新型H7N9禽流感病毒感染后肺部保护屏障的改变

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分类号：R56学校代码：10062密级：学号：2015602232硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：新型H7N9禽流感病毒感染后肺部保护屏障的改变TITLE:AlterationinlungprotectionbarrierduringAvian-OriginInfluenzaA(H7N9)Virusinfection一级学科：临床医学二级学科：内科学呼吸系病论文作者：王巧兴导师：吴琦教授天津医科大学研究生院二0一八年五月 分类号：R56学校代码：10062密级：学号：2015602232学位类别：科学学位专业学位学科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：新型H7N9禽流感病毒感染后肺部保护屏障的改变TITLE:AlterationinlungprotectionbarrierduringAvian-OriginInfluenzaA(H7N9)Virusinfection一级学科：临床医学二级学科：内科学呼吸系病论文作者：王巧兴导师：吴琦教授导师组成员：孙昕主任医师于洪志副主任医师天津医科大学研究生院二0一八年五月 中文摘要研究目的：利用分子生物学技术，检测人感染H7N9禽流感患者肺部粘蛋白、紧密连接蛋白及肺泡表面活性蛋白的改变，以初步探究人感染H7N9禽流感患者气道粘液纤毛清除功能、肺上皮细胞屏障功能、肺泡结构稳定性及肺部固有免疫反应的改变。研究方法：回顾性分析人感染H7N9禽流感患者的病例资料，分析总结其个人资料、临床表现、化验检查等，为疾病的诊治提供一定的依据；利用HE染色方法观察人感染H7N9禽流感患者肺部病理改变；同时，利用qRT-PCR法检测其肺部粘蛋白、紧密连接蛋白及肺表面活性蛋白的表达情况，初步了解H7N9禽流感病毒感染后气道粘液纤毛清除功能、肺上皮细胞屏障功能、肺泡结构稳定性及肺部固有免疫反应的改变。研究结果：（1）本课题收集的4例人感染H7N9禽流感患者均有禽类接触史，均为患有基础疾病的中老年人。主要临床表现有高热、咳嗽、气短、呼吸困难、胸闷、胸痛、咯血、腹痛等。4例患者均出现感染性休克及ARDS并发症，部分患者还出现急性肾损伤、脑病和横纹肌溶解等。胸部X线及胸部CT都表现为双侧肺实变及磨玻璃样改变，部分患者出现胸腔积液。实验室检测结果均表现为淋巴细胞及血小板减低。（2）H7N9禽流感病毒感染后，肺部可见肺出血及后期纤维组织增生。气道粘蛋白MUC2、MUC5B和MUC5ACmRNA相对表达量均增加。气道紧密连接蛋白CLDN1、CLDN5、CLDN7和CLDN18的mRNA相对表达量均降低，CLDN3mRNA相对表达量明显升高。肺泡表面活性蛋白SPA、SPC和SPDmRNA相对表达量明显降低，而SPBmRNA相对表达量明显升高。研究结论：（1）H7N9禽流感病毒感染多与直接接触家禽有关，好发于中老年人群，尤其是患有基础疾病的人群，这可能与这些人的免疫功能低下有关。人感染H7N9禽流感患者多表现为持续高热、咳嗽、呼吸困难等症状，并可迅速进展为感染性休克、ARDS、急性肾功能损伤等。人感染H7N9禽流感患者胸部影像学为单侧或双侧肺实变或磨玻璃样改变，实验室检查可呈现为淋巴细胞减少症和血小板减少症。I （2）人感染H7N9禽流感患者肺部典型的病理表现为肺出血及后期弥漫性肺损伤后纤维增生。H7N9禽流感病毒感染后，肺部的防御保护屏障即气道粘液纤毛清除功能、肺上皮细胞屏障功能、肺泡结构的稳定性及肺部固有免疫反应可能发生改变。总之，人感染H7N9禽流感流行病学有一定特点，肺部病理改变明显，肺部的防御保护屏障即气道粘液纤毛清除功能、肺上皮细胞屏障功能、肺泡结构的稳定性及肺部固有免疫反应可能发生改变。关键词：H7N9禽流感病毒粘蛋白紧密连接表面活性蛋白粘液纤毛清除功能II AbstractObjective:Thisresearchhadmonitoredthechangesofmucins,tightjunctionproteinandsurfactantproteininlunginfectedwithH7N9virusandcontrolgroupbymolecularbiologicaltechnique,thustoexplorethealterationofairwaymucousciliaryclearancefunction,thelungepithelialbarrierfunctionandthestabilityofalveolarstructure.Method:Retrospectivelyanalysethepersonaldata,clinicalmanifestations,laboratorytestsandsoon,ofthecasesofH7N9patients,providingacertainbasisofthediagnosisandthetreatmentofthedisease.Comparethepathologicalchangesoflung,liverandmyocardiumbetweenH7N9groupandcontrolgroupwithHEstaining.Meanwhile,comparetheexpressionofmRNAofmucins,tightjunctionproteinandsurfactantproteinbyRT-PCR,thuspreliminarystudingthealterationofairwaymucousciliaryclearancefunction,thelungepithelialbarrierfunctionandthestabilityofalveolarstructureinlunginfectedH7N9virus.Results:(1)Allofthe4patients,collectedinthisstudy,hadthehistoryofpoultrycontact.Andallofthemhadbasicdiseasesandbelongtomiddleandoldagegroup.Theirmainclinicalmanifestationsincludedhighfever,cough,shortnessofbreath,dyspnea,chestdistress,chestpain,hemoptysis,abdominalpain,etc.Allofthe4patientssufferedfromsepticshockandARDS,andcouldalsohaveacuterenalinjury,encephalopathyandrhabdomyolysis.ThechestX-rayandchestCTofthe4patientsshowedbilateralpulmonaryconsolidationandGround-GlassOpacity,evencombinedwiththesingleorbilateralpleuraleffusion.Allofthe4patientspresentlymphocytopeniaandthrombocytopenia.