生化分析技术综合ppt课件

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30十月20221生化分析技术综合

130十月20222生化分析的范畴有效成分的提取和纯化有效成分性质的分析有效成分组成及结构的分析有效成分的功能分析

230十月20223第一章生命大分子物质的制备生命大分子物质的特点：1、生命大分子是动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生的活性物质2、生命大分子的特殊性和复杂性3、生命大分子都是由简单的小分子构成的物4、具有特殊的结构和功能5、生命大分子不稳定

330十月20224第一节材料的选择与处理一、材料的选择有效成分：欲纯化的某种单一的生命大分子物质。相对于有效成分以外的物质称杂质。材料来源动物植物根、茎、叶微生物组织、器官血液、分泌物

430十月20225选材原则：①含有效成分丰富、稳定性好；②来源丰富、保持新鲜；③材料适合加工提取；④具有经济利用价值。组织差异性时间差异性生理状态差异性研究对象的选择

530十月20226生物材料选定后，最好及时使用。如不能及时使用时，应做好材料的处理工作以免有效成分的破坏。二、材料的处理动物脏器冰冻干燥植物组织微生物

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930十月202210比色法葡萄糖＋O2＋H2O葡萄糖酸＋H2O2葡萄糖氧化酶H2O2＋酚＋4－AAP醌亚胺＋H2O浊度法：测定悬浮液在不被吸收的波长下表观的消光值。电化学法：测定反应过程中H＋的浓度变化从而计算出有效成分含量。生物活性检测免疫分析法

1030十月202211第三节细胞破碎细胞破碎方法机械破碎法物理破碎法化学破碎法酶促破碎法

1130十月202212机械破碎法捣碎法研磨法匀浆法物理破碎法温度差破碎法压力差破碎法超声破碎法化学破碎法利用化学渗透的方法，通过有机溶剂、抗生素、表面活性剂、金属熬合剂、变性剂等，使细胞膜破碎的方法。酶促破碎法利用酶的活性破坏细胞膜的化学结构使细胞膜破碎的方法。

1230十月202213第四节提取提取：在一定的条件下，用适当的溶剂(处理)原料，使欲分离物质充分溶解到溶剂中的过程称提取，也称抽提。提取主要是根据被分离物质在不同溶液中的溶解度不同而实现提取的目的。一、抽提的含意二、影响抽提的因素1、pH值2、溶剂的极性和离子强度3、水解酶

1330十月2022144、温度5、搅拌6、氧化7、金属离子8、抽提液与抽提物的比例

14第五节浓缩沉淀法吸附法超过滤法透析法减压蒸馏法冰冻干燥法30十月202215

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18第六节纯化方案的设计与评价30十月202219纯化方案：在纯化某一物质过程中，根据被分离物质的理化性质、分离方法的优劣，将几种分离方法有机地结合并灵活应用，实现提取被分离物质的技术路线，称纯化方案。

1930十月202220纯化方案的设计纯化方案是由几种分离方法组成的，因此，设计纯化方案时，首先要选择分离方法。选择分离方法的依据主要根据有效成分与杂质间的理化性质的差异选择分离方法。

2030十月202221根据溶解度的差异进行的分离根据分子大小的差异进行的分离根据分子极性的差异进行的分离根据分子所带电荷的差异进行的分离根据生物分子间特异结合性质进行的分离等

21第六节纯化方案的设计与评价30十月202222初分离精细分离盐析法有机溶剂沉淀法电泳法层析法离心法离子交换层析排阻层析亲和层析

22第六节纯化方案的设计与评价30十月202223纯化方案的评价：是对组成纯化方案的每一种分离方法的评价。有效成分的含量测定比活力测定()活力单位数毫克蛋白纯化倍数()每步的比活力粗提液比活力收得率(×100％)每步的总活力粗提液总活力评价指标

2330十月202224L－门冬酰胺酶的纯化步骤总蛋白/g总活力/U比活力/(U/mg)纯化倍数回收率/%1粗提液30g210000.711002氧化锰处理7.64g150172.02.8723冰冻融解5.58g148722.73.8714DEAE-纤维素层析0.113g502544.563.5245硫酸铵盐析0.048g336771.7102176羟基磷灰石0.016g3133200286157聚丙烯酰胺凝电泳0.012g310025536515

