国家标准：gb 5413.20-2013 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定

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1、中华人民共和国国家标准GB5413.20—2013食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定2013-11-29发布2014-06-01实施GB5413.20—2013前言本标准代替GB/T5413.20—1997《婴幼儿配方食品和乳粉胆碱的测定》。本标准与GB/T5413.20—1997相比，主要变化如下：——修改了标准的名称；——修改了用于酶反应的显色剂成分；——增加了第二法雷氏盐分光光度法。IGB5413.20—2013食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定1范围本标准规定了婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定方法。本标准适用于婴幼儿

2、食品和乳品中胆碱的测定。第一法酶比色法2原理试样中的胆碱经酸水解后变成游离态的胆碱，再经酶氧化后与显色剂反应生成有色物质，其颜色的深浅在一定浓度范围内与胆碱含量成正比。3试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。3.1试剂3.1.1三羟甲基氨基甲烷[(CH2OH)3CNH2]。3.1.2苯酚(C6H5OH)。3.1.3浓盐酸(HCl)。3.1.4氢氧化钠(NaOH)。3.1.5胆碱氧化酶：置于-20℃保存。3.1.6过氧化物酶：置于2℃~8℃保存。3.1.74-氨基安替比林(C11H13N3O)

3、。3.1.8磷脂酶D：置于-20℃保存。3.2试剂配制3.2.1盐酸(1mol/L)：量取85mL浓盐酸加水稀释至1000mL。3.2.2盐酸(3mol/L)：量取125mL浓盐酸加水稀释至500mL。3.2.3Tris缓冲溶液（0.05mol/L）：pH=8.0±0.2。称取6.057g三羟甲基氨基甲烷溶入500mL蒸馏水中，用1mol/L盐酸调pH至8.0±0.2，用蒸馏水定容至1000mL。此溶液在4℃冰箱中可保存一个月。3.2.4用于酶反应的显色剂：取100~120活力单位的胆碱氧化酶、250~280活力单位的过氧化物酶、75个~1

4、00个活力单位的磷脂酶D、15mg4-氨基安替比林，50mg苯酚置于100mL的容量瓶中，用0.05mol/LTris缓冲溶液稀释至刻度。临用时配制。3.2.5氢氧化钠溶液(500g/L)：称取500g氢氧化钠，溶于水并稀释至1000mL。1GB5413.20—20133.3标准品胆碱酒石酸氢盐标准品（C9H19NO7）：纯度≥99%。3.4标准溶液配制3.4.1胆碱氢氧化物标准贮备溶液（2.5mg/mL）：称取在102℃±2℃烘至恒重的胆碱酒石酸氢盐523mg置于100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。冷藏于4℃±2℃冰箱中，保存不超过1

5、周。3.4.2胆碱氢氧化物标准工作溶液（250µg/mL）：吸取10.0mL标准贮备溶液于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度。临用时配制。4仪器和设备4.1天平：感量为0.01g和0.1mg。4.2恒温水浴锅：温度可控制在70℃±2℃和37℃±2℃。4.3pH计：精度0.01。4.4分光光度计。5分析步骤5.1试样制备5.1.1固体试样称取5g（精确到0.01g）混合均匀的试样，于100mL的锥形瓶中，加入30mL盐酸溶液（3.2.1）。5.1.2液体试样称取20g（精确到0.01g）混合均匀的试样，于100mL的锥形瓶中，加入10mL盐酸

6、溶液（3.2.2）。5.1.3水解将装有试样的容器放在70℃水浴中，加塞混匀，水解3h（每隔30min振摇一次），冷却。用氢氧化钠溶液调pH为3.5～4.0，转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。5.1.4过滤过滤水解液（5.1.3）。滤液应是澄清的，否则，用0.45μm的滤膜再次过滤。滤液放在4℃的冰箱中可以保存3d。5.2测定5.2.1标准曲线的制作分别吸取2mL、4mL、6mL、8mL胆碱氢氧化物标准工作溶液于10mL的容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。准备6支试管，一个试管用作试剂空白（A），另五支试管由1至5编号，分别用于标准溶液

7、和标准溶液的四个稀释度。按表1加入试剂。2GB5413.20—2013表1制作标准曲线时的试剂添加量单位为毫升试剂管A管1管2管3管4管5稀释度1/（50μg/mL）—0.100————稀释度2/（100μg/mL）——0.100———稀释度3/（150μg/mL）———0.100——稀释度4/（200μg/mL）————0.100—标准溶液/（250μg/mL）—————0.100蒸馏水0.100—————发色剂3.003.003.003.003.003.00用密封保护膜盖住试管，混匀，把试管置于37℃水浴中保温反应15min。5.2.2

8、试样的测定将每个试样准备2支试管（B，C），按表2加入试剂。表2测定试样时的试剂添加量单位为毫升试管B试管C试剂滤液空白试样待分析滤液0.1000.100蒸馏水3.00—发色剂—