蟾蜍离体心脏灌流

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蟾蜍离体心脏灌流一：实验目的1、掌握两栖类动物离体心脏灌流的方法，掌握斯氏插管法2、了解心肌的生理特性，证明心脏具有自动节律性收缩的能力3、观察Na+K+Ca2+对心脏活动的影响。4、理解内环境各种理化因素的相对恒定对于细胞进行正常生命活动的重要意义。二：实验原理1、正常蛙心能按静脉窦的节律性自动产生兴奋，心脏的自动节律性活动需要有一个合适的理化环境。蟾蜍心脏离体后，用任氏液灌流，在一定时间内仍能保持节律性兴奋和收缩活动。由于心脏的正常活动还要依赖于内环境因素的相对稳定，改变灌流液的成分可引起心脏活动的改变。心肌细胞外离子浓度的变化和因体内生物活性物质（如激素）引起的细胞膜离子通透性的改变，对心肌细胞的生物电活动和生理特性必然会产生明显的影响。2、影响心肌细胞电生理特征的原因：（1）心肌的自动节律性：①最大复极电位与阈电位的差异；②4期自动除极速度（2）心肌的兴奋性：①静息电位的水平：依赖于细胞外的K+浓度②Na+通道的性状（3）心肌的传导性：主要取决于动作电位0期除极速度和幅度（4）心肌的收缩性：依赖于细胞外钙离子的浓度3、涉及到的几种离子对心脏活动的影响：①钾离子：K+参与心肌细胞的复极化和自律细胞的4期自动去极化过程，其改变不仅取决于细胞内外K+浓度梯度，还与细胞膜对K+通透性有关，因此其影响是多方面的；②钙离子：Ca2+对Na+内流存在竞争抑制作用，称作膜屏障作用，对静息电位无影响。其浓度升高可使心肌细胞的兴奋性降低，传导减慢，收缩力增强。三：实验器材动物：蟾蜍（尽量选择体型大的蟾蜍）试剂：5%NaCl、2%CaCl、1%KCl溶液，任氏液2器材：常用手术器械，张力换能器，蛙心套管，套管夹，滑轮，双凹夹，支架，烧杯四：实验方法与步骤1、离体蛙心的制备取一只蟾蜍，进行双毁髓，按照上次实验的方法进行暴露心脏并仔细识别心脏周围的大血管。在左主动脉的下方穿一线，于动脉圆锥处结扎（动物个体小时，结扎位置可靠上些）。再从左右两主动脉下方穿一线，并打一活结备用。左手提起主动脉上的结扎线，右手用眼科剪在结线下方沿向心方向将动脉上壁剪一“V”型口。将盛有少量任氏液的蛙心套管（用手指将套管堵住，以防套管中的任氏液流出）从“V”型口插入动脉圆锥基部，然后稍后撤套管，使尖端向动脉圆锥的背后部后下方及心尖方向推进，经主动脉板插入心室腔内（于心室收缩时插入，但不可插得过深，以免心室壁堵住套管下口），可见液面随心搏升降即可。用滴管吸取套管中的血液，更换新鲜任氏液。将分支前主动脉下的松结扎紧，并固定在套管的小突上。小心提起套管和心脏，剪断主动脉的左右分支；结扎与静脉窦相连的后腔静脉，并在结扎线以下剪断，将心脏离体（勿损伤静脉窦）。用任氏液反复冲洗心室内余血，使套管内灌流液不再有残留的血液。保持管内的液面高

1度一致（1.5~2cm），即可进行实验。2、将插好离体心脏的套管固定在支架上，用蛙心夹夹住少许心尖部肌肉（不可夹得过多，以免因夹破心室而漏液）。再将蛙心夹上的系线绕过一个滑轮与张力感受器相连。注意：不要使灌流液滴到传感器上，调节显示器上心脏收缩曲线的幅度适中。3、接通张力传感器输入通道，打开生理信号采集系统，选择“蛙心灌流”实验，调节好零点。4、实验观察：（1）记录正常心搏曲线。（2）向套管内滴加2滴5%NaCl溶液，并做好加药标记，观察心搏曲线变化，待曲线出现明显变化时，立即吸取套管中的灌流液，并做好冲洗标记，迅速用新鲜任氏液清洗多次，待心搏恢复正常。注意：在换液时切勿碰套管，并使液体贴壁流下，以免操作影响曲线的基线，同时保持灌流液面一致。（3）同法向管内滴加2滴CaCl溶液，做好加药标记，观察记录心搏曲线的变2化，同法冲洗更换灌流液，待心搏恢复正常。（4）同法向管内滴加1滴KCl溶液，做好加药标记，观察记录心搏曲线的变化，同法冲洗更换灌流液，待心搏恢复正常。五：实验结果与分析1、正常的心搏曲线2、滴加Na+溶液时，心跳显著减弱。

