T∕CVDA 3-2022 动物埃博拉病毒中和抗体检测技术

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ICS11.220B41T/CVDA团体标准T/CVDA3—2022动物埃博拉病毒中和抗体检测技术DetectingtechniqueofneutralizationantibodyagainstEbolavirusinanimals2022-07-19发布2022-07-25实施中国兽药协会发布I

1目录前言............................................................................................................................................................III1范围..........................................................................................................................................................42规范性引用文件......................................................................................................................................43缩略语......................................................................................................................................................44试剂和材料..............................................................................................................................................45器材和设备..............................................................................................................................................56动物血清..................................................................................................................................................56.1安全防护...............................................................................................................................................56.2血清采集...............................................................................................................................................57PRNT实验操作........................................................................................................................................57.1安全防护...............................................................................................................................................57.2材料准备...............................................................................................................................................57.2.3细胞....................................................................................................................................................67.2.4血清灭活............................................................................................................................................67.3检测操作...............................................................................................................................................67.3.1对照设置............................................................................................................................................67.3.3病毒与血清中和................................................................................................................................67.3.4接种细胞............................................................................................................................................68结果观察与判定......................................................................................................................................78.1观察顺序...............................................................................................................................................78.2荧光观察结果判定...............................................................................................................................78.2.2结果判定与效价计算........................................................................................................................7附录A..........................................................................................................................................................8A.1磷酸盐缓冲液（PBS）.......................................................................................................................8A.2含10%胎牛血清的DMEM培养液...................................................................................................8A.3含2%胎牛血清的DMEM培养液.....................................................................................................8A.4细胞分散液..........................................................................................................................................8附录B..........................................................................................................................................................9B.1材料和试剂..........................................................................................................................................9B.2方法......................................................................................................................................................9B.2.1嵌合EBOVGP蛋白重组水泡性口炎病毒的构建与拯救.............................................................9B.2.2重组病毒的传代.............................................................................................................................10B.2.3重组病毒鉴定.................................................................................................................................10B.2.4重组病毒的毒价测定.....................................................................................................................10II

2前言本标准参照GB/T1.1-2020给出的规则起草。本标准中国兽药协会提出并归口管理，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所起草。本标准主要起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、东北林业大学、哈尔滨国生生物科技股份有限公司。本标准主要起草人：步志高、王翀、温志远、葛金英、柴洪亮、刘霄磊。本标准为首次发布。III

3动物埃博拉病毒中和抗体检测技术1范围本标准规定了用于动物埃博拉病毒血清中和抗体测定果判定标准。本标准适用于动物血清中埃博拉病毒中和抗体的定性检测和定量测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T66822008分析实验室用水规格和试验方法GB194892008实验室生物安全通用要求GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则3缩略语下列缩略语适用于本文件。EBOV：埃博拉病毒（Ebolavirus）；VeroE6：非洲绿猴肾细胞（Africangreenmonkeykidneycell）；VSVΔG-EBOVGP-EGFP：表达绿色荧光蛋白的埃博拉病毒糖蛋白GP嵌合水泡性口炎病毒；TCID50：半数组织培养感染量（TissueCultureInfectiveDose）；PRNT：噬斑减少中和试验（plaque-reductionneutralizationtest）；BSL-2：生物安全2级实验室（BiosafetyLaboratoryLevel-2）；BSL-4：生物安全4级实验室（BiosafetyLaboratoryLevel-4）；DMEM：Dulbecco改良的Eagle培养基（Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium）；PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate-BufferedSaline）；FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）。4试剂和材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.1水：GB/T6682-2008，二级水。4.2埃博拉病毒阴性小鼠血清，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所制备、鉴定并保存。。4.3埃博拉病毒阳性小鼠血清，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所制备、鉴定并保存。。4.4磷酸盐缓冲液（PBS）（见A.1）。4.5含10%FBS的DMEM培养基（见A.2）。4.6含2%FBS的DMEM培养基（见A.3）。4.7VeroE6细胞。4.8VSVΔG-EBOVGP-EGFP病毒。4.9胎牛血清（FBS）。4

44.10细胞分散液（0.25%胰酶）（见A.4）。4.11青-链霉素溶液。5器材和设备5.1移液器，50μl~300μl（±2%）。5.296孔细胞培养板。5.337℃5%二氧化碳培养箱。5.4倒置显微镜。5.5普通冰箱和超低温冰箱。5.6细胞计数器。5.720μL~200μL吸头。5.8BSL-2级生物安全柜。5.9倒置荧光显微镜。6动物血清6.1安全防护进行血液样本采集的人员应采取佩戴口罩、手套，着长袖工作服等防护措施。6.2血清采集无菌采集动物血液，室温或37℃静置60min。4℃放置1h至过夜后，1000r/min离心5min，收集上清，-20℃以下保存待检。样品采集应详细记录动物品系、年龄、免疫史、时间、地点、主人姓名与联系方式等信息。7PRNT实验操作7.1安全防护本检测应在满足GB19489-2008的BSL-2级生物安全实验室内进行。进行本检测的人员应采取佩戴口罩、手套，着长袖工作服等防护措施。7.2材料准备7.2.1病毒繁殖将VSVΔG-EBOVGP-EGFP接种于VeroE6单层细胞，37℃吸附1h后，不弃去吸附液，加入维持液，置5%二氧化碳（CO2）培养箱培养，逐日观察。培养48h或待绿色荧光密度达90%以上，收获病毒上清，分装成1mL/瓶，置-70℃保存备用。7.2.2毒价测定5

5-1-87.2.2.1将病毒在96孔板上做10~10稀释，每个稀释度作8孔，每孔加入病毒悬液50μL，5加入细胞悬液100μL（每毫升含3×10个细胞），每块96孔板设8孔细胞对照。7.2.2.2置5%CO2培养箱37℃培养，48h后观察绿色荧光并记录。7.2.2.3按Reed-Muench法计算病毒的毒价（TCID50/mL）。7.2.3细胞按常规方法用含10%FBS的DMEM培养液培养VeroE6细胞，1个T75细胞培养瓶（含415mL细胞培养液）培养细胞48h后，可以用于4块96孔（每孔细胞数约为3×10细胞/孔）细胞培养板的检测。7.2.4血清灭活阳性血清、阴性血清、待测血清在56℃下30min灭活补体。灭活时，将血清样本放在56℃恒温水浴箱内，水面要高于血清液面，但不要超过样品管高度。7.3检测操作7.3.1对照设置5——细胞对照：设4孔正常细胞对照，即每孔加细胞悬液100μL（每毫升含3×10个细胞）。——阴性血清对照：设4孔阴性对照，每孔加阴性血清和100TCID50/50μL病毒悬液各550μL，再加入细胞悬液100μL（每毫升含3×10个细胞）。——病毒回归对照：将病毒用含2%FBS的DMEM培养液稀释成100、10、1、0.1TCID50/50μL，每个稀释度作4孔，每孔加入50μL病毒悬液，每孔补充含2%FBS5的DMEM培养基50μL，再加入细胞悬液100μL（每毫升含3×10个细胞）。——阳性对照血清：将阳性血清作1:4、1:8、1：16、1：32、1：64稀释，每个稀释度作4孔，每孔加各稀释度阳性血清和100TCID50/50μL病毒悬液各50μL，再加入5细胞悬液100μL（每毫升含3×10个细胞）。——血清毒性对照：每份被检血清应按稀释度各设1孔毒性对照，每孔加各稀释度血清50μL、含2%FBS的DMEM培养基50μL和细胞悬液100μL。7.3.2血清稀释将每份被检血清从1:4开始连续做2倍倍比稀释，直到1：4096。每个稀释度作6个孔，每孔加各稀释度血清50μL。7.3.3病毒与血清中和5第1孔作为血清毒性对照，加入稀释液50μL和细胞悬液100μL（每毫升含3×10个细胞）。第2孔~第6孔为正式试验孔，每孔加入病毒悬液50μL（100TCID50/50μL），震荡3min~5min，置37℃中和60min（不超过90min）。7.3.4接种细胞6

