DB13T 2051-2014 幼羔体外胚胎生产技术规程

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1、ICS65.020.30B40DB13河北省地方标准DB13/T2051—2014幼羔体外胚胎生产技术规程2014-07-07发布2014-07-31实施河北省质量技术监督局发布DB13/T2051—2014前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北农业大学提出。本标准起草单位：河北农业大学、河北省牛羊胚胎工程技术研究中心。本标准主要起草人：田树军、孙树春、金东航、陈晓勇、敦伟涛、贾日东、孟娜娜、刘梦鹤、王春霞、李捷鑫。IDB13/T2051—2014幼羔体外胚胎生产技术规程1范围本标准规定了幼羔体外胚胎生产的供体选择、幼羔超数排卵、采集卵丘卵母细胞复

2、合体、体外成熟培养、体外受精、体外胚胎发育培养和胚胎质量检测。本标准适用于利用幼龄羔羊作为供体，进行诱导卵泡发育、活体采集卵丘卵母细胞复合体及体外胚胎生产及科学研究。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T1674-2008牛羊胚胎质量检测技术规程3术语及定义3.1供体出生后4～10周龄的雌性羔羊。3.2诱导卵泡发育供体经过外源促性腺激素处理，使其卵巢较在自然状态下有大量卵泡发育的技术。3.3体外胚胎从供体所采集的卵丘卵母

3、细胞复合体经体外成熟、体外受精及体外胚胎发育培养所获得的胚胎。4供体选择要求健康、体况发育良好、系谱资料完整清楚、出生4～10周龄的雌性羔羊。5诱导卵泡发育5.1所使用的生殖激素促卵泡素（FSH）和孕马血清促性腺激素（PMSG）。5.2诱导卵泡发育方法1DB13/T2051—2014间隔12h对供体连续4次进行等剂量肌肉注射FSH。FSH的总剂量：FSH（宁波市三生药业有限公司）为280～300IU，FSH（加拿大BIONICHE）为160～200mg。在第一次注射FSH的同时，肌肉注射PMSG500IU。6采集卵丘卵母细胞复合体6.1采集时间于最后一次注射FSH后的12h～

4、16h。6.2采卵前准备6.2.1采卵室及检卵室准备采集前，先将采卵室及检卵室打扫干净，用来苏水等消毒液泼洒地面，关闭门窗，紫外灯照射消毒。采卵室及检卵室适宜温度为20℃～25℃。6.2.2手术器材及药品准备6.2.2.1手术器材6.2.2.1.1手术器械（1套）：手术刀柄1把，20号刀片，直尖手术剪2把，无齿手术镊1把，有齿手术镊1把，止血钳4把（2把弯止血钳、2把直止血钳），持针钳2把（握式持针钳或钳式持针钳），创巾钳6把；止血纱布6块（以上器械用0.1％新洁尔灭溶液在解剖盘内浸泡消毒30min或高压消毒15～20min），缝合针（弯三棱针2个、弯圆针2个），缝合线（10

5、号、7号若干），针盒1个（以上器械用70％酒精在针盒内浸泡30min）；剪毛剪1把，剃须刀1片，大止血钳1把或人用剃须刀具1个（剃毛用）、保定架2个、水浴锅1个、500mL的喷壶3个，15mL的试管架1个，15mL离心管若干、一次性创巾若干，一次性注射器若干（20mL、10mL、5mL、2mL、1mL），18G注射针头若干。6.2.2.2药品含0.9%NaCl的生理盐水，含有0.96万IU青霉素/mL和0.2万IU/mL链霉素的生理盐水，速眠新及苏醒灵，注射用青霉素和链霉素，75％酒精棉球，5％碘酊棉球，碘甘油，5％新洁尔灭溶液，以及采卵液（每只供体准备100mL）。采卵液配

6、方：9.5g/LTCM199+5mmol/LNaHCO+10mmol/LHEPES+10mmol/LHEPES-Na+0.665g/L3肝素钠+20ml/LFBS+0.065g/L青霉素+0.05g/L链霉素。6.2.3手术人员准备手术人员（术者、助手）戴好手术帽和口罩，洗净手及手臂，穿戴好手术衣，手、手臂在盛有0.1％新洁尔灭溶液的泡手桶中浸泡5min，除去手上多余药液，稍后自然干燥，再戴上干燥的无菌手套。6.3保定与麻醉供体肌肉注射速眠新进行全身麻醉，剂量：杜泊绵羊、无角道塞特、夏洛来、特克塞尔等肉用绵羊为0.015mL～0.022mL/kg体重；波尔山羊等肉用山羊为0.

7、020mL～0.030mL/kg体重；奶山羊、绒山羊为0.023mL～0.033mL/kg体重；小尾寒羊为0.017mL～0.023mL/kg体重。供体麻醉后在手术架上仰卧保定。6.4术部除毛2DB13/T2051—2014手术部位（简称“术部”）是在脐后部至乳房基部腹白线处或腹白线旁。先用剪毛剪将术部羊毛剪22短，再用温肥皂水浸湿，然后用剃须刀将毛剃净，术部剃毛范围为15cm～20cm，用清水洗净擦干。6.5术部消毒术部用5%碘酊棉球涂擦，待其干燥后，用75%酒精棉球脱碘。然后用有孔创巾覆盖于术部区域