2因为心肌细胞的收缩相对细胞外的Ca2+浓度有很高的依赖性，因其是触发心肌质网释放Ca2+的关键，当在任氏液中滴加NaCl时，Na+与Ca2内流的竞争性抑制导致Ca2内流减少，心肌的收缩活动也随之减弱。开始清洗后心脏恢复约25s回归正常。3、用高Ca2+任氏液灌流，可见蟾蜍心脏收缩力增强，但舒张不完全，收缩基线上移。理论知，心肌的舒缩活动与肌浆中Ca2+浓度的高低有关，当Ca2+浓度升至10-5mol/L时，作为钙受体的肌钙蛋白结合了足够的Ca2+，引起肌钙蛋白分子构型的改变，从而触发肌丝滑行，肌节缩短，肌肉收缩；当肌浆中的Ca2+浓度降至10-7mol/L时，Ca2+与肌钙蛋白解离，心肌随之舒张。当用高Ca2+任氏液灌注蟾蜍心脏时，使得肌浆中的Ca2+浓度不断升高，Ca2+与肌钙蛋白的结合数量不断增加，甚至达到只结合不解离的程度，于是心肌将持续收缩，因而出现“钙僵”。用Ca2+灌流后进行清洗，心肌恢复时间约为40s。4

3用K+灌注蟾蜍心脏时，心跳明显减弱，甚至出现心脏停止于舒张状态的现象。因为①细胞外K+浓度增高时，心肌动作电位的复极加快，时程缩短，平台期缩短，钙内流减少，胞内肌浆中Ca2+浓度降低，心肌的兴奋—收缩偶联过程减弱，心肌收缩力变弱。②且当K+浓度过高时，膜内外的K+浓度梯度减小，静息电位的绝对值减小太多，Na+通道失活，心肌兴奋性完全丧失，心肌不能兴奋和收缩，停止于舒张状态。用K+灌流后进行清洗，心肌恢复时间约为60s。六：注意事项1、剪开动脉管壁时，使切口呈“V”形，但勿剪断血管；将套管插入蟾蜍心室时，要在心缩期插入，因此时半月瓣正好打开，主动脉与心室腔相通。2、离体心脏时，一定要保留静脉窦，并用任氏液及时冲洗心室内的余血。3、实验前检查蟾蜍心脏内是否有气泡，如果有要将气泡小心挤出，以免气栓影响体外循环。4、蛙心套管内液面勿过高或过低，每次换液时，必须用任氏液冲洗3次以上。5、实验期间随时滴加任氏液于心脏表面使之保持正常的生理活性。6、实验中涉及到的各种试剂比较多，一定要注意每种试剂要有专用的滴管，以免混用造成药物的交叉作用，造成实验结果与理论相反。7、在各项实验中，蛙心套管内的灌流液的液面高度应始终保持一致，以保证心肌受到的前后负荷一致。七：思考题为什么在实验中要保持套管内的液面高度保持一致？实验中，心搏曲线会相对液面的升高、降低发生变化。这是因为心肌缩短幅度和速度既受前负荷的影响，也受到后负荷的制约。实验中套管内的液体和心室腔直接相通，液面高度产生的压力，在心室舒张末期是作用于心肌的前负荷，决定了心肌在收缩之前的初长度。因此，液面高度的变化会导致心肌收缩力的改变。心室开始收缩时，套管内液体压力又成为心肌收缩时所承受的后负荷，后负荷的改变也会使得心肌收缩的幅度和速度改变。因此实验中应选取某一最适液面高度（使心搏曲线幅度最大）并在整个实验中保持此高度。