(2)WheninfectedwiththeH7N9virus,pulmonaryalveolarhemorrhageandfibroustissuehyperplasiafollowedcanbeseeninthelung;therearemanyvacuolarfattydegenerationintheliver.TherelativemRNAexpressionofairwaymucinsMUC2,MUC5BandMUC5ACmaybeincreased.TherelativeexpressionofmRNAwasdecreasedinCLDN1,CLDN5,CLDN7andCLDN8,andtherelativeexpressionofIII CLDN3mRNAwassignificantlyincreased.TherelativeexpressionofSFTPA,SFTPCandSFTPDmRNAwassignificantlydecreased,whileSFTPBmRNAwassignificantlyincreased.Conclusions:（1）TheinfectionofH7N9viruswascloselyassociatedwithdirectcontactwithpoultryorthewaterofpoultrycontamination.TheH7N9virusismoreeasiertoinfectthemiddleold-age,especiallythosewithbasicdiseases,whichmayberelatedtotheirlowimmunefunction.Themainclinicalmanifestationsincludepersistentfever,coughanddyspneaandsoon,andcanberapidlydevelopedintosepticshock,ARDS,acuterenalimpairment,etc.ThechestimagingfindingsinpatientsinfectedwithH7N9virusaresingleorbilateralpulmonaryconsolidationandground-glassopacity;laboratoryexaminationcanpresentlymphocytopeniaandthrombocytopenia.(2)ThetypicalpulmonarypathologyofpatientsinfectedwithH7N9virusareacutediffusealveolarinjuryandmassivepulmonaryalveolarcell,alveolarinterstitialhemorrhageanddiffusepulmonaryinjuryinthelaterperiod.Thelungdefensebarrierofairwaymucousciliaryclearancefunctionandlungepithelialcellbarrierfunction,thestabilityofalveolarstructuremaychangewheninfectedH7N9virus.Inbrief,therearecertaincharacteristicsoftheepidemiologyofH7N9virusinfection.Thepulmonarypathologyissignificantly.Thelungdefensebarrierofairwaymucousciliaryclearancefunctionandlungepithelialcellbarrierfunction,thestabilityofalveolarstructuremaychangewheninfectedH7N9virus.Keywords：H7N9virusmucintightjunctionproteinsurfactantproteinMCCIV 目录中文摘要...........................................................IAbstract.........................................................III缩略语/符号说明..................................................VII前言...............................................................1研究现状、成果..................................................1研究目的、方法..................................................4一、人感染H7N9禽流感病例资料收集与分析............................51.1对象和方法..................................................51.1.1研究对象...............................................51.1.2研究方法...............................................51.2结果........................................................51.2.1一般资料...............................................51.2.2临床表现、并发症及预后.................................61.2.3影像学改变.............................................81.2.4实验室检查.............................................81.3讨论.......................................................121.3.1人感染H7N9禽流感流行病学............................121.3.2人感染H7N9禽流感临床表现、并发症....................121.3.3人感染H7N9禽流感影像学及实验室检查..................131.4小结.......................................................13二、人感染H7N9禽流感病例组织标本的病理改变.......................142.1对象和方法.................................................152.1.1人感染H7N9禽流感患者及对照组标本收集.................152.1.2组织标本制备及HE染色................................152.1.3总RNA提取及实时荧光定量PCR..........................172.2结果.......................................................222.2.1H7N9组和对照组肺组织HE染色镜下改变..................222.2.2H7N9组及对照组肺部粘蛋白相对表达量的改变............232.2.3H7N9组及对照组肺部紧密连接蛋白相对表达量的改变......232.2.4H7N9组及对照组肺部表面活性蛋白相对表达量的改变......242.3讨论.......................................................242.3.1人感染H7N9禽流感患者肺部病理表现....................242.3.2人感染H7N9禽流感患者气道粘蛋白改变..................242.3.3人感染H7N9禽流感肺部紧密连接蛋白改变................262.3.4人感染H7N9禽流感肺表面活性蛋白改变..................282.4小结.......................................................31结论..............................................................32参考文献..........................................................33V 