67.3.4.1将培养48h的VeroE6细胞用PBS淋洗一次，弃去PBS后再用胰酶-EDTA液消化细胞，待细胞圆缩且部分脱落时，加入培养液吹打分散细胞。57.3.4.2分散均匀的细胞进行细胞计数，用培养液将细胞稀释至每毫升含3×10个细胞。7.3.4.3每个检测批次除了需要待测血清样品测定板若干以外，还需设阳性血清对照板孔和阴性血清对照板孔各4孔。57.3.4.4向7.3.3中病毒与血清中和的试验孔中加细胞悬液100μL（每毫升含3×10个细胞）。7.3.4.5置5%CO2培养箱37℃培养。7.3.4.6培养48h后观察绿色荧光信号并记录。8结果观察与判定8.1观察顺序按病毒对照孔、血清对照孔、待测血清孔顺序观察。8.2荧光观察结果判定8.2.1试验成立条件在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白荧光灶，观察每孔所有视野，当病毒回归对照100、10、1TCID50/50μL全部出现绿色荧光信号，0.1TCID50/50μL无绿色荧光信号，阳性血清对照、阴性血清对照、正常细胞对照、血清毒性对照全部成立时，方可进行判定，判定时间为细胞培养48h后。8.2.2结果判定与效价计算当病毒回归对照100、10、1TCID50/50μL全部出现绿色荧光信号，0.1TCID50/50μL无绿色荧光信号，阳性血清对照、阴性血清对照、正常细胞对照、血清毒性对照全部成立时，方可进行判定。判定时间为细胞培养48h。细胞孔无表达绿色荧光判为中和阳性，表达绿色荧光判为中和阴性。记录被检血清每个稀释度对应细胞孔的阴性和阳性孔数，按照Reed-Muench方法计算出血清的中和抗体滴度，当中和抗体滴度≥3.5log2时判为血清中和抗体阳性。7

7附录A（规范性附录）溶液配制A.1磷酸盐缓冲液（PBS）称取氯化钠85.00g、磷酸氢二钠15.49g、磷酸二氢钠2.03g，加去离子水溶解，定容至10L，以2mol/L氢氧化钠溶液调至pH7.4。高压灭菌后室温保存。A.2含10%胎牛血清的DMEM培养液无菌量取DMEM培养基445mL，加入胎牛血清50mL、青-链霉素溶液5mL。4℃保存。A.3含2%胎牛血清的DMEM培养液无菌量取DMEM培养基485mL，加入胎牛血清10mL、青-链霉素溶液5mL。4℃保存。A.4细胞分散液胰酶2.5g乙二胺四乙酸二钠（EDTA）0.2g无钙镁PBS1000mL过滤除菌。8

8附录B（资料性附录）VSVΔG-EBOVGP-EGFP病毒的构建、拯救与鉴定B.1材料和试剂B.1.1病毒株水泡性口炎病毒（VesicularStomatitisVirus，VSV）反向遗传操作系统由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所重要人兽共患病与烈性外来病实验室建立，相关质粒由该实验室保存。B.1.2细胞与质粒HEK293细胞、VeroE6细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所重要人兽共患病与烈性外来病创新团队保存、培养。细胞培养液为含10%胎牛血清的DMEM。表达绿色荧光蛋白的重组VSV全基因组克隆质粒pCI-VSVFL-EGFP及辅助质粒pCI-N、pCI-P、pCI-L由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所重要人兽共患病与烈性外来病创新团队构建、保存。选择EBOV西非流行株Makona株（GeneBank:KP178538.1）的GP的基因序列并按照哺乳动物密码子偏噬性对GP蛋白进行人工密码子优化并合成，同时在起始密码ATG前分别引入VSV基因起始、终止及Kozak序列。B.1.3试剂VSV全基因组克隆质粒pCI-VSVFL及辅助质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所重要人兽共患病与烈性外来病创新团队构建、保存。高保真DNA聚合酶（PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase）、快速克隆试剂盒（ClonExpressUltraOneStepCloningKit）购自南京诺维赞生物科技股份有限公司。X-tremeGENE™9DNA转染试剂购自Merck公司。抗EBOVGP蛋白单克隆抗体由购自北京义翘神州科技股份有限公司。罗丹明（TRITC）标记的山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。胎牛血清购自赛默飞世尔科技有限公司。DMEM培养液购自西格玛奥德里奇贸易有限公司。B.2方法B.2.1嵌合EBOVGP蛋白重组水泡性口炎病毒的构建与拯救在质粒pCI-VSVFL-EGFP的基础上，用NheⅠ限制性内切酶线性化该质粒，并进行胶回收。根据EBOVGP基因序列及线性化pCI-VSVFL-EGFP质粒序列设计同源重组引物。基于该同源重组引物，利用PCR技术扩增EBOVGP基因，并进行胶回收。利用一步法快速克隆试剂盒，将上述扩增获得的EBOVGP基因克隆至线性化质粒pCI-VSVFL-EGFP中，获得重组质粒pCI-VSVΔG-EBOVGP-EGFP。将HEK293细胞铺于六孔细胞板中，置于5%CO2、37℃培养箱中培养。待细胞板孔中细胞密度至80%-90%时，采用脂质体转染法，将重组质粒pCI-VSVΔG-EBOVGP-EGFP及9