24第七节有效成分纯度和性质的分析30十月202225纯度分析性质分析比活性电泳分析高压液相或气相色谱免疫分析分子质量测定分子结构测定

2530十月202226非膜过滤膜过滤粗滤微滤(微孔过滤)常压过滤加压过滤减压过滤超滤反渗透电渗析

2630十月202227利用过滤介质而使不同大小、不同形状的物质彼此分离的方法称过滤。

2730十月202228正胶束的结构

28第二章沉淀法30十月202229一、基本原理：通过改变某些条件或添加某种物质，使某溶质在溶液中的溶解度降低，从溶液中沉淀析出，而与其他溶质分离的技术称沉淀分离。第一节基本原理与沉淀类型盐析沉淀法等电点沉淀法有机溶剂沉淀法金属盐沉淀法复合沉淀法选择性变性沉淀法

2930十月202230二、制备蛋白质(一)盐析法盐溶：在低盐浓度条件下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加的现象称盐溶。盐析：在高浓度盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而降低的现象称盐析。

3030十月202231蛋白质的荷电性发生了变化蛋白质表面的水化膜发生了变化盐的存在之所以能使蛋白质进行盐溶或盐析是因为盐改变了溶液的离子强度。在离子的作用下，蛋白质发生了如下的变化：

3130十月202232蛋白质在溶液中的溶解度与溶液的离子强度的关系为：lg=-KsISS0在温度和pH一定的条件下，S0为一常数。上式可改为：lgS=lgS0-KsI=β-KsI1、盐析的原理

3230十月202233Ks为盐析系数，主要决定于盐的性质。其大小与离子价数成正比、与离子半径和溶液的介电常数成反比。β主要决定于蛋白质的性质，也与温度和pH有关。在温度和pH一定时，β为一常数。(1)盐分级沉淀盐的选择

3330十月202234盐的选择在盐析过程中选择盐时一般遵循以下的原则：①在水溶液中的溶解度大，能提供足够的离子强度；②盐的温度系数要小，温度对溶解度的影响小；③价格要便宜，减少生产成本。最常用的盐是硫酸铵，此外硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等也有使用。硫酸铵浓度的调整方法饱和度是溶液中加入的饱和硫酸铵溶液的体积与混合溶液总体积之比值。

3430十月202235盐析时的注意事项硫酸铵的纯度要高在进行分段盐析时，要从低浓度到高浓度在盐析条件相同的情况下，蛋白质的浓度越高越容易沉淀，但也容易出现共沉淀，盐析时要尽量避免共沉淀的发生盐析产生的蛋白质沉淀中含有大量的盐，盐析后必需将盐除去

3530十月202236A、固体法：适用于粗提液体积比较大时蛋白质的提取。向粗提液中直接加入硫酸铵固体颗粒，使硫酸铵达到一定浓度，而使蛋白质沉淀的方法。硫酸铵盐析g=533(S2-S1)100-0.3S2g=541(S2-S1)100-0.3S2（20℃）（25℃）

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3730十月202238B、饱和溶液法：利用不同饱和度硫酸铵溶液配制各种饱和度硫酸铵溶液的方法。V＝V0S2－S1S3－S2饱和硫酸铵的配制在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热到50～60℃保温数分钟，趁热过滤，再在0℃或25℃平衡1～2天，有固体析出时即达100％饱和。

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3930十月202240C、透析法：将盛有蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积盐溶液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度，使蛋白质沉淀的方法。优点：盐浓度是以连续状态变化，避免盐浓度局部升高产生的不良影响缺点：a.透析袋容积小，处理样品量小b.速度慢

4030十月202241(2)盐析曲线制作

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4230十月202243分段盐析：利用不同的离子强度和溶液的性质使不同的蛋白质分离的方法称分段盐析。按性质可将分段盐析分为：Ks分段盐析：温度和pH保持不变，通过改变溶液的离子强度而使不同的蛋白质分离的方法。β分段盐析：溶液的离子强度保持不变，通过改变溶液的温度或pH值而使不同的蛋白质分离的方法。I=1/2∑MiZi2

4330十月202244(3)盐析的影响因子①盐析常数(Ks)lgS=lgS0-KsM=β-KsMKs表示有效成分在特定条件下的恒定值，表示有效成分的溶解度降低的速率与盐浓度的关系。Ks与蛋白质本身的性质有关，也受溶液的pH、温度盐的种类等因素的影响。

4430十月202245②盐分级范围的差异性：当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋白质的Ks值都很大，而且盐析范围(盐离子强度)差异明显，则分离效果好；若Ks值很大，但盐析范围差异较小，则分离效果差。