发表论文和参加科研情况说明........................................42附录..............................................................43综述..............................................................45人感染H7N9禽流感..............................................45综述参考文献...................................................50致谢..............................................................57VI 缩略语/符号说明英文符号英文全称中文全称HBPHighbloodpressure高血压CHDCoronaryheartdisease冠状动脉性心脏病COPDChronicobstructivepulmonarydisease慢性阻塞性肺病CPHDChronicpulmonaryheartdisease慢性肺源性心脏病ARDSAcuterespiratorydistresssyndrome急性呼吸窘迫综合征MCCMucociliaryclearance粘液纤毛清除功能RSVRespiratorysyncytialvirus呼吸道合胞病毒hMPVHumanmetapneumovirus人类偏肺病毒TJTightjunction紧密连接AFCAlveolarfluidclearance肺泡液体清除率PAR2Activatingproteinkinasereceptor2激活蛋白激酶受体2TERTransmembraneresistance跨膜电阻MDCKMadin-DarbycaninekidneyMadin-Darby犬肾细胞EpCAMEpithelialcelladhesionmolecule上皮细胞黏附分子TNF-αTumornecrosisfactoralpha肿瘤坏死因子αLPSLipopolysaccharide脂多醣BALFBronchoalveolarlavagefluid支气管肺泡灌洗液IAVinfluenzaAvirus甲型流感病毒TSLPThymicstromallymphocyte胸腺基质淋巴细胞素PPARγPeroxidaseactivereceptorγ过氧化物酶活性受体γVII IFNγInterferonγ干扰素γAT1alveolartypeⅠcellⅠ型肺泡上皮细胞AT2alveolartypeⅡcellⅡ型肺泡上皮细胞TEMTransmissionelectronmicroscope透射电镜AIVAvianinfluenzavirus禽流感病毒ILDInterstitiallungdisease间质性肺病VIII 前言研究现状、成果2013年3月，上海和安徽的3个居民先后出现进行性加重的下呼吸道感染，最后被诊断为感染了一种新型重组甲型禽流感病毒——H7N9禽流感病毒[1]。此后人感染H7N9禽流感患者在我国很多地区陆续出现，至今共出现5次流行高峰，其中以长江三角洲及珠江三角洲等近海地区发病人数最多[2]，且传播呈现从东到西的趋势[2]。物种分析结果表明新型重组甲型禽流感病毒H7N9至少是三重基因重组的产物，其中有6个内部基因（PB1、PB2、PA、NP、M和NS）与燕雀中的甲型禽流感病毒H9N2基因相近，HA基因与鸭中的甲型禽流感病毒H7N3基因相近，NA基因与野鸟中的甲型禽流感病毒H7N9基因相近[1]。H7N9禽流感病毒可存在多种基因突变使得H7N9禽流感病毒致病力增强及耐药性增加，如H7N9禽流感病毒的HA基因可发生Q226L及G186V突变，由此可增强病毒对α-2,6型受体（唾液酸受体）的结合能力[3]；HA基因150环上发生T160A突变可以减弱病毒与α-2,3型受体的结合能力[3]；而禽类主要表达唾液酸α-2,3型受体，人类唾液酸α-2,6型受体在气管、支气管丰富表达，Q226L、G186V及T160A突变使H7N9禽流感病毒由禽类传染人的传播途径成了可能。M2蛋白发生S31N置换，导致H7N9禽流感病毒对金刚烷胺等M2离子通道阻滞剂的抵抗[4]。人感染H7N9禽流感轻症患者一般表现为流感样症状，如发热、咳嗽。重症患者可迅速进展为重症肺炎，并可迅速出现急性呼吸窘迫综合征、感染性休克、横纹肌溶解、脑部病变、急性肾损伤及继发感染等并发症，最终可导致死亡[5]。胸部影像学主要表现为单侧或双侧的肺实变或磨玻璃样改变，还可伴有胸腔积液、气胸、纵膈气肿等[6]。目前，有很多关于人感染H7N9禽流感发病机制方面的研究，包括细胞因子和内皮细胞等方向，但其发病机制仍不清楚。研究发现急性期患者血清中细胞因子及趋化因子MIG、IP-10、MCP-1、IL-8、IL-6等显著增高，提示“细胞因子风暴”可能与患者重症感染相关[7]；致死病例中血清IL-6、IL-8、IL-10和MIP-1β1 的浓度较幸存者高[8]；人感染H7N9禽流感患者中，血浆血管紧张素Ⅱ的浓度与疾病严重程度相关并可提示预后不良[9]。H7N9禽流感病毒可以感染肺上皮细胞和肺内皮细胞，但只在上皮细胞内高效复制，提示H7N9禽流感病毒感染后肺部的严重病变可能与肺上皮细胞的高病毒载量和肺内皮细胞内的宿主反应有关[10]。尸检发现患者肺内表现为肺急性渗出性炎性改变、肺出血、弥漫性肺泡损伤、透明膜形成及后期肺纤维化[11]。随着人感染H7N9禽流感病例数持续增长及间断出现的流行高峰，人感染H7N9禽流感的病理改变及发病机制亟需进一步研究。人体的呼吸系统具有天然的防御保护屏障，其中气道粘液纤毛清除功能（MCC）是重要的防御保护屏障之一[12]。MCC主要由纤毛和粘液两部分构成，气道粘液在维持肺部健康和肺部功能正常方面起着重要作用，气道粘液可以粘附吸入的微生物及粉尘等有害物质，然后借助纤毛转运系统加以清除[13]，从而起到防御和保护作用，还可以防止水分的丢失。气道粘液主要由粘蛋白、脂、水和无机盐等组成。MCC功能的正常维持主要由粘液的粘弹性决定，而粘液的粘弹性主要取决于粘蛋白的质和量。粘蛋白是一类富含寡糖链的大分子糖蛋白，主要由气道杯状细胞、粘膜下腺或浆细胞合成，被分泌到细胞表面或被固定在细胞膜上。粘蛋白主要由寡糖链和多肽骨架构成，寡糖链和多肽骨架分别由糖基转移酶基因及粘蛋白基因表达而得[14]。附着在气道上皮微绒毛和纤毛上的细胞表面相关粘蛋白形成渗透屏障，保护纤毛周围层、协调纤毛运动，而分泌型粘蛋白则保留水分并形成粘弹性凝胶[15]；膜相关型和分泌型的粘蛋白相互作用、协调合作形成了粘液纤毛清除机制。目前共发现21种粘蛋白基因，其中14种可以在气道表达[16]。