亲合组织化学技术

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第五章亲合组织化学技术

1发展历史60年代：发现生物素和卵白素70年代：植物凝集素、生物素、葡萄球菌A蛋白------BRAB、LAB、SPA-HRP、ABC…亲和组织化学：1976年Bayer首次提出包括植物凝集素和糖类、生物素和抗生物素、葡萄球菌A蛋白与IgG、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作用部位和受体等

2植物凝集素(Lectin)生物素(Biotin)葡萄球菌A蛋白(SPA)SPA—HRP法、ABC法和LAB法等。亲合组织化学技术定义：是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础，建立的组织细胞基础化学技术。本质：区别于一般的组织化学，非抗原抗体反应。优点：敏感性高，有利于微量抗原（或抗体）在细胞或亚细胞水平的定位。

3一抗生物素—生物素免疫细胞化学技术二葡萄球菌蛋白A技术三凝集素组织化学技术四其它亲和细胞化学

4一、抗生物素—生物素免疫细胞化学技术(一)基本原理亲合素（抗生物素/卵白素）是鸡蛋白中含有的一种碱性蛋白，属于糖蛋白;具有4个同维生素H(生物素)亲合力极高的结合点。链酶亲合素是一种从链酶菌培养物中提取的蛋白质，和亲合素一样，也有四个生物素结合位点，是一种亲和力更高的生物素结合蛋白。生物素（维生素H）是一种小分子的水溶性维生素，它与亲合素／链酶亲合素之间有很强的亲合力，较之抗体对抗原的亲合力要高出100万倍，能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。★生物素、亲合素、链酶亲合素：能与荧光素、铁蛋白和过氧化酶等相结合。★亲合素、链酶亲合素：同一定浓度的生物素化酶混合后，形成亲合素一生物素一酶复合物。这种复合物可以和各种生物素标记抗体结合。

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6ABC复合物：亲和素－生物素－过氧化物酶复合物1亲合素一生物素—过氧化物酶复合物技术(ABC)

7⑴基本原理是将亲合素作为“桥”与生物素化的抗体与生物素结合的酶（HRP)连接起来。第一抗体：为未标记特异性抗体，能结合组织中待测抗原；第二抗体：为生物素化的桥抗体，能与第一抗体结合；第三抗体：是结合了过氧化物酶的亲合素复合物(即ABC)。优点：敏感性强（比PAP高20-40倍）；特异性强，背景染色淡；方法简便，节约时间（比PAP缩短2h）；由于生物素与抗生物素具有和多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。

8⑵操作步骤①冰冻切片或石蜡切片均可。②冰冻切片：丙酮固定，PBS洗5min，更换3次。石蜡切片：脱蜡，系列酒精至水。③第一抗体孵育，过夜。④PBS洗5min，更换3次。⑤加生物素标记的第二抗体，孵育15min。⑥PBS洗5min，更换3次。⑦加ABC复合物室温作用15min。⑧PBS洗5min，更换3次。⑨用DAB显色。⑩复染、封片、观察。⑶结果呈棕黄色为阳性表达，核被苏木精染成浅蓝色。

9(4)注意事项①消除内源性生物素：染色前以0.01％的亲合素和0.01％生物素溶液分别作用20min以消除内源性生物素活性，每次作用后用PBS漂洗3次，5min。②消除内源性过氧化物酶：可用3％H2O2孵育5-10分钟以灭活内源性过氧化物酶活性。蒸馏水洗3次。③试剂的保存：温度以4℃为佳，可达2年之久，在－20℃时其生物活性反而在短期内被破坏。此外，生物素制剂之间相互亲和性差异大，注意厂家和批号。

10SABC法原理：一抗＋生物素化二抗＋SABC复合物SABC复合物链霉卵白素－生物素－过氧化物酶生物素标记的二抗链霉卵白素连接生物素标记的酶。优点：敏感性略高于SP法，低背景和操作简便缺点：因体内含有内源性生物素，易产生非特异性染色。一抗+生物素标记二抗+滴加试剂SABC（链霉卵白素+辣根酶标记生物素)+辣根酶底物显色2链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物技术(SABC法)

11SABC试剂盒(含正常血清，生物素化二抗，SABC等)操作程序1）载玻片防脱处理：可选择APES或Poly—Lysine，烤片。2）切片常规脱蜡至水。3）3％H202灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。4）抗原热修复：将切片浸入枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)，电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5—10分钟后，反复1—2次。冷却后PBS洗涤。5）滴加5％BSA封闭液，室温20分钟。甩去多余液体，不洗。6）滴加适当稀释的一抗，37℃1小时左右或20℃2小时左右。也可4℃过夜。PBS(pH7.2—7.6)洗2分钟×3次。对照切片用PBS代替一抗。