4530十月202246在pH7.0溶液中几种蛋白质的β和Ks常数项目兔肌醛兔肌丙酮兔肌甘油醛兔肌乳酸兔肌磷酸甘牛血清缩酶酸激酶磷酸脱氢酶脱氢酶油醛变位酶白蛋白β常数6.3010.28.68.09.859.2Ks常数2.844.342.483.974.263.26(NH4)2SO4浓度2.202.343.342.022.322.84

4630十月202247沉淀量／mg硫酸铵饱和度／％ABC

4730十月202248③pH和盐浓度④蛋白质的纯度和浓度(4)脱盐2、有机溶剂沉淀法有机溶剂是强脱水剂有机溶剂是的介电常数小有机溶剂的用量V=V0×S2–S1S100-S2

4830十月202249有机溶剂沉淀法的注意事项(1)低温下操作：由于有机溶剂加入水溶液时产生放热反应会引起蛋白质变性，因此必须把所用的有机溶剂预冷至－10℃，而且整个操作要在低温下进行。(2)中性盐作用：加入适量的中性盐能增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，可降低有机溶剂对蛋白质的变性作用，同时还可提高分级效果。但加入的量过多，则可引起蛋白质析出，影响有机溶剂的分级作用。中性盐的离子强度可控制在<0.05。

4930十月202250(3)多价阳离子作用：有些蛋白质和多价阳离子能结合形成复合物，致使蛋白质在有机溶剂中的溶解度降低。对在高浓度溶剂中才能沉淀的蛋白质特别有益。

5030十月2022513、等电点沉淀法：通过调节溶液的pH值至某种溶质的等电点，使其溶解度降低沉淀析出的方法。4、复合沉淀法：在溶液中加入某些物质，使它与蛋白质等形成复合物而沉淀下来的方法称为复合沉淀法。常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。

5130十月2022525、金属盐沉淀法：利用溶液中某种溶质与某些金属离了反应，生成金属盐沉淀，而与其他组分分离的方法，称为金属盐沉淀法。6、选择性沉淀法：利用不同蛋白质对不同物理化学因素的稳定性不同而实现对有效成分从杂质中分离的方法。

5230十月202253脱盐

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5430十月202255三、制备核酸核酸在生物体内往往是与蛋白质一起形成DNP或RNP复合物，制备核酸时首先使复合物解聚，除去复合物中蛋白质的方法有：(1)去污剂常用的去污剂有十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸钠、脱氧胆酸钠、Triton-100、吐温-40等。

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5630十月202257(2)有机溶剂很多有机溶剂是蛋白质变性剂，使蛋白质变性后与核酸分开，从而提取出核酸。常用的有机溶剂变性剂有氯仿和水饱和酚。(3)蛋白水解酶：用蛋白酶处理DNP/RNP复合物中蛋白质组分的方法比较温和，并可避免剪切和破坏核酸。常用的蛋白酶有溶菌酶、蛋白酶K和蛋白酶E等。

5730十月2022582、多糖等杂质的消除(1)多糖：采用动物材料提取核酸时，宰杀前饥饿12h；植物作材料提取核酸时，置暗室培养数天，其体内的糖原和淀粉可被消耗掉，有利于核酸的提取。而其它的多糖可用选择性变性的方法沉淀除去。常用的选择变性剂有异丙醇、十六烷基溴化铵或等体积的乙二醇甲醚处理后离心除去。

5830十月202259(2)DNA与RNA的分离①盐浓度法：DNA与RNA在不同浓度的NaCl中的溶解度不同，可利用此性质将两种不同的核酸彼此分离。DNA在高浓度的盐中溶解度大而RNA在低盐溶液中的溶解度大。②酶水解法

5930十月2022603、核酸沉淀(1)乙醇－盐溶液：核酸的钠盐或钾盐在多数有机溶剂中是不溶解的。在核酸溶液(浓度>0.1um/ml)中，加入0.1mol/LNaCl(含0.25mol/LNaAC或2.5mol/LNH4AC)溶液和2倍(对DNA)或2.5倍体积(对RNA)的冷无水乙醇，就可将核酸沉淀出来有机溶剂

6030十月202261(2)异丙醇：在含DNA（或大分子rRNA）的溶液中加入0.3mol/LNaAC和0.54～1倍体积的异丙醇，放置短时间后，经离心即可得到核酸。而多糖及小分子RNA则分布于上清液中。但异丙醇沸点高，不易从核酸中除去，蔗糖、NaCl等在低温下易与DNA产生共沉淀。

6130十月202262加聚乙二醇(PEG)-0.5mol/LNaCl溶液到核酸溶液中，可使<2kb的DNA片段溶液出来。PEG的浓度与DNA片段的分子质量成反比。聚乙二醇