植物线虫分类学(第二版)[M].北京：高等教育出版社,2005：236-242.[4]BulmanSR&MarshallJW.DifferentiationofAustralasianpotatocystnematode(PCN)populationsusingthepolymerasechainreaction(PCR)J].NewZealandJournalofCropandHorti9culturalScience,1997,25,123-129.[5]DeLeyP.FelixMA,FrisseLM,etal.Molecularandmorphologicalcharacterizationoftworeproductivelyisolatedspecieswithmirror-imageanatomy(NematodaCephalobidae),J].Nema9tology,1999,1(6)591-612.[6]FerrisVR.FerrisJM,FaghihiJ.VariationinspacerribosomalDNAinsomecyst-formingspeciesofplantparasiticnernatodes[Jl,FundamentalandAppliedNematology.1993,16(2)!77-184.[7]StoneAR.lleteroderapallidan.sp.(NematodaHeteroderidae)asecondspeciesofpo9tatocystnematode[J].Nematologica,1972,18,591-606.[8]StoneAR.C.I.IIDescriptionsofPlant-ParasiticNematodesfM],LondonCABInterna9tional,1973(2),16.[9]SiddiqiMR.TylenchidaParasitesofPlantsandInsects»2ndEdition,M[.()xonCABIPub9lishing,2000406-408.10]VrainTC.RestrictionfragmentlengthpolymorphismseparatesspeciesoftheXiphinemaamericanumgroup[J].JournalofNematology,1993,25:361-364.[11]KnoetzeRSwartA,WentzelR.etal.DescriptionofGloboderaagulhasensisn.sp.(NematodaHeteroderidae)fromSouthAfrica[J].Nematology,2017.19(3):1-18.[12]KnoetzeR.SwartA.WentzelR,etal.DescriptionofGloboderasandveldensisn.sp.(NematodaHeteroderidae)fromSouthAfrica[J].Nematology,2017.19805-816.Cl3]https//gd.eppo.int.[14]https//www.cabi.org.22

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27中华人民共和国出入境检验检疫行业标准马铃薯金线虫和马铃薯白线虫检疫鉴定方法SN/T1723.1—2022*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023)编辑部：(010)65194242-7530网址www.customskb.com/book中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880X12301/16印张1.75字数49千字2023年1月第一版2023年1月第一次印刷印数1—£00*书号：1351759U定价28.00元