炭疽实验室检测技术-杨发莲

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炭疽实验室检测技术云南省地方病防治所杨发莲目录一、前言二、炭疽病原检验程序三、血清中炭疽抗体水平检测四、实验项目五、实验方法六、炭疽实验室防护和实验操作注意事项

1一、前言炭疽杆菌属芽胞杆菌科（Bacillaceae），需氧芽胞杆菌属（Bacillus），是最大的一类细菌（宽1~3µm，长5~8µm）。最佳生长温度37℃（12~45℃），最佳生长pH为7.0~7.4。细胞结构中有特点的是其多聚谷氨酸荚膜（poly-γ-D-glutamicacid，PGA），无鞭毛。炭疽杆菌的毒力因素主要是外毒素（保护性抗原PA、致死因子LF和水肿因子EF）三组分和荚膜，并分别由它仅含的两个毒性质粒（pX01，pX02）分别编码和控制，失去任何一个质粒因此也就失去其中一个毒力因素的炭疽杆菌就变成了难以致病的弱毒株。炭疽是由炭疽杆菌所引起的一种危害严重的人畜共患传染病，若控制不及时就会引起大批的牲畜死亡

2造成重大的经济损失，严重影响人、畜健康和生产力发展。随着我国市场经济的发展，人民生活需求的提高，饲养畜密度的增加，动物性食品和毛、皮革制品的利用日趋普及，以及土地资源的开发和环境的改造，各类物资的频繁交流，炭疽对我国人民生命安全和财产构成很大威胁，如不采取及时、有效的监控措施，炭疽发病势将有增无减，隐患无穷。鉴于此种传染性疾病在我国仍属一种高、危病种，加以它尚有自外输入我国的潜在可能，在今后加速发展市场经济的的新形势下，加强各级领导对炭疽防制工作的重视和支持，提高广大的基层相关工作人员对炭疽的认识和防病能力，是很有必要的。要做到早发现、早治疗、早控制，必须有相关丰富的流行病学和临床知识外，一定要熟练掌握相关的实验室检测技术。

3二、炭疽病原检验程序图1示。皮肤渗出物、血液、粪便或呕吐物、土壤或动物标本直接涂片（革兰氏染色）细菌培养必要时做PCR见到革兰氏阳性大杆菌，可定为临床诊断病例未见到革兰氏阳性大杆菌，继续别的试验直接划平板直接划平板后的标本可增菌培养培养12~24h，选可疑菌落做青霉素敏感和噬菌体裂解试验两项均为阳性，可确诊为炭疽

4三、血清中炭疽抗体水平检测（一）意义人血清中炭疽抗体水平检测的意义主要在于下列几个方面：正常人群血清炭疽抗体水平资料收集，特殊人群（产业工人、畜牧人员、实验室人员）血清炭疽抗体水平观察，疫苗接种人群血清炭疽抗体水平分析，患病人群血清炭疽抗体水平研究，在患者标本中未获得炭疽芽胞杆菌阳性检测和分离结果的情况下，血清抗炭疽特异性抗体滴度出现4倍或4倍以上升高也可以结合流行病学线索和临床表现进行确诊。

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62.注意事项：ELISA实验的结果受操作影响很大，每个步骤包括加样、温育、洗涤、显色、酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥ELISA的高灵敏、强特异的优点。因此，应建立实验项目的标准操作程序(SOP)。报告方式以定量分析结果的滴度单位表示；检测时应以接种疫苗前或初报告病例地方的人或动物的血清作为阴性血清，如有可能也可设阳性血清对照。阴性血清每次都要和待测标本同时做。

7（三）具体程序1.包被抗原：用包被缓冲液将已知抗原稀释至0.3μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。洗涤缓冲液配方为：Tris2.42克，1mol/LHCI13mL,吐温-20（0.05%）0.5mL,加蒸馏水至1000mL。2.待检血清反应：加1:8稀释(稀释液为生理盐水)的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育60分钟，洗涤3次，每次3分钟。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)

83.酶标抗体反应：于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)或SPA0.1ml，37℃孵育60分钟，洗涤3次，每次3分钟。4.显色反应：于各反应孔中加入等体积混合的显色底物A、B溶液0.1ml，37℃20分钟。底物A液（磷酸盐枸橼酸缓冲液，pH5.0）配方为：0.2mol/LNa2HPO4(28.4g/L)25.7mL,0.1mol/L枸橼酸(19.2g/L)24.3mL,H2O20.1%,蒸馏水50mL。底物B液[TMB(四甲基联苯胺)使用液]配方为：TMB3.90g,枸橼酸10.52g,EDTA1.86g,甘油2000mL,DMSO300mL,加热溶解后加蒸馏水至10000mL。

95.终止显色：于各反应孔中加入显色终止液(0.5mol/LH2SO4)0.1mL终止反应。6.结果判定：实验结果用酶标仪判读，被检孔OD值达阴性血清对照孔OD值的2.1倍时，始可判为阳性。四、实验项目（一）标本采集（二）细菌培养（三）涂片、G染色、荚膜染色、芽孢染色、光镜检查（四）噬菌体裂解和青霉素敏感性试验（五）PCR基因检测（六）菌种保存