气道上皮细胞分泌的粘蛋白主要有粘蛋白2（MUC2）、粘蛋白5B（MUC5B）、粘蛋白5AC（MUC5AC）等[17]。不同的粘蛋白可能引起不同的免疫反应，人感染H7N9禽流感患者肺部粘蛋白的表达情况目前尚未可知。气道和肺泡的表面覆盖有上皮细胞层，形成防御屏障阻止病原微生物的入侵并可将其从气道清除，是呼吸系统的又一重要防御保护屏障，此外，上皮细胞层可以引发并协调免疫反应[18]。肺上皮细胞的这种屏障功能主要由紧密连接（TJ）形成。紧密连接由蛋白质和脂质组成，主要成分是蛋白质，这些蛋白复合物形成了相邻上皮细胞间的封闭界面[19]。TJ还能维持细胞极性，调节各种细胞内信号，通过影响传输蛋白和通道蛋白的表达来控制跨上皮细胞的运输，所2 有这些功能对于肺部细胞环境之间的物质交换是至关重要的[20]。上皮细胞间有两个主要的转运途径——跨细胞转运和细胞旁路转运。跨细胞转运途径依赖于离子通道和转运体在基底侧和基底外侧膜的极化分布，如Na+通过基底侧膜的钠通道进入细胞，并通过基底外侧膜的Na+/K+-ATPase释放到间质中。细胞旁路转运途径是在邻近的上皮细胞的侧膜穿过细胞外的隔层进行转运。它是依赖于上皮细胞层的化学和电化学梯度的扩散过程。这种细胞旁路转运途径是在相邻细胞间的顶端侧膜的细胞间接口形成的，由异源性蛋白复合物控制的。这些复合物被称为紧密连接复合物（TJs），封闭上皮细胞的顶端侧膜，能选择性地调节水、小分子、电解质等细胞间的运输，可以使上皮细胞的通透性远远小于内皮细胞屏障[21]。TJ的损伤是肺炎性反应中导致上皮细胞屏障功能破坏的主要因素。TJ的功能受损导致水和蛋白质的渗透性增加、上皮细胞肺泡液体清除率（AFC）能力降低，最终导致不可逆性肺水肿。此外，TJ受损可以促进传染性病原体、外源性毒素和内源性产物进入循环系统[22]，从而转运至其他器官并导致多器官衰竭。TJ包括介导细胞间接触的膜蛋白和传导信号的胞质接头蛋白[23]。Claudin蛋白是膜蛋白中的一类重要的跨膜蛋白，是维持紧密连接特异的渗透性的主要蛋白[24]。Claudins是一类含有四个跨膜区域的蛋白质，由27个家族成员构成，包括CLDN1、CLDN2、CLDN3、CLDN4、CLDN5、CLDN7、CLDN8、CLDN18等[25]。免疫组化试验发现CLDN1、CLDN2、CLDN3、CLDN4、CLDN5、CLDN7和CLDN8在气道上皮细胞表达[22]。然而，这些claudins在细胞内的定位有所不同。CLDN2主要定位在细胞内[26]，CLDN3、CLDN5和CLDN8发现在TJs[27],CLDN1和CLDN4在整个侧膜的位置及顶端TJs[27]，CLDN7定位在TJs的基底外侧的侧模[27]。两种肺泡上皮细胞均丰富的表达CLDN3、CLDN4和CLDN18-1[22]。CLDN3和CLDN4归入经典claudins家族，而CLDN18归入了非经典claudin家族[22]。Ⅰ型肺泡上皮细胞（ATⅠ）和Ⅱ型肺泡上皮细胞（ATⅡ）的claudin表达模式不同。在ATⅠ细胞中，CLDN18的表达量占所有claudin的56%，CLDN占31%，CLDN4占10%。在ATⅡ细胞中，CLDN3占67%，CLDN4占23%，CLDN18占7%[28]。发生炎症反应或病毒感染时，claudin蛋白的结构、功能及表达会发生改变，从而导致细胞旁路渗透性增加。人感染H7N9禽流感肺部紧密连接蛋白的变化需要进一步研究。肺泡表面活性剂是一种脂蛋白复合物，由90%的脂质和10%的表面活性蛋3 白组成，由ATⅡ细胞和Club细胞等分泌。肺泡表面活性剂可以减少肺泡的表面张力，维持肺泡结构的稳定[29]。肺泡表面活性蛋白包括表面活性蛋白A（SPA）、表面活性蛋白B（SPB）、表面活性蛋白C（SPC）和表面活性蛋白D（SPD）[29]。肺与外坏境相通，时刻受各种物理和环境微粒的刺激，为保证肺部内环境的稳定，肺部细胞适度的再生以修复损伤是必需的。损伤修复的过程中，肺表面活性剂起到了重要的作用。本课题通过qRT-PCR法检测人感染H7N9禽流感患者气道主要粘蛋白MUC2、MUC5B和MUC5AC的mRNA相对表达情况，以初步了解H7N9禽流感病毒感染后MCC功能的改变；通过qRT-PCR法检测CLDN1、CLDN3、CLDN5、CLDN7和CLDN18的mRNA在人感染H7N9禽流感患者肺细胞中的表达，以初步了解H7N9禽流感病毒感染后肺部紧密连接的变化情况；通过RT-PCR法检测H7N9禽流感病毒感染后肺部SPA、SPB、SPC和SPD的mRNA的表达量以初步了解H7N9禽流感病毒感染后肺表面活性蛋白的变化情况。研究目的、方法研究目的：回顾性分析人感染H7N9禽流感患者的病例资料，分析总结其个人资料、临床表现、化验检查等，为疾病的诊治提供一定的依据；利用HE染色比较肺部病理改变；同时，利用qRT-PCR法检测H7N9禽流感病毒感染患者气道中粘蛋白的表达情况，初步了解H7N9禽流感病毒感染后气道粘液纤毛清除机制的改变；利用qRT-PCR法检测H7N9禽流感病毒感染患者肺中紧密连接的表达情况，初步了解H7N9禽流感病毒感染后肺上皮细胞屏障功能改变；利用qRT-PCR法检测H7N9禽流感病毒感染患者肺表面活性蛋白的表达情况，初步了解H7N9禽流感病毒感染后肺泡结构稳定性及肺部固有免疫反应的改变。研究方法：1收集经CDC实验室确诊的人感染H7N9禽流感患者的病例资料，归纳总结一般资料、临床表现、化验检查结果等。2利用HE染色比较H7N9组及对照组肺部病理改变；同时，利用qRT-PCR法比较H7N9组及对照组气道中粘蛋白、肺部紧密连接蛋白及肺表面活性蛋白的表达情况。4 一、人感染H7N9禽流感病例资料收集与分析自2013年首次在上海和安徽发现人感染H7N9禽流感病例后，我国相继出现了五次流行高峰。人感染H7N9禽流感具有高致死率，但其发病机制尚不清楚，亟需深入研究。本课题拟收集2016年6月至2017年5月期间在天津市海河医院经天津市CDC核酸检测确诊的人感染H7N9禽流感病例的临床资料，并综合相应文献资料对其流行病学特征、临床特点、影像及实验室检查特点等展开回顾性分析，为人感染H7N9禽流感的预防和诊治提供一定依据。1.1对象和方法1.1.1研究对象收集2016年6月至2017年5月，在天津市海河医院经天津市CDC核酸检测确诊的人感染H7N9禽流感病例4例。1.1.2研究方法回顾性分析4例人感染H7N9禽流感患者一般资料、临床特点、影像及实验室检查特点等，并综合相应文献进行分析总结。1.2结果1.2.1一般资料本课题所收集的4例人感染H7N9禽流感病例包括2例(50%)男性，2例(50%)女性，年龄在58-67岁之间，平均年龄为62.5岁；2例（50%）为农民，2例（50%）退休在家；4例（100%）在发病前期均有禽类接触史；4例（100%）均有高血压（HBP）病史，2例（50%）有冠状动脉性心脏病（CHD）病史，1例（25%）有慢性阻塞性肺病（COPD）、慢性肺源性心脏病（CPHD）病史，1例（25%）有淋巴结结核病史；其中，病例1基础疾病有HBP，病例2基础疾病有HBP、5 CHD、COPD、CPHD，病例3基础疾病有HBP、CHD和淋巴结结核，病例4基础疾病有HBP；发病季节为春末夏初（表1.1）。表1.1人感染H7N9禽流感患者一般资料病例性别年龄职业禽类接触史基础疾病发病年月1男62农民有HBP2017.62男63退休有HBP、2016.6CHD、COPD、CPHD3女67退休有HBP、2016.6CHD、淋巴结结核4女58农民有HBP2017.41.2.2临床表现、并发症及预后4例患者平均在接触禽类后第8.75天发病，其中，病例1在接触禽类后第11天发病，病例2在接触禽类后第9天发病，病例3在接触禽类后第5天发病，病例4在接触禽类后第10天发病（表1.2）。