单分子与纳米生物实验室

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1、ReviewFRET在生物科学中的应用郑文富学号：10389027单分子与纳米生物实验室荧光共振能量转移（FRET）(Fluorescence/Försterresonanceenergytransfer)是比较分子间距离与分子直径的有效工具，广泛用于研究各种涉及分子间距离变化的生物现象，可以定量测量两个发光基团之间的距离，在蛋白质空间构象、蛋白与蛋白间相互作用、核酸与蛋白间相互作用以及其它一些方面的研究中得到广泛应用。1-3当生色团被光照时，被照射激发的分子可以通过散发能量来返回到基态。光能可被生-15-9色团在10秒内吸收而在10秒内再发射出来。然而，也有可能被激发分子并不

2、发光而将能量传递给别的生色团或是另外的荧光素，这些荧光素可以在相同的时间量级内发荧光，这后一种现象称为荧光共振能量转移（FRET）。FRET是通过分子间的电偶极相互作用将供体激发态能量转移给受体激发态的过程，是一种非辐射跃迁。当FRET发生时，供体的荧光减-9弱而受体的荧光增强。荧光素在激发态的寿命是10秒，在发射荧光、非辐射性发射和将激发能传递给周围的介质三者之间存在竞争。如果荧光能量转移发生，激发态能就会从供体传递给受体，荧光光子由受体发出。FRET发生的基本条件是：①、供体和受体的距离必须达到一定的数量级（20-100À）②、受体的吸收光谱必须与供体的发射光谱相重叠。（见

3、图1）③、供体和受体能量转移偶极子的方向必须近似地平行。Förster依据供体与受体的相对距离和偶极子的方向关系解释1-3，了FRET发生的原理。能量转移的效率是有一些参数决定的下面方程给出了能量转移的产效：666E=R0/（R+R0）R是供体与受体在生物条件下的距离R0是每对供受体之间的一个常数，代表能量转移的效率为50％时的距离。R0称为Förster临界距离，由下列公式计算：23241/6R0=[8.8х10•κ•nQYD•J(λ)]À22κ表示偶极子方向因子（范围从0-4；当供体和受体的排列是随机时κ=2/3）QYD表示在没有受体时供体的量子产量n表示折射系数J(λ)表

4、示光谱重叠积分J(λ)其中：=受体淬灭系数=总荧光强度中供体荧光强度部分1图1：FRET光谱重叠积分示意图能量转移发生在供体受体距离在0.5-10nM之间。供受体分子之间存在电荷-电荷库仑力作用，激发态的供体对于受体的作用是偶极子-偶极子的电动力学空间作用。如果条件具备：供受体的激发谱、吸收谱相互重叠，供体的量子产量和受体的吸收系数适当、方向合适就极有可能发生能量转移。能量转移的速率和供受体的距离有函授关系（与距离达到六次方的倒数成比例）能量转移后供体回到基态、光子发射可能性减少，供体的激发态寿命减短，受体可因受激发而发出光子，尽管起初是由供体激发的，我们检测到的荧光光谱却是由

5、受体发出的。我们可以从能量转移的速率和效率得到许多信息：可以知道供受体的距离很近（约0.5-10nM），得到距离的数量，有时能得到它们的方位关系。一般地每一对供受体可被分别考虑，每对都由于其特殊的距离和方位和光谱特征而表现出其能量转移的可能性，这就使我们能直接掌握分子的结构、空间构象变化和结合反应。如果我们观察的是一个分子集合，我们得到的是对应于相关参数分配的光谱信息。这种光谱参数分配能提供分子构象分配情况信息。能量转移是一个时间依赖过程，我们能够得到的有关发生在能量转移和荧光衰减时间数量级、分子运动和分子转动的动力学信息，这个数量级可以是皮秒到毫秒数量级。这是一个非常广的时间

6、区段，可以灵活地选择生色团。在所有荧光技术中，FRET的独特性就在于此。在多数情况下，供体与受体染料是不同的，FRET的可以通过对供体的荧光淬灭和受体的敏化荧光的产生来检测。当供体和受体是相同的染料时，可通过荧光的去极化来检测。因为R0是受环境影响的，在实际中具体的实验条件下它的值是可变化的。不产生荧光的受体比如dabcyl和QSY染料的优势在于能够减少可能由受体本身直接产生的荧光背景的干扰。对于相互作用的分子之间的FRET分析往往受到供受体荧光素各组分之间的相互影响并影响FRET的效率。比如：如果所有的供体都与一个受体结合了，供体荧光寿命就随两者距离的改变而呈一次幂变化。但在

7、一种混合状态，有不同的供受体距离或有未结合的供体得到的是荧光寿命衰减的多次幂变化，未发生作用的分子对FRET的效率产生影响。。高的FRET效率和低的相互作用分子浓度可导致一个错误推论认为在供体受体之间有小的或没有相互作用。如果蛋白相互作用的细胞内定位空间大小超出了显微成像的分辨率，那么我们获得的是一种16平均值，也会导致对生物效应的错误解释。多光子显微技术尤其是双光子技术比共聚焦显微镜更有优势。使用近红外激发光引起探针荧光素的非线性吸收，因而激发光在聚焦镜平面的强度被限制在一个小的剂量范围内