10五、实验方法（一）标本采集1.采集标本时应遵循的原则:尽可能在抗生素治疗开始前采集标本，除必要时并在具备操作病毒细菌条件的实验室内，不得用解剖的方式获得标本。所需的血液与组织标本，均应以穿刺方式取得。所有标本均置无菌容器中2.血液标本：所有疑似病例，采取血液标本5-10ml（不加抗凝剂）。3.皮肤损害处标本：玻片直接在皮肤破损处压蘸；再用棉签采皮肤损害处渗出物，（不加增菌肉汤）。4.粪便与呕吐物标本：有消化道症状的采粪便或呕吐物标本，注意选取其中混有血液的部分。5.痰与咽拭子标本：有呼吸道症状的收集痰液及咽拭子标本。

116.脑脊液标本：表现脑膜刺激症状的病人，腰椎穿刺获取脑脊液。7.尸体标本的采取：可通过穿刺心脏获得血液或穿刺肝脏等实质性脏器获得组织标本。8.有病死动物接触史可采病死动物标本或相关土壤等环境标本。（二）细菌分离培养：全部标本均应进行细菌分离培养。1.标本处理：在生物安全柜内打开装标本的专用容器。在正常情况下应该是无菌的标本，如血液或脑脊液，直接涂布平板，每平板0.1ml左右，组织标本应先以无菌剪刀剪开一断面，在培养基表面压印，然后以接种环涂开。疑似病例的渗出液标本，直接涂布平板后，剩余标本可放入肉汤增菌液中增菌。土壤等有污染或陈旧的标本，均首先制成悬液（土壤等标本经自然沉淀除去粗大沉淀物），10000转／分钟离心5

12分钟，弃去大部分上清液，留少量液体与沉淀物混匀，沸水浴加热15分钟后，取适量涂布平板。2.细菌分离培养：将上述处理过的标本冷却后，用移液器吸取0.1ml左右于固体培养基上，用接种环涂布均匀，在37℃孵育12-24h后，检查是否长出可疑的炭疽芽胞杆菌菌落。3.挑选可疑菌落：上述平板在37℃孵育12-24小时后，检查是否长出可疑的炭疽芽胞杆菌菌落。炭疽芽胞杆菌菌落的形态为：灰白色、不透明、中等大小，常不规则，表面呈毛玻璃样。如图2示。

13图2

14（三）涂片、G染色、荚膜染色、芽孢染色、光镜检查1.在低倍镜下观察，可见菌落呈卷发状，羊毛状如图3,4示。2.革兰氏染色阳性，细菌呈链状排列，菌体两端平齐，呈竹节状图5,6,7示。在机体内或特殊培养条件下能形成荚膜，印度墨汁负染时可见菌体周围有肥厚的荚膜，多色美兰染色时菌体染成蓝色、荚膜染成红色。在固体培养基上，于大气条件下可形成芽胞，芽胞体染不上颜色(革兰氏)，位于细菌中央，呈卵圆形，不膨胀图8示；石炭酸复红染色，芽胞为红色，菌体为蓝色图9示。

15图3

16图4

17图5

18图6

19图7

20图8

21图9

22（四）噬菌体裂解和青霉素敏感性试验将上述可疑菌落挑出，划线接种于平板之上，在划线区内一处滴一滴诊断用炭疽噬菌体，另一处贴一片青霉素纸片。37℃孵育8-24小时后，在滴噬菌体处有透明噬菌斑，青霉素纸片周围有明显的抑菌环（图9）示，便可判定接种物为炭疽芽胞杆菌。在患者或尸体中分离获得炭疽芽胞杆菌，炭疽的诊断即可确立。

23图10

24（五）PCR基因检测1.PCR标本处理：用于PCR模板制备的标本类型有土壤，毛皮，脏器，组织标本，棉拭子。（1）土壤标本：用硬纸条对折取约0.1～0.3g土壤标本置于1.5ml离心管中，加入蒸馏水或pH8.0的TE溶液至0.5ml，用移液器轻轻搅动，使其悬浮，盖严盖子。（2）毛皮标本：为避免毛皮受气流影响飞到各处，在安全柜中放一个纸袋，在袋子中用无菌剪刀将毛皮标本剪碎成小块，取剪碎的标本置于1.5ml离心管中，用移液器或吸管加入蒸馏水或pH8.0的TE溶液至0.5ml，盖严盖子。用过的剪刀、镊子放入盛有消毒液的加盖容器内。

25（3）脏器（心、肝、脾、肺等），组织标本：用无菌剪刀和镊子约取1g标本，放入研磨器中研磨，再加入0.5ml蒸馏水或pH8.0的TE溶液悬浮，混匀后，用移液器将液体部分移入1.5ml离心管中，盖严。用过的容器及标本碎块放入可封闭容器中，剪刀、镊子等放入盛有消毒液的加盖容器内。（4）棉拭子标本：在棉拭子容器中加0.5ml蒸馏水或pH8.0的TE溶液，用无菌镊子挤压拭子几次，用移液器或吸管吸液体放入1.5ml离心管中，盖严。将以上放有标本的离心管盖子封好，100℃加热20min。10000rpm离心10min，用注射器将上清液吸出，必要时应用0.22μm滤器过滤除菌，滤液用一个新离心管收集即为模板。制备好的模板暂时不用时，要放在－20℃保存。