9辅助质粒pCI-N、pCI-P、pCI-L共转染至该细胞，转染后48h更换新鲜培养液。利用荧光倒置显微镜，每日观察转染细胞中绿色荧光基因的表达情况，并收获绿色荧光灶密度达50%的转染孔细胞上清，经分装后-70℃冻存，重组病毒命名为VSVΔG-EBOVGP-EGFP，重组病毒为F1代。B.2.2重组病毒的传代5将对数生长期的VeroE6细胞（3×10个/mL）铺于6孔细胞板中，置于5%CO2、37℃培养箱中培养。待细胞长至单层且铺满孔底时，将10倍稀释的重组病毒VSVΔG-EBOVGP-EGFP接种于板孔中，以含有2%FBS的DMEM培养基为生长培养基。每日观察接毒孔细胞的荧光表达情况，当绿色荧光灶密度达90%时，收获细胞上清。B.2.3重组病毒鉴定取重组病毒VSVΔG-EBOVGP-EGFP，提取总RNA进行RT-PCR鉴定。目的片段长度为2100bp，PCR片段序列应与目的序列一致。用重组病毒VSVΔG-EBOVGP-EGFP（MOI=0.01）感染过夜培养的VeroE6细胞，VSV-EGFP接种细胞作为对照。48h后以3%多聚甲醛固定细胞，以兔抗EBOVGP蛋白单克隆抗体为一抗，TRITC标记的山羊抗兔IgG为二抗，IFA检测EBOVGP蛋白的表达。EBOVGP蛋白应呈红色荧光，且与病毒自身表达的绿色荧光重叠。用重组病毒VSVΔG-EBOVGP-EGFP（MOI=0.5）感染VeroE6细胞，VSV-EGFP接种细胞作为对照。48h后收取并裂解细胞，蛋白样品进行SDS-PAGE电泳并转印至PVDF膜，以兔抗EBOVGP单克隆抗体为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗，Westernblotting检测EBOVGP蛋白的表达。EBOVGP单克隆抗体应仅与VSVΔG-EBOVGP-EGFP感染细胞样品发生特异性反应，条带约为120kD，VSV-EGFP感染的细胞样品无特异性条带或无特异性反应条带。B.2.4重组病毒的毒价测定-1-8将VSVΔG-EBOVGP-EGFP做10~10稀释，稀释后的病毒悬液加入96孔板，每孔加入50μL病毒悬液，每孔补充含2%FBS的DMEM培养基50μL，再加入细胞悬液100μL5（每毫升含3×10个细胞），每个稀释度作8孔，每块96孔板设8孔细胞对照。置5%CO2培养箱37℃培养，培养48h后观察绿色荧光并记录。按Reed-Muench法计算病毒悬液的毒价（TCID50/mL）。10