干血滤纸片ppt课件

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干血滤纸片法基因诊断实验李禄慧

1实验目的直接采用干血滤纸片中保存的血液样本为PCR扩增的模板，进行基因诊断。

2实验意义干血滤纸片具有用血量少，保存简单，易于运输等特点。所以应用干血滤纸片作为基因诊断的模板具有非常重要的意义。

3实验试剂及仪器实验试剂：新鲜配制的甲醇/丙酮混合液（体积分数为1）生理盐水5%chelex-100溶液20mg/ml的蛋白酶KTaq酶，dNTPs，10XTaq酶buffer，随机引物实验仪器真空干燥泵，离心机，温箱

4方案一Chelex-100法提取一、原理　　当检材较少时或者基因分型只需要少量的DNA时，可以用Chelex-100提取方法提取DNA。Chelex-100是一种化学整合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成。含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，整合多价金属离子，尤其是选择性整合二价离子，比普通离子交换剂具有更高的金属离子选择性和较强的结合力．能结合许多可能影响一步分析的其他外源物质。通过离心除去Chelex-100颗粒，使这些与Chelex-100结合的物质与DNA分离，防止结合到Chelex中的抑制剂或杂质带到PCR反应中，影响下一步的DNA分析，并通过结合金属离子，防止DNA降解。二、仪器设备　　干热器、恒温水浴箱、高速离心机、离心机三、试剂Chelex-100法提取生物检材所需试剂的配制1．5％Chelex-100（w/v）称取5克Chelex-100，加100ml灭菌纯水，放4℃保存。2．10％SDS称取10克优级纯的SDS，加纯水到100ml溶解，室温保存。3．5mg/mlPK酶（蛋白酶K）称取5mgPK酶，溶于1ml灭菌纯水中，－20℃保存。4．1MDTT(二硫苏糖醇)称取154.3mgDTT加1ml灭菌纯水溶解，－20℃保存。

5实验方案一步骤a.取直径约3mm的干血滤纸片剪碎置于1.5ml的离心管内；b.加纯水400ul，高速震荡5-10s，室温浸泡20min，使滤纸沉淀；c.13000r/min离心3min，弃上清；d.加入5%chelex-100溶液100ul及20mg/ml的蛋白酶K溶液4ul，56℃孵育30min以上；e.高速震荡5-10s，放入100℃孵育8min，震荡5-10s；f.13000r/min离心3min，直接取上清为模板。

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8实验方案三a.取直径约1cm的滤纸干血滴置于1.5mlEppendorf管内;b.加600ul生理盐水溶血，室温置15min，轻摇并弃溶血液;c.加600ul双蒸去离子水洗涤，弃洗涤液;d.加100ul双蒸去离子水煮15min，离心15min，取上清为模板

9实验方案四a.将滤纸经（20mmol/LTris*HClpH8.8，2mmol/LEDTA,0.5%TritonX-100,0.1%SDS）2分钟使饱和后；b.放入37℃孵箱中干燥处理后，滴上血滴制成干血滤纸片，直接作为模板。