4例患者从出现症状至住院治疗的平均间隔时间为9.25天，其中，病例1在发病第5天住院，病例2在发病第16天住院，病例3在发病第9天住院，病例4在发病第7天住院（表1.2）。4例患者的主要临床表现有发热、咳嗽、气短、呼吸困难等。其中，4例（100%）患者均有高热症状，3例（75%）患者有呼吸困难症状，3例（75%）患者有胸闷症状，2例（50%）患者有咳嗽症状，2例（50%）患者有气促症状，1例（25%）患者有胸痛症状，1例（25%）患者有咯血症状，1例（25%）患者有腹痛症状（表1.2）。病例1主要表现为高热、胸闷、气促和呼吸困难，病例2主要表现为咳嗽、高热、呼吸困难和咯血，病例3主要表现为高热、胸闷和呼吸困难，病例4主要表现为高热、咳嗽、胸闷、胸痛、气促和腹痛（表1.2）。4例患者的主要并发症有感染性休克、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性6 肾损伤、脑病、横纹肌溶解和继发感染等。其中，4例（100%）患者均出现感染性休克及ARDS并发症，3例（75%）患者出现急性肾损伤并发症，2例（50%）患者出现脑病并发症，2例(50%)患者出现横纹肌溶解并发症，2例（50%）患者出现继发感染并发症（表1.2）。病例1出现感染性休克、ARDS并发症，病例2出现感染性休克、ARDS、急性肾损伤、横纹肌溶解并发症，病例3出现感染性休克、ARDS、急性肾损伤、脑病、继发感染并发症，病例4出现感染性休克、ARDS、急性肾损伤、脑病、横纹肌溶解、继发感染并发症（表1.2）。4例患者住院后均采取抗病毒、抗菌、激素及对症支持治疗。4例患者中，3例（75%）患者呼吸道分泌物检测病毒转阴，其中病例1和病例4治愈出院，病例3自动出院；而病例2最终死亡。表1.2人感染H7N9禽流感患者主要临床表现、并发症及预后病接触禽类至发病发病至住院的临床表现并发症预后例时间间隔（天）时间间隔（天）1115高热、胸闷、感染性休克、治愈气促和呼吸ARDS困难2916咳嗽、高热、感染性休克、死亡呼吸困难和ARDS、急性肾咯血损伤、横纹肌溶解359高热、胸闷和感染性休克、病毒转呼吸困难ARDS、急性肾阴，自动损伤、脑病、出院4107高热、咳嗽、感染性休克、治愈胸闷、胸痛、ARDS、急性肾气促和腹痛损伤、脑病、横纹肌溶解7 1.2.3影像学改变4例患者胸部X线及胸部CT都表现为双侧肺实变及磨玻璃样改变。病例1发病5天后住院治疗，就诊时胸部CT表现为双肺的实变及磨玻璃样改变，并有右侧胸腔积液(图1.1A)。病例2发病16天后住院治疗，就诊时胸部X线即表现为白肺(图1.1C)。病例3发病9天后住院治疗，就诊时胸部CT示双肺斑片状浸润影及磨玻璃密度影，并有双侧胸腔积液(图1.1B)。病例4发病7天后住院治疗，就诊时胸部X线即表现为白肺(图1.1D)。CDAB图1.1人感染H7N9禽流感患者影像学表现1.2.4实验室检查4例患者发病初期血白细胞（WBC）及中性粒细胞（NEU）绝对值基本不升高，在正常范围甚至低于正常值，只有病例3和病例4合并继发感染时升高，高于正常，后期恢复正常（如图1.2A、B）。4例患者的淋巴细胞均减低，其中病例1和病例4在疾病恢复期呈现升高趋势（如图1.2C）。4例患者的血小板均减低，其中病例1和病例4在疾病恢复期呈现升高趋势（如图1.2D）。病例1、病例3和病例4的肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌酐（Cr）、谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）均基本在正常范围，而病例2的CK、CK-MB、Cr、AST和ALT在疾病后期均明显升高（如图1.2E-I）。8 ABC9 DEF10 GHI图1.2人感染H7N9禽流感患者实验室检查结果11 1.3讨论1.3.1人感染H7N9禽流感流行病学自新型H7N9禽流感病毒出现至今，实验室确诊病例已超过1600例，病死率近40%（CDC）。至今共出现5次流行高峰，且发病高峰均为冬春季[2]。在人感染H7N9禽流感患者中，男性患者所占比例为69%[30]。大多数患者年龄在40-60岁之间，甚至大于60岁，尤其是有基础疾病的老年人较多[31]。研究表明，人感染H7N9禽流感在第五次流行高峰中发生了如下改变：发病年龄由老年趋向于中年，发病地区由城市趋向于郊区及农村[32]。患者多为接触家禽或家禽粪便污染的水源等经由呼吸道传播致病，但有少数为密切接触感染患者后发病，故不除外人传人的可能[33]。本课题4例患者于春末夏初季节发病，稍滞后于发病高峰期，人感染H7N9禽流感高发地区位于南方，而本课题4例患者均发病于北方，病毒可能是由从南方传播至北方，因此北方人感染H7N9禽流感感染高峰可能具有时间滞后性。本课题收集的4例患者中2例男性、2例女性，男女比例为1：1,与之前的研究不太相符，可能与本课题收集病例数过少，出现数据偏倚有关。患者年龄在58-67岁之间，平均年龄为62.岁，与之前的文献报道基本相符。其中50%为农民，符合文献发病地区趋向农村的报道。均有禽类接触史，表明H7N9病毒为禽源性病毒，多为接触家禽传播，与文献报道相符。均有基础疾病，表明H7N9禽流感病毒更易感染免疫力低下的人群，有基础疾病的中老年人为其高危人群。1.3.2人感染H7N9禽流感临床表现、并发症既往研究表明人感染H7N9禽流感的潜伏期一般小于7天，从发病到去医院看病的平均间隔时间为5天，从发病到实验室确认H7N9病毒感染平均间隔时间为8天，从发病到死亡的平均间隔时间为14天[2]。本课题的4例患者平均在接触禽类后第8.75天发病，从出现症状至住院治疗的平均间隔时间为9.25天，比先前报道时间稍晚，可能与本课题收集病例数过少，出现数据偏倚有关。患者的住院临床表现有高热、咳嗽、气短、呼吸困难、胸闷、胸痛、咯血、腹痛等，其中以发热、咳嗽、呼吸困难、胸闷、气促常见。患者均出现感染性休克12 及ARDS并发症，部分出现急性肾损伤、脑病、横纹肌溶解等，与之前报道相符[5]。75%患者呼吸道分泌物检测病毒转阴，25%最终死亡，即病例2。可能与病例2就诊时间较晚，延误病情有关[5]，也可能与病例2原有肺部基础疾病有关。1.3.3人感染H7N9禽流感影像学及实验室检查4例患者胸部X线及胸部CT影像学均表现为双侧肺实变及磨玻璃样改变，部分出现胸腔积液，与之前报道一致[6]。4例患者发病初期血白细胞及中性粒细胞均不升高，在病例3和病例4合并继发感染时升高，可见H7N9病毒感染呈现白细胞及中性粒细胞不升高，与之前报道相符[5]；当白细胞及中性粒细胞升高时提示可能合并继发感染。4例患者淋巴细胞及血小板均减低，其中病例1和病例4在疾病恢复期呈升高趋势，可见H7N9病毒感染呈现淋巴细胞减少症和血小板减少症，与之前的研究一致[5]；当淋巴细胞和血小板数量恢复时可能提示疾病处于恢复期，故淋巴细胞和血小板的变化趋势可能提示预后。病例1、病例3和病例4的CK、CK-MB、Cr、AST和ALT均在正常范围，而病例2的CK、CK-MB、Cr、AST和ALT在疾病后期均明显升高，病例2最终死亡，因此CK、CK-MB、Cr、AST和ALT不可控的升高可能提示预后不良。1.4小结人感染H7N9禽流感好发于有基础疾病的中老年人群。其感染多与接触家禽有关，故加强禽类市场的监管有利于人感染H7N9禽流感的防控。人感染H7N9禽流感多表现为持续高热、咳嗽、呼吸困难等症状，并可迅速进展为感染性休克、ARDS、急性肾功能损伤等，早期抗病毒治疗与预后相关，故出现症状及时就诊，可有效防止疾病进展、改善疾病预后。患者肺部影像学主要表现为肺实变及磨玻璃样改变，实验室检查可呈现淋巴细胞减少症和血小板减少症，及时采取相应的化验检查有利于疾病早期诊断。