262.PCR操作程序：（1）所用引物序列如下：其中cap外和cap内检测的是同一个基因，可只使用一对。引物名称序列基因定位扩增长度（bp）pagA普F:ATTTGCGGTAACACTTCACTpagA基因－pXO1923R:AGACCGTGACAATGATGGAAcap外F：CCTGGTTGTTCTTTTCGTTGCcap基因－pXO21242R：CGGATTGTATATGGAGTGGGcap内F：TTTCACCAGCACCCACATAGcap基因－pXO21002R：GGGACAGGAATGTTTGGATCrpoB普2F:CCAACAGTAGAAATGCCR:AATTTCACCAGTTTCTGGATCTrpoB基因－染色体197

27（2）反应体系：在PCR管内依次加入以下成分，反应体系总共25ul，10×反应缓冲液2.5µl4×dNTP混合物（每种2.5mM）2µl引物（上游）1µl引物（下游）1µl待测模板1µlTaqDNA聚合酶0.5µl（2-3U）无菌去离子水17µl使用2×mix的反应体系：25µl2×mix12.5µl引物（上游）1µl引物（下游）1µl待测模板1µl无菌去离子水9.5µl

28（3）反应条件：预变性95℃5min；然后95℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸5min。（4）电泳：1%琼脂糖凝胶熔化，稍凉后，加入核酸染料（100ml凝胶加入染料5ul），倒入模具中，插入梳子，待凝固后放入电泳槽内，拔掉梳子。从扩增好的PCR管内吸取5ul与1ul6×loadingbuffer混匀后加入加样孔内，两侧孔内加入5ulDNAMarker，100V，电泳1小时左右，在紫外透射仪或读胶仪上观察结果。

29（5）结果分析：图10示。pagA扩增结果，片段长度为923bpcap内扩增结果，片段长度为1002bpcap外扩增结果，片段长度为1242bprpoB2扩增结果，片段长度为197bp

30图11

31（六）菌种保存1.50%甘油液保存：在固体培养基表面，于37℃培养4天以上，应有70%以上可形成芽胞。用磷酸盐缓冲液洗下培养物，根据混浊度配制成约每毫升2×109个细菌的悬液，加入等量的灭菌甘油后，分装入2ml螺口菌种管内，每管1ml。每株菌至少应制备2支，记录制备支数。将菌种管置于菌种保藏盒中，4℃保存。2.半固体保存：从培养一天的固体培养基上用接种针挑取细菌，穿刺半固体培养管，37℃过夜培养，第二天取出，在半固体表面滴加一滴灭菌甘油。每株菌至少应制备2支，记录制备支数。将菌种管置于菌种保藏盒中，4℃保存。

323.菌种保存管保存：从培养两天以上的固体培养基上用接种环挑取细菌，加入菌种保存管中，混匀，去掉适量液体，做好标记，置于菌种保藏盒中，-80℃保存。每株菌至少应制备2支，记录制备支数。

33六、炭疽实验室防护和实验操作注意事项在炭疽杆菌的研究、检测中，特别要求注意“控制”，避免对自身、他人和外界环境造成污染。特殊病原一般要求在生物安全2~4级实验室生物安全柜（BiosafetyLevelX）内操作，炭疽要求2或3级。对于炭疽来讲，生物安全2级的设备、设施和工作要求适于进行临床材料处理、感染培养物的诊断量工作、以及实验感染啮齿类动物的研究，生物安全3级的设备、设施和工作要求适于进行生产量的培养或浓缩、以及可能产生气溶胶的操作。

34应该有以下几方面必须注意：（一）实验室应严密，没有空气泄漏，有缓冲间。（二）室内不能有正压净化系统，平时要减少空气流动。（三）建议使用生物安全柜（BiologicalSafetyCabinet）。（四）实验室内有或有与实验室直接连通的高压蒸汽消毒柜。（五）工作人员必须预先接受免疫预防。（六）工作人员要有良好的实验室操作技术和理论素质，工作时必须两人以上。

35（七）尽可能不做动物实验。（八）一定要制定好详细的管理使用文件，包括制度和操作细则，相关人员严格遵守。（九）实验结束后，将需要处理的细菌培养物及其他废弃物及时高压。（十）记录试验过程及结果，清理实验台面，并用蘸有消毒液的毛巾擦拭，然后用75%乙醇清洁。

36参考文献1.梁旭东主编：炭疽防治手册。中国农业出版社出版，2001年10月。2.王秉翔，杨进，虞雪梅等：炭疽监测技术讲义，2005年。3.俞东征，海荣，魏建春等：炭疽监测技术讲义，2005年。4.炭疽诊断标准，中华人民共和国卫生部2008-02-28颁布，2008-09-01实施。

37谢谢大家!