127）滴加生物素化二抗，20—37℃20分钟。PBS(pH7.2—7.6)洗2分钟×3次。8）滴加试剂SABC，20—37℃20分钟。PBS(pH7.2—7.6)洗5分钟×4次。9）DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5一30分钟之间。蒸馏水洗涤。10）苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。结果棕褐色为阳性结果，而细胞核染为淡蓝色。

13注意事项1）染色背景过高：在SABC反应之后，DAB显色之前，用加有0.0l一0.02％TWEEN20的PBS(pH7.2—7.6)洗涤切片4次，单纯PBS洗2次，然后DAB显色。2）抗原热修复：可选0.01M枸橼酸盐缓冲液；也可以使用PBS、TBS等多种缓冲液。

143标记生物素—抗生物素技术(LAB)原理：第—抗体：生物素标记；第二抗体：酶标记抗生物素(亲合素)操作步骤：⑴切片中加入生物素标记一抗，室温孵育1h，。⑵0.01MPBS洗3次，每次5min。⑶20-50ug／mlHRP-抗生物素液孵育。0.01MPBS漂洗3次。⑷DAB显色。蒸馏水漂洗。⑸苏木精复染核。梯度乙醇脱水、透明、封片、镜检。应用不如ABC普遍，但手续较简便，但灵敏度低。

15SP法（过氧化物酶标记的链霉卵白素/过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色）原理：一抗＋生物素化二抗＋酶标记的链霉卵白素优点：高灵敏度、低背景、操作方便缺点：不适用于内源性生物素丰富的组织

16三步法（以SP试剂盒为例）•石蜡切片脱蜡至水。　　•蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。　　•3%H2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。　　•5-10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。　　•PBS冲洗，2分钟×3次。　　•滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10-30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10-20分钟。　　•PBS冲洗，2分钟×3次。　　•滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10-30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10-20分钟。　　•PBS冲洗，2分钟×3次。　　•显色剂显色（DAB或AEC）。　　•自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。

17原理：将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体优点：1简便、快速、敏感性是SP、SABC法的几十倍。2人体组织中不含有这种多聚物，从而避免了组织中生物素的干扰缺点：因大分子穿透核膜困难,对于核内抗原的定位不能选用此法。Envision法一抗+二抗标记多聚螯合物酶Envision法

18EnVision工作程序：1）脱蜡、水化组织切片。2）预处理组织切片（据一抗具体说明而定）3）蒸馏水漂洗，置于PBS中。4）阻断内源性过氧化物酶（仅用于EnVisionTM/HRP）5）蒸馏水漂洗，置于PBS，10分钟6）一抗孵育10-30分钟7）PBS漂洗10分钟8）EnVisionTM孵育10-30分钟9）PBS漂洗10分钟10)色源底物溶液孵育10分钟11)蒸馏水漂洗12)复染及封片

19CSA法（催化信号放大法）原理：是酪胺的过氧化物酶反应(即HRP催化酪胺盐，形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原—抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的链霉亲和素—HRP结合，如经几次这样的循环放大，可以网络许许多多的酶分子，最后通过DAB的显色反应，其敏感性得到几何级放大。优点：比EnVision法敏感20～100倍。适合于实验病理学和第一抗体昂贵、抗原性较弱的IHC检测以及抗原破坏严重、抗原量较少的组织细胞抗原的检测方法;核内抗原的检测（原为杂交）。缺点：操作步骤多、孵育时间长，存在严重的内源性干扰，背景染色有时较重。

20二、葡萄球菌蛋白A技术葡萄球菌蛋白A(SPA)：金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，作为桥抗体或标记抗体不受种属特异性的限制，它能和人及许多动物IgG结合，对IgG免疫球蛋白亚型的结合有选择性。葡萄球菌蛋白A(SPA)技术原理：结合部位是Fc段，不影响抗体的活性；结合力是双价的，可同时结合两个IgG分子；可将酶、荧光素、胶体金等标记在SPA上。

21SPA应用:1免疫球蛋白的制备和分析能和IgG及其某些Fc段结合，可提纯、分析免疫球蛋白制剂。2应用于免疫细胞化学结合力是双价的，可作为桥抗体或标记抗体。且不受种属特异性限制；分子量小，穿透力强。3应用于多种细菌、支原体和病毒的简易快速诊断SPA菌体为载体，结合特异性抗体成为一种吸附原，作协同凝集素，用于细菌、病毒的定群和分型。4可作为固相吸附剂研究免疫复合物、膜抗原、膜受体和膜Ig

