流式细胞分析技术及应用

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1、流式细胞分析技术及应用黄赞第一节概述一、工作原理二、散射光的测定三、荧光测量四、细胞分选原理第二节数据的显示与分析一、参数二、数据显示方式三、设门分析技术第三节流式细胞仪免疫分析的技术要求一、免疫检测样品制备二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色三、流式细胞免疫学技术的质量控制四、应用流式细胞术(flowcytometry,FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。参考书：流式细胞术，陈朱波，曹雪涛，科学出版社2010年流式细胞术的特点流式细胞术最大的特

2、点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量、多参数、高纯度分选流式细胞仪与显微镜的区别区别流式细胞仪显微镜光源激光自然光、灯光、激光对象细胞、生物粒子细胞、组织等承载工具鞘液及流动室载玻片检测信号光学信号形态及染色放大方式PMT、放大电路目镜×物镜、光学放大统计计算机，>5000人工，200结果多参数，综合分析简单，少数参数第一节概述流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分

3、析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的技术。流式细胞术发展史•1930年，Caspersson和Thorell开始致力于细胞的计数。•1934年，Moldaven是世界上最早设想使细胞检测自动化的人，他试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞。•1936年，Caspersson等引入显微光度术。•1940年，Coons提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白。•1947年，Guclcer运用层流和湍流原理研制

4、烟雾微粒计数器。发展史•1949年，WallaceCoulter提出在悬液中计数粒子的方法的专利。•1950年，Caspersson用显微分光光度计的方法在UV和可见光光谱区检测细胞。•1953年，Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动计数器。同年，Parker和Horst描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形。发展史•1954年，Beirne和Hutcheon发明光电粒子计数器•1959年，B型Coulter计数器•1965年，Kamemtsky等提出两个设想，一是用

5、分光光度计定量细胞成分；二是结合测量值对细胞分类。•1967年，Kamentsky和Melamed在Moldaven的方法的基础上提出细胞分选的方法。发展史•1969年，VanDilla，Fulwyler及其同事们在LosAlamos，NM（即现在的NationalFlowCytometryResourceLabs）发明第一台荧光检测细胞计。•1972年，Herzenberg研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经过荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号。•1975年，Kohler和Milstein提出了单克隆抗

6、体技术，为细胞研究中大量的特异的免疫试剂的应用奠定了基础。发展史•1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACSI。•从此，大量的厂家不断研制生产出自己的流式细胞仪，流式细胞术进入了一个空前飞速发展的时CytoFLEXBeckmanCyAnMoFlo-XDPSONYBDCelestaBDLSRFortessaBDFACSAria流式细胞仪常检测的细胞特性细胞组成细胞功能大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度细胞活性－细胞周期、凋亡DNA,RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量

7、激素结合位点钙离子,PH值,膜电位酶活性蛋白修饰一、工作原理采用激光作为激发光源，好的单色性与激发效率；荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。流式细胞技术激发光发射光激光前向散射侧向散射基本过程已标记的单细硅化管流动室形成稳态喷嘴水平激光与之荧光染料被胞悬液和鞘液激发发光单细胞液柱垂直相交荧光检测系统和光电倍增管放大计算机系统收集光信号脉冲信号分析结果散射光感受系统基本工作原理内部光路主要

8、技术指标•测量灵敏度：单个微球上最少标有FITC或PE荧光分子数目表示•分辨率：通常以变异系数CV表示•前向角散射光检测灵敏度：0.2－0.5微米•分析速度：每秒可分析的细胞数1.流式细胞仪的基本结构：（1）液流系统:流动室和液流驱动系统依次传送待测样本中的细胞到激光照射区（2）光学系统:激光光源/光束形成系统和光路系统细胞由激光激发,通过光学滤片产生光信号