杯碟法检测方法090626-新

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1、杯碟法检测青霉素酶的方法（试行）1.适用范围本方法适用于原料奶、灭菌乳、乳饮料中青霉素酶的检测。2.实验原理青霉素酶能够破坏青霉素对藤黄微球菌的抑制作用，而舒巴坦能特异性地抑制青霉素酶的这种作用，在样品中先后加入适量的舒巴坦和青霉素，采用杯碟法通过测定抑菌圈大小差异来检测样品中的青霉素酶。酶活单位（ActiveUnit）：在室温（25℃）下，1min分解1μmol的青霉素G所需的酶量为一个单位，即1IU。3.试剂与材料除另有规定外，所有试剂为分析纯，水为GB/T6682-2008规定的三级水。3.1菌种：藤黄微球菌（MicrococcusLuteu

2、s）,菌种号CMCC（B）28001。3.2青霉素酶标准品：纯度≥90%，酶活1200IU/mg（≥1000万青霉素效价单位），4℃保存。3.3舒巴坦标准品：纯度89.2%，4℃保存。3.4青霉素G：色谱级，纯度97%（分析纯需适当增加标准工作溶液浓度），密封避光，防潮，4℃保存。3.5磷酸二氢钾（KH2PO4）：纯度99.5%。3.6磷酸氢二钾（K2HPO4）：纯度98%。3.7氯化钠（NaCL）：纯度99.5%。3.8磷酸盐缓冲溶液（pH6.0）：取8g磷酸二氢钾（3.5）和2g磷酸氢二钾（3.6），用1000ml水溶解，121℃高压灭菌15m

3、in。3.9生理盐水：称取8.5g氯化钠（3.7），溶解于1000ml水中，121℃高压灭菌15min。3.10青霉素酶标准储备溶液：准确称取（精确至0.001g）青霉素酶标准品（3.2）用生理盐水（3.9）溶解并稀释，配成酶活力为1000IU/ml的标准储备溶液，4℃保存。可使用1个月。3.11青霉素酶标准工作液：用生理盐水（3.9）将青霉素酶标准储备溶液（3.10）稀释配制成酶活力为1IU/ml的标准工作溶液，需当天配制使用。3.12舒巴坦标准储备溶液：准确称取（精确至0.001g）舒巴坦标准品（3.3），用磷酸盐缓冲液（3.8）溶解并定容为1

4、0mg/ml。4℃保存。可使用1-2个月。3.13舒巴坦标准工作溶液：用磷酸盐缓冲溶液（3.8）将舒巴坦标准储备溶液（3.12）稀释配制成浓度为1mg/ml，需当天配制使用。3.14青霉素G标准储备溶液：准确称取（精确至0.001g）青霉素G（3.4），用磷酸盐缓冲溶液（3.8）溶解并定容为1mg/ml,4℃棕色瓶中保存，可使用1-2个月。3.15青霉素G标准工作液：取青霉素G标准储备液（3.14），用磷酸盐缓冲液（3.8）稀释，配制成浓度为10μg/ml，4℃保存。可使用2-3天。3.16空白奶粉：脱脂奶粉3.17灭菌脱脂乳：使用脱脂奶粉（3.1

5、6）按GB/T4789.27-2008中4.2执行（10g奶粉+90ml水，113℃灭菌20min）。3.18菌种培养基：LB营养琼脂3.19抗生素Ⅰ号培养基4.仪器与设备4.1天平：精确到0.001g4.2冰箱：4℃4.3恒温培养箱：36℃±1℃4.4恒温水浴锅：55℃±1℃4.5恒温干燥箱4.6高压灭菌锅4.7抑菌圈自动测量分析仪或游标卡尺（精确到0.1mm）4.8旋涡混匀器4.9移液枪：20-200μl、100-1000μl、1000-5000μl4.10培养皿：内径90±0.5mm，皿底平整光滑，厚薄均匀无凹凸现象。4.11牛津杯：不锈钢管

6、，外径（7.8±0.1mm）,内径（6.0±0.1mm），高度（10.0±0.1mm）。4.12陶瓦盖：内径110mm，外径116mm，高度26mm。5.检测步骤5.1试样制备5.1.1液体奶：取奶样25g，混合均匀，待处理。5.1.2酸奶：取酸乳样品25g，经生理盐水1：1稀释，混合均匀，待处理。5.1.3阴性对照样品：灭菌脱脂乳5.1.4阳性对照样品：移取青霉素酶标准工作液加入到灭菌脱脂乳中，混合均匀配制成酶活力为0.1IU/ml的阳性对照样品，4℃保存。可使用2-3天。5.2试样处理5.2.1取试样900μl分别放入A、B、C、D四个2ml离

7、心管中，加入以下配置（加样顺序按试剂排列顺序）：A：加50μl舒巴坦标准工作溶液，再加入50μl青霉素G标准工作溶液。B：加50μl舒巴坦标准工作溶液，再加入50μl磷酸盐缓冲液。C：加100μl磷酸盐缓冲液。D：加50μl青霉素G标准工作溶液，再加入50μl磷酸盐缓冲液。将上述混合液用涡旋混匀器充分振荡混匀，室温放置1小时后检测。同时做阴性对照和阳性对照样品各一组。5.3菌悬液的制备及用量将菌种接种于菌种培养基斜面试管中（工作菌株正常使用传代数为3-10代，一般可使用1-2个月），36±1℃培养22-24h。使用4ml生理盐水将经过培养的新鲜斜面

8、培养物洗下，混合均匀，得到菌悬液（含菌量大约1*109CFU/ml）。将菌悬液以2%的比例加入到LB营养琼脂中，菌悬液中含