13 二、人感染H7N9禽流感病例组织标本的病理改变气道上皮细胞与外环境相通，需要有相应的保护。气道上皮细胞分泌的粘液不仅可以保护气道上皮细胞，还可以选择与气道上皮细胞结合、交换和摄入的物质。粘蛋白是大分子糖复合物，是粘液的主要成分。气道上皮细胞分泌的粘蛋白具有保护气道避免病原微生物侵入、维持稳定适宜的PH值、防止气道上皮细胞被蛋白水解酶消化、保护气道免受机械或化学的损伤等作用。气道上皮细胞分泌的粘蛋白主要有粘蛋白2（MUC2）、粘蛋白5B（MUC5B）、粘蛋白5AC（MUC5AC）等。气道或肺泡上皮屏障由气道或肺泡上皮细胞和细胞间紧密连接构成，在肺部疾病特别是急性肺损伤的发生机制中起重要作用。紧密连接由蛋白质和脂质组成，主要成分是蛋白质。紧密连接蛋白主要包括紧密蛋白-1（CLDN1）、紧密蛋白-3（CLDN3）、紧密蛋白-4（CLDN4）、紧密蛋白-5（CLDN5）、紧密蛋白-7（CLDN7）、紧密蛋白-10（CLDN10）和紧密蛋白-18（CLDN18）等。由Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌的肺表面活性剂是一种脂蛋白复合体，由90%的脂质和10%的表面活性蛋白组成。肺表面活性剂可以减少肺泡的表面张力，维持肺泡结构的稳定，并参与固有免疫反应。肺泡表面活性蛋白包括表面活性蛋白A（SPA）、表面活性蛋白B（SPB）、表面活性蛋白C（SPC）和表面活性蛋白D（SPD）。人感染H7N9禽流感患者严重者表现为重症肺炎，镜下的病理改变明显，但缺乏相关的发病机制的研究，更未见H7N9禽病毒感染后粘蛋白、气道紧密连接和表面活性蛋白的变化。本课题拟收集人感染H7N9禽流感患者的肺组织标本和非肺部感染因素行外科切除肺叶的患者的病变周围相对正常的肺组织，通过苏木精-伊红（HE）染色法观察镜下肺部病理变化；通过荧光实时定量PCR法测定H7N9组和对照组肺组织中粘蛋白基因的相对表达量（MUC5BmRNA、MUC5ACmRNA、MUC2mRNA）、紧密连接蛋白基因的相对表达量（CLDN1mRNA、CLDN3mRNA、CLDN5mRNA、CLDN7mRNA和CLDN18mRNA）和表面活性蛋白基因的相对表达量（SFTPAmRNA、SFTPBmRNA、SFTPCmRNA和SFTPDmRNA），来探讨H7N9禽流感病毒感染与肺部防御保护屏障之间的关系。14 2.1对象和方法2.1.1人感染H7N9禽流感患者及对照组标本收集2016年6月在天津市海河医院经天津市CDC核酸检测确诊的人感染H7N9禽流感病例，即上述病例2，在纤维支气管镜下取得支气管粘膜并经透壁肺活检取得肺组织标本作为H7N9组。2016年10月至2017年1月在天津市海河医院确诊的肺癌行手术切除的患者2例，收集其切除肺叶病变周围相对正常的肺组织，作为对照组。对照组入选标准：①年龄≥50岁；②无肺炎、支气管扩张、慢性阻塞性肺病等感染性肺部疾病。2.1.2组织标本制备及HE染色2.1.2.1试剂及仪器主要实验试剂（1）20%中性福尔马林，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；（2）无水乙醇，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；（3）95%乙醇，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；（4）75%乙醇，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；（5）二甲苯，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；（6）石蜡，购自上海徕卡仪器有限公司；（7）中性树脂胶，购自北京益利精细化学品有限公司；（8）苏木素，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；（9）伊红，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要实验仪器（1）组织脱水机，购自上海徕卡仪器有限公司；（2）组织包埋机，购自上海徕卡仪器有限公司；（3）石蜡切片机，购自德国徕卡公司；（4）摊片机，购自上海徕卡仪器有限公司；（5）烘片机，购自上海徕卡仪器有限公司；（6）通风橱；15 （7）超纯水机，购自法国密理博（Millipore）公司，型号Mili-Q；（8）4℃冰箱，购自塞默飞世尔（Thermoscientific）公司，型号PLR386；（9）正置显微镜，购自奥林巴斯（Olympus）公司，型号SZX7；（10）CellSensDimension拍照系统；（11）大染缸；（12）玻片架；（13）倒置荧光显微镜，购自奥林巴斯（Olympus）公司，型号IX73。2.1.2.2组织标本石蜡包埋、切片①将H7N9组和对照组肺组织标本放入10%的中性福尔马林中固定24h；②将固定好的组织标本在室温下逐级脱水：75%乙醇、1h，85%乙醇、1h，95%乙醇Ⅰ、2h，95%乙醇Ⅱ、2h,无水乙醇Ⅰ、30min，无水乙醇Ⅱ、30min,二甲苯Ⅰ、30min，二甲苯Ⅱ、30min，石蜡Ⅰ、2h，石蜡Ⅱ、2h；③在组织包埋机上用石蜡包埋组织块；④将获得的石蜡块用石蜡切片机切成厚度为5微米的切片，在摊片机中展片，后用粘性载玻片捞取，放置在65℃烘片机上烘片30min，做好标记后置于4℃冰箱备用。2.1.2.3苏木素-伊红（HE）染色HE染色原理HE染色，即苏木素-伊红染色，是组织常用的染色方法之一。其原理为苏木素染液为碱性染液，可以使细胞核内的染色质和细胞质内的核酸着紫蓝色；伊红溶液为酸性染液，可以使细胞质及细胞外基质中的成分着红色。HE染色过程①烤片：65℃烘片机上烤片30min；②石蜡切片脱蜡：二甲苯Ⅰ、5min，二甲苯Ⅱ、5min，100%乙醇Ⅰ、3min，100%乙醇Ⅱ、3min，95%乙醇Ⅰ、3min，95%乙醇Ⅱ、3min，80%乙醇、3min，75%乙醇、3min,蒸馏水、3min；③木精染核（42s），洗一下再放入自来水浸泡10min；④1%盐酸酒精分色2s，95%乙醇Ⅰ、2min，95%乙醇Ⅱ、2min；⑤在正置显微镜下观察细胞核着色程度，一般以细胞核染色清晰而细胞质基本无色为佳。如果染色太浅，应重新染色后再行分色。适宜后蒸馏水冲洗5min；⑥复染：0.5%伊红水溶液（对比染色）25sec；16 ⑦脱水：95%乙醇Ⅰ、2min，95%乙醇Ⅱ、2min,无水乙醇Ⅰ、2min，无水乙醇Ⅱ、2min,二甲苯Ⅰ、2min，二甲苯Ⅱ、2min；⑧封片：中性树胶封固，通风橱中晾干过夜。2.1.3总RNA提取及实时荧光定量PCR2.1.3.1原理Trizol法提取RNA原理Trizol试剂主要由异硫氰酸胍和苯酚组成，异硫氰酸胍可以裂解细胞，使核蛋白体解离、蛋白质和RNA分离、促使RNA释放于溶液中。酸性苯酚可以使RNA溶于水相，氯仿可提取酸性苯酚，加入氯仿离心后，RNA可随苯酚及氯仿留在水相层，而蛋白质和DNA则留在有机层，如此，可使RNA与蛋白质及DNA分开，提取出RNA。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）原理实时荧光定量PCR是通过荧光标记的特异性探针或荧光染料标记常规PCR产物，由此产生荧光扩增曲线来检测产物扩增量的方法。SYBRGreen是一种与双链DNA小沟结合的、结合后才能发出荧光的内掺式荧光染料。荧光信号和双链DNA数量成正比。常规PCR产生的双链DNA与SYBRGreen结合产生荧光，随着扩增的进行可形成荧光扩增曲线图，由此检测扩增产物量。Ct值是荧光信号达到设定域值时的循环数。