国家标准：gbt 27539-2011 动物流感检测 a型流感病毒通用荧光rt-pcr检测方法

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1、ICS11．220B41a亘中华人民共和国国家标准GB／T27539--2011动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法Animalinfluenzadetection--Methodofreal-timeRT-PCRfordetectionofinfluenzavirusA2011·1I-21发布2012-03-01实施宰瞀鹳鬻瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅19标准分享网www.bzfxw.com免费下载前言GB／T27539--20”本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本

2、标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(sAC／TC181)归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、深圳匹基生物工程有限公司。本标准主要起草人：汪琳、林志雄、周琦、高志强、陈茹、乔彩霞、蒲静、杨伟、梁成珠。标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法本标准规定了A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测的操作方法。本标准适用于活动物及其产品中A型流感病毒的检测。2规范性引用文件

3、GB／T27539--2011下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB／T19495．2转基因产品检测实验室技术要求GB／T27401实验室质量控制规范动物检疫SN／T1330进出口生、熟毛皮检验规程3缩略语下列缩略语适用于本文件。ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(Ctvalue)DEP

4、C：焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)PBS：磷酸盐缓冲液(配方见附录A)(phosphatebuffersaline)RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)RT-PCR：反转录一聚合酶链式反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction)4原理流感病毒(influenzavirus)属正粘病毒科，根据抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)型。乙型变异性较弱、丙型抗原性比较稳定，仅感染人类；甲(A)型抗原

5、变异性最强，感染人类和其他动物，常引起世界性大流行。编码基质蛋白的M基因是A型流感病毒共有且较保守。采用Taqman技术，针对M基因中特定序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针，探针的5’端标记报告荧光基团(R)，3’端标记淬灭荧光基团(Q)。在PCR退火阶段，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；在PCR延伸阶段，Taq酶在引物的引导下沿着模板链合成新链，当链的延伸进行到探针结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，Taq

6、酶发挥5’一3’外切核酸酶的功能，将探针水解成单核苷酸，标记在探针上的R基团就游离出来，R所发出的荧光不为Q所吸收而被检测仪所接收，随着PCR反应的进行，PCR产物量与荧光信号呈现正比关系。标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27539--20115材料与试剂5．1仪器设备5．1．1荧光PCR检测仪。5．1．2高速微型离心机(离心速度12000r／min以上)。5．1．3台式高速离心机(离心速度3000r／min以上)。5．2试剂5．2．1除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验室用水符合

7、GB／T6682的要求。所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)分装。5．2．2DEPC水(见附录B)。5．2．3Trizol。5．2．4氯仿。5．2．5异丙醇：一20℃预冷。5．2．6PBS：(121-4-2)℃，15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000U／raL。5．2．775％乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，--20℃预冷。5．2．8A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测引物、探针序列、反应液体系组成及使用注意事项见附录B。6抽样6．1采样工具下列采

8、样工具应该经(121士2)℃，15rain高压灭菌并烘干：——棉拭子；——剪刀；——镊子；——注射器；——1．5mL离心管；——研钵。6．2样品采集6．2．1活动物取鼻拭子、咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：—～取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮2次～3次并旋转，取鼻腔分泌液；——取咽喉拭子时将拭子深人喉头口及上颚裂来回刮2次～3次并旋转，取咽喉分泌液——取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔旋