SN∕T 3174-2012 向日葵黑茎病菌检疫鉴定方法(出入境检验检疫)

《SN∕T 3174-2012 向日葵黑茎病菌检疫鉴定方法(出入境检验检疫)》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3174-2012向日葵黑茎病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofLeptosphαenαlindquistiiFrezzi2012-05-07发布2012-11-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检瘦总局SN/T3174-2012目IJ1==1本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任o本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共

2、和国天津出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:罗加风、刘跃庭、吴品珊、廖芳、刘鹏、张裕君。ISN/T3174-2012向日葵黑茎病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定f向H葵黑斗q内菌CLe户tοφhaerialindq川stiiFrezzi)C参见附录A)分离珩养、到c讷J忡测定、序列比对的实盼步骤歧!鉴定方法等。水标汗ì;Ì芷川JTI句口葵种子rlrI句口葵黑ZE病的的检疫鉴Æ以及lúJ口奖;'''1豆lúJ口葵黑ZE病的的田时检测。2向日葵黑茎病菌基本信息学名:Leþtosρhaerialindquist

3、iiFrezzi无性世代学名:Phomamacdo川ldiiBocrma.英文名:SunflowerPhom乱blackstem分类地位:向日葵黑茎病菌属真菌界(Fungi)，子囊菌门CAscomycota)，腔菌纲CLcculoascomycctcs)，格子包腔菌目(Plco叩oralc时，格子包腔菌科(Plcosporaccac)，小球腔菌属(Lψlozρhaeria);无性态属于有丝分裂于包子真菌CSphaeropsidales)，腔砸纲CCoelomycetes)，球壳咀曰CSphaeropsidales)，茎点霉属C

4、Phoma)。3方法原理病原菌分离培养性状、病菌形态学特征、对奇主的致病性、症状表现(参见附录B)及病菌ITS1/ITS4和八ctFl/Rl序列比对结果作为向日葵黑茎病菌的检疫鉴定依据。4器材和试剂4.1器材灭菌培养皿(直径90mm~100mm)、三角瓶、慑子、手术剪、手术刀、接种针、一次性注射器(lmL)、棉纱、脱脂棉、酒精灯、塑料研杆、可调微量加样器。体视显做镜、生物显做镜、超净工作台、培养箱(24'c土1'C)、电子天平(感量0.01g)、高压灭菌偶、常规冰箱(-20'C)、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心

5、机、恒温水浴锅o4.2试剂和培养基乙一股四乙酸(EDTA)，十~.'~完某帧酸铀CSDS)、Tri日-HCl、异戊醉、三言过甲优、乙醉、氧化佣、氯化镜、蛋白酶K、寻物ITSl/ITS4和IActFl/RLT叫聚合酣非分子I1物学试剂。或川植物组织及真的基因细提取试剂命提取D:'JAo马铃薯、世j萄糖、琼脂、青霉素、链君主、乳酸、1.0%次氯酸饷(NaC10)。酸'性马铃薯培养基APDACpH4.5~5.0)、APDA选拌件培养基(参见附录C)。SN/T3174-20125检验方法5.1疑似材料挑选5.1.1种子中疑似材料挑选将

6、待检样品倒入洁净白瓷盘内.挑选干瘪、弱小、畸形的可疑病种子和植株残体作为实验材料.植株残体包括茎杆、H十柄、花盘等。5.1.2回间发病植株材料采集向日葵生长期，特别是生长后期，重点检查植株中下部叶柄处茎部有无边缘清晰黑褐色至黑色椭圆形或梭形讷斑(参见国B.3)，发现口l疑柏株，哉取带的斑的主轩，(日[1j兰同实事:γ伞'进行的南分离11'i养。5.2分离培养5.2.1实验材料前处理田时采集的材料，川l门米水充分严l'洗，取病健交界革部组织，剪成约O.4cmXO.4cm小块，川j1.0%的次氯酸的溶液消毒5min.无菌水冲洗3

7、次.灭菌滤纸吸干水分后培养。挑选出的植株残体剪成0.4巳nl.4cm小块，用纱布包好，整粒可疑种子用纱布包好，放入1.0%的次氯酸制溶液中，消毒5min.灭菌水冲洗3次，种子于无菌条件下25oc保湿放置24h，再在-200C下冰冻24h后培养，经表面消毒后的植株残体，用灭菌滤纸吸干水分直接培养。5.2.2病菌分离培养前处理后的实验材料置于APDA选择性培养基平板上，每皿放置3粒~/l粒或3块~1块.25oC,12h光照黑暗交替培养。培养3d后开始观察，发现乳白色或白色可疑菌落，立即用人PDA分离纯化，并在无菌条件下挑取少许

8、制片，显微镜下观测菌丝形态和有无分生于包子器产生o记录菌落培养性状，包括菌落生长速度、颜色，形状等，在显微镜下测量记录分生面子器、分生于包子的形状及大小等O5.3致病性测定车1M1'"(22oC~2/1oC)用火雨土种抽向H葵种子，有条件最好选用!~梢的品种，如l阿拟廷SH7