Ct值作为qRT-PCR的定量检测指标，Ct值越大表示起始拷贝数越小。进行qRT-PCR时还需要用内参基因，一般选择管家基因，如β-actin、GAPDH等，用于消除实验过程的误差。2.1.3.2主要实验试剂（1）iQTMSYBR®GreenSupermix，购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司（Bio-RadLaboratories）；（2）10XPCRbuffer，购自罗氏生命科技（Roche）公司；（3）Nuclease-FreeWater，购自Ambion公司；（4）MgCl2，购自罗氏生命科技（Roche）公司；（5）dATP、dGTP、dCTP、dUTP，购自Takana公司；17 （6）Hexamers（randomprimer），购自Takana公司；（7）RNA酶抑制剂，购自Takana公司；（8）逆转录酶SuperScripШ，购自美国英杰（Invitrogen）生命技术有限公司。2.1.3.3主要实验仪器（1）离心机，购自Crystal公司，型号MLX-206；（2）微量紫外分光光度计，购自Thermo公司，型号NanoDrop2000；（3）高速台式冷冻离心机，购自德国Eppendorf公司，型号ST16R；（4）PCR扩增仪，购自Bio-Rad公司，型号T100；（5）荧光定量PCR仪，购自Roche公司，型号LightCycler96；（6）八排管、96孔板、96孔板封膜，购自Roche公司；（7）1.5mlRNaseFree离心管，购自Axygen公司，型号MCT-150-C）。2.1.3.4实验过程（1）总RNA提取①将人感染H7N9禽流感患者肺组织及收集的肺癌周围正常肺组织分别放入2ml无酶EP管中，加入1mltrizol，用超声匀浆机打碎组织；②12000rpm，4℃离心10min，弃去沉淀，取上清，加入另外一个EP管中；③加入200ul氯仿，充分混匀，震荡，后静置3min；④10000rpm，4℃离心15min；⑤离心后分3层，中层为蛋白质，取上清300ul，注意不要碰到中层；⑥加入等体积300ul的异丙醇，充分混匀，室温下静置10min；⑦12000rpm，4℃离心10min，弃去上清，下面放置手纸吸水，管子倒置；⑧加入1ml75%的乙醇，离心7000rpm，5min，弃去上清，下面放置手纸吸水，管子倒置；⑨加入300ul的75%乙醇，7000rpm，离心5min；空气中放置15min，再次吸干净；加入22ulRNADNA-freewater，震荡，55℃下10min；⑩冰上测定浓度：取2ul待测样本用紫外分光光度计测定A280和A260的吸光值，要求A260/A280比值在1.8-2.0区间内，以确保RNA的提取质量。（2）反转录成cDNA将所得的20ul待测样本RNA按照反转录体系的各溶液配制比例配制好反应体系（表2.1），混匀离心后放在PCR仪中反转录后得到cDNA。反转录程序：25℃10min退火，48℃40min延伸,95℃5min逆转录酶失活，18 4℃保存。表2.1反转录反应体系10XPCRbuffer5ulMgCl215uldATP、dGTP、dCTP、dUTP混合物1ul逆转录酶SuperScripШ0.625ulRNA酶抑制剂0.5ulHexamers（randomprimer）1ul待测样本RNA20ulNuclease-FreeWater6.875ul总计50ul（3）引物设计及合成通过Pubmed搜索HumanClaudin1、Claudin3、Claudin5、Claudin7、Claudin18、SFTPA、SFTPB、SFTPC、SFTPD、Mucin2、Mucin5AC、Mucin5B、β-actin的外显子序列，采用Primerquest软件设计引物。检测所设计引物，上下游引物序列无发夹结构、引物间无大于3个连续碱基的互补配对，经NCBIBLAST检索无显著同源序列。引物由华大基因公司合成，具体见表2.2。表2.2引物序列19 GeneDirectionSequence(5'-3')β-actinForwardGGCACCCAGCACAATGAAGATCAAReverseACTCGTCATACTCCTGCTTGCTGAClaudin1ForwardCCGTTGGCATGAAGTGTATGAReverseGCCAGACCTGCAAGAAGAAATAClaudin3ForwardTCATCGGCAGCAACATCATCReverseGTACACCTTGCACTGCATCTClaudin7ForwardAAAGTGAAGAAGGCCCGTATAGReverseGTTGGTAGGGATCAAAGGGTTATClaudin5ForwardGGCGTGCTCTACCTGTTTReverseGCACAGACGGGTCGTAAAClaudin18ForwardCCAACTACAAAGCCGTTTCTTATCReverseGGCACCTCCATCGTATATCTTCSFTPAForwardAAGAGCAGTGTGTGGAGATGReverseCAGAACTCACAGATGGTCAGTCSFTPBForwardGCATTGCCTACAGGAAGTCTReverseCCTCCTTGGCCATCTTGTTSFTPCForwardTTCTTATCGTGGTGGTGGTGReverseACCATCTCCGTGTGTTTCTG20 SFTPDForwardTGGAGACAAAGGAGCAAAGGReverseGTGCTGTACTTGTCCCTGTAAGMucin2ForwardCTACCCTTCCTCTGTGCTTATCReverseCAGTGAGCAGTTGACGAAATAACMucin5ACForwardCACCTCCTCTTGGCAGAAATReverseGAGGTTGTGCTGGGTATAGAAGMucin5BForwardGGACTACATCAAGGTCAGCATCReverseCAGGTCTGGTTGGCGTATTT（4）实时荧光定量PCR按照实时荧光定量PCR体系中各溶液的配比配制反应体系（表2.3），将配制好的反应体系混匀离心后放在实时荧光定量PCR仪中。实时荧光定量PCR反应程序：95℃3min预变性，94℃40s变性，60℃30s复性，72℃30s延伸，循环40次后72℃7min延伸。表2.3实时荧光定量PCR反应体系cDNA5ulSYBRGreen12.5ulForwardprimer0.5ulReverseprimer0.5ulH2O6.5ulTotal25ul2.1.3.5统计学处理用内参基因β-actin使样品标化，结果用Ct值表示。ΔCt=目的基因Ct值β-actinCt值。目的基因相对表达量=2-ΔCt。21 2.2结果2.2.1H7N9组和对照组肺组织HE染色镜下改变显微镜下可以看到对照组肺组织结构清晰，肺泡结构完整，未见明显出血及纤维组织增生等(图2.1A、B)；H7N9组肺组织结构紊乱，正常肺泡结构消失，肺出血，纤维组织增生（图2.1C、D）。ABCD200×400×图2.1H7N9组和对照组肺组织HE染色22 2.2.2H7N9组及对照组肺部粘蛋白相对表达量的改变采用qRT-PCR检测基因表达量的方法发现，H7N9组气道分泌的粘蛋白MUC2mRNA、MUC5BmRNA和MUC5ACmRNA相对表达量较对照组升高，其中MUC2mRNA、MUC5BmRNA相对表达量较对照组升高明显（图2.2A、B）（H7N9组及对照组肺部粘蛋白相对表达量的具体数值见附录）。