22SPA在免疫细胞化学染色中的应用SPA可被荧光素、酶、胶体金、铁蛋白等标记，其中最常用的酶为HRP1SPA-HRP用于间接法的染色(1)切片脱蜡至水，3％H2O2抑制内源性过氧化物酶活性。(2)水洗后，PBS漂洗。(3)加一抗，37℃孵育60min或4℃过夜。0.01MPBS漂洗3次。(4)SPA-HRP室温30min。0.01MPBS漂洗3次。(5)DAB显色。(6)苏木精复染，脱水，透明，封固。

232SPA用于PAP法的染色(1)切片脱蜡至水，0.3％H202甲醇处理切片。(2)10％卵蛋白Tris缓冲液处理20min。(3)加第一抗体37℃孵育60min或4℃过夜。(4)0.05MTris-HCl，pH7.6，洗涤3次。(5)SPA(1ug／m1)孵育15min，0.05MTris-HCl溶液漂洗3次。(6)PAP复合物(无动物种属限制)孵育15min。0.05MTris-HCl溶液漂洗3次。（抗酶抗体+足量的酶==形成稳定的五角形复合物）(7)DAB显色。(8)苏木精复染，脱水，透明，封固。

24三、凝集素组织化学技术凝集素(1ectin)：从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，能凝集红细胞。常用：刀豆素(ConA)、麦胚素(WGA)、花生凝集素(PNA)、大豆凝集素(SBA)等凝集素特性：凝集素具有多价结合的能力，能识别糖蛋白和糖肽，特别是细胞膜中碳水化合物抗原决定簇，结合力为一专一性能，能与荧光素、生物素、酶、胶体金及铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜、电镜水平显示其结合部位。因此凝集素可作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基结构。

25凝集素受体是存在于细胞膜上的糖蛋白和糖脂中的寡糖，而这种受体可区别细胞的类型和反映细胞在分化、成熟和在肿瘤细胞中的作用。1作为细胞分化成熟的标记血细胞，特别是淋巴细胞的分群2作为细胞特殊类型的标记人视网膜视锥细胞（PNA+）视杆细胞（PNA-）乳腺乳腺上皮细胞（PNA+）肌上皮细胞和间质细胞（PNA-）3在肿瘤中凝集素结合的改变PHA胃癌诊断性标志应用：

26凝集素在免疫细胞化学中的应用方法：1直接法将标记物直接标记在凝集素上，与相应糖蛋白或糖脂结合。(1)操作步骤1)切片脱蜡至水(或恒冷箱切片，冷丙酮固定，室温干燥)。2)3％H2O2甲醇液阻断内源性过氧化物酶10～15min。3)过氧化物酶标记的花生凝集素，室温30-60min。4)0.01MPBS漂洗3次。5)DAB显色。6)常规脱水、透明、封固。(2)结果阳性部位呈棕褐色

272间接法细胞膜上的相应糖基+凝集素+标记的抗凝集素抗体操作步骤：(1)切片常规脱蜡至水。(2)3％H202甲醇液阻断内源性过氧化物酶10～15min。(3)凝集素稀释液孵育60min。(4)0.01MPBS漂洗3次，每次3min。(5)适当稀释的标记的抗凝集素抗体孵育30min。(6)0.01MPBS漂洗3次，每次3min。(7)DAB显色。(8)苏木精复染，脱水，透明，封固。间接法较直接法敏感性高，但必须购买抗凝集素抗体。

28(2)操作步骤1)切片脱蜡入水，流水洗5min。2)用PBS配制的小鼠肝粉抑制组织内源性生物素。3)进入3％H20210min。4）加上生物素标记的凝集素，在潮湿容器内室温45min。（用前由自己筛选最佳使用浓度）5)PBS5min×3。6)加上ABC混合液，室温30min。7)PBS5min×3。8)DAB染色，必要时苏木素对比染色。对照切片在步骤4用蒸馏水代替生物素标记的凝集素(3)结果阳性部位呈黄棕色。3凝集素的ABC法(1)原理细胞膜上的相应糖基+生物素化凝集素+ABC复合物

29四其它亲和细胞化学1阴（阳）离子与阳（阴）离子部位阳离子化铁蛋白检测细胞膜表面阴离子---电镜溶菌酶作为阳离子探针检测毛细血管壁阴离子分布肝素作为阴离子探针用于检测细胞阳离子部位2配体和受体：激素和受体；脂蛋白和受体…