AB图2.2H7N9组及对照组气道粘蛋白的相对表达量2.2.3H7N9组及对照组肺部紧密连接蛋白相对表达量的改变采用qRT-PCR检测基因表达量的方法发现，H7N9组肺部紧密连接蛋白CLDN1、CLDN5、CLDN7和CLDN8的mRNA相对表达量较对照组均降低，而CLDN3mRNA相对表达量较对照组明显升高（图2.3A、B）（H7N9组及对照组肺部紧密连接蛋白相对表达量的具体数值见附录）。BA图2.3H7N9组及对照组肺部紧密连接蛋白的相对表达量23 2.2.4H7N9组及对照组肺部表面活性蛋白相对表达量的改变A采用qRT-PCR检测基因表达量的方法发现，BH7N9组肺泡表面活性蛋白SFTPA、SFTPC和SFTPDmRNA相对表达量较对照组明显降低，而SFTPBmRNA相对表达量较对照组明显升高（图2.4A、B）（H7N9组及对照组肺部粘蛋白、紧密连接蛋白及肺表面活性蛋白相对表达量的具体数值见附录）。图2.4H7N9组及对照组肺部表面活性物质的相对表达量2.3讨论2.3.1人感染H7N9禽流感患者肺部病理表现人感染H7N9禽流感患者肺部典型的病理表现为急性弥漫性肺泡损伤、肺出血及后期弥漫性肺损伤后纤维增生[11]。本课题收集了一例人感染H7N9禽流感致死病例的肺组织，HE染色后显示患者肺组织结构紊乱，正常肺泡结构消失，肺部出血，纤维组织增生，与先前研究基本一致。2.3.2人感染H7N9禽流感患者气道粘蛋白改变气道粘液可以粘附吸入的微生物及粉尘等有害物质，而后借助纤毛转运系统加以清除，然而这种清除机制需要在一定的粘液厚度及粘稠度时才发挥作用[34]。但粘蛋白过度分泌，粘稠度增加，不易被纤毛系统清除，并阻塞气道，反而利于微生物的定植及侵袭[35]。MUC5AC和MUC5B被认为是形成凝胶的主要大分子，而MUC2对基质有一定程度的影响[36]。这些分泌型粘蛋白在炎症反应中有重要作用[16]。MUC5AC和MUC5B表达增加导致粘液中粘蛋白的组成发生显著变化，为细菌24 黏附上皮细胞提供了屏障，铜绿假单胞菌被证明与气道粘蛋白结合[37]，因此，充足的MUC5AC和MUC5B的分泌可能对最初清除呼吸道细菌至关重要。百日咳杆菌可以诱导人气道上皮细胞表达MUC2[38]。MUC5AC主要由气道表层的杯状细胞产生，MUC5AC是慢性线虫感染的清除过程中必需的。小鼠中，MUC5AC过表达可以抑制流感感染，减轻中性粒细胞性炎症[39]。然而，MUC5AC基因表达上调与囊性纤维化（CF）、哮喘和COPD的发病机制有关，是导致气道阻塞的主要原因[15]。与慢性气道炎症疾病相关的环境和宿主因素包括蛋白酶、微生物、活性氧、空气污染、吸烟、炎性因子、气道压迫等都可以上调MUC5AC基因的转录[40]。MUC5AC也可以在转录后通过表观遗传机制如DNA甲基化、组蛋白乙酰化或脱乙酰化等被调节[41]。MUC5B由气道表层的杯状细胞和粘液下腺细胞产生，在粘液纤毛清除机制中起关键作用。小鼠中MUC5B缺陷导致气道颗粒堆积、粘液阻塞气道、感染风险增加、巨噬细胞吞噬功能性炎症和死亡风险均增加[42]。人类的MUC5B具有高度多态性，在正常人群中发现有20%的人中有一种MUC5B启动子变体，可以使MUC5B在健康肺中的表达增加37.4倍[43]。在MUC5B缺陷和过度表达的小鼠中发现，MUC5B变体可能与调节呼吸道的内稳态、疾病的发病机制和人体的粘膜免疫功能相关[44]。尽管控制粘液过度分泌是一种很有吸引力的治疗急性或慢性肺疾病的方向，但是长时间扰乱粘液分泌及抑制MUC5B是不可取的。故而，促进MUC5B适度表达、加强MCC功能和气道防御是目前比较提倡的治疗方向。有研究发现猪感染胸膜肺炎放线杆菌后肺内MUC2、MUC5AC及MUC5B表达量在短时间内均有明显升高[45]；呼吸道合胞病毒（RSV）感染时人肺上皮细胞的MUC8、MUC15、MUC20、MUC21和MUC22有显著升高[46]；人类偏肺病毒（hMPV）感染时人肺上皮细胞的MUC1、MUC2和MUC5B显著升高[46]。本课题通过RT-PCR法监测H7N9病毒感染患者气道MUC2、MUC5AC及MUC5B表达量改变。研究发现MUC2mRNA、MUC5BmRNA和MUC5ACmRNA相对表达量较对照组均升高，提示H7N9禽病毒感染后气道粘液纤毛功能可能发生改变，这为通过调节粘蛋白的表达治疗人感染H7N9禽流感提供了一定的依据。而这种粘蛋白表达的升高是利于机体抵抗H7N9禽流感病毒感染还是利用H7N9禽流感病毒侵袭还需进一步研究。粘液的粘弹性主要取决于粘25 蛋白的质和量。人感染H7N9禽流感患者肺部粘蛋白质的变化也需要进一步研究。2.3.3人感染H7N9禽流感肺部紧密连接蛋白改变有研究发现，一些基因敲除的菌株表现为对急性肺损伤的易感性增加，表明claudins和TJ功能在急性肺损伤和呼吸窘迫综合征的发展中起重要作用[22]。人类上皮细胞和人类内皮细胞共培养的细胞模型中，H1N1和H5N1病毒感染均导致严重的屏障损伤[47]；产气荚膜梭菌肠毒素可以使Claudin3和Claudin4的结构改变，并促使紧密连接降解[48]；在呼吸道合胞病毒（RSV）小鼠感染模型中，RSV诱导肺部炎症同时下调CLDN1和occludinmRNA的表达[49]。尽管上皮细胞屏障功能破坏可以危及生命，但是肺上皮的TJ的调节及疾病中TJ的变化尚缺乏详尽的研究。CLDN1在气道上皮细胞中广泛表达，与气道的封闭性有关[27]。CLDN1还有调节上皮细胞间连接的功能[27]，这与CLDN1可以抑制肿瘤入侵及转移和参与调节A549细胞迁移的研究结果相符[50]。蛋白激酶D3可以通过下调CLDN1，损坏气道上皮细胞的屏障功能[51]。激活蛋白激酶受体2（PAR2）可以短暂的下调CLDN1的表达同时降低上皮细胞的渗透性[52]。相反，通过MAP激酶使CLDN1N端磷酸化，可以增强CLDN1的封闭性[53]。胸腺基质淋巴细胞素（TSLP）和过氧化物酶活性受体（PPARγ)两者都增加了CLDN1表达并提高了人类鼻腔上皮细胞间的封闭性[54,55]。CLDN3可以通过氧化应激改变胃上皮细胞的细胞旁通透性[56]，也可以通过暴露在炎性因子TNF-α下改变下颌下腺细胞的细胞旁通透性[57]。CLDN3被证明在Madin-Darbycanin肾细胞中过度表达可以降低细胞旁渗透性[58]。基于这些研究，CLDN3可以被理解为封闭性claudins。CLDN5的表达依赖于肺部发育阶段。在微管阶段，肺泡上皮细胞表达CLDN5[59]，这与培养的胎儿期肺泡细胞CLDN5的表达一致[60]。健康的肺泡上皮细胞表达低水平的CLDN5[28]，而气道上皮细胞在肺发育阶段表达CLDN5[27]。CLDN5表达上调可以导致肺上皮细胞细胞旁渗透性增加[27]。有研究发现在慢性酒精摄入的病人肺中，CLDN5表达上调伴有肺水肿及肺损伤易感性增加[61]。NFκB是肺中CLDN5的主要调节因子。在没有炎症的情况下，抑制气道上皮细26 胞NFκB的基础活性可以使CLDN5的表达上调[62]。这与TNF-α通过激活NFκB的经典信号通路下调CLDN5的催化剂活性的研究结果一致[63]。在急性肺炎小鼠模型中，提高TNF-α的水平可以使CLDN5的表达下调[64]。总的来说，NFκB依赖性下调CLDN5好像可以提高肺部炎症的肺上皮细胞屏障功能并有益于上皮细胞功能。相反的，病毒感染性肺损伤与CLDN5表达水平下调有关[30,65,66]。在肺部，血管内皮细胞也可以表达CLDN5[59]。在脂多糖（LPS）诱导血管渗透性增加时，CLDN5具有保护血管内皮屏障的功能。肺内CLDN5功能的双重性是由于CLDN5对内皮细胞和上皮细胞的作用不同、不同的调节机制还是仅仅由于潜在的损伤不同造成的尚无定论。而且，由于CLDN5功能的双重性，在肺部炎症时，对哪个功能占主导地位的判断十分困难。IFN-γ可以促进下颌下腺的CLDN7的表达并使跨膜电阻（TER）增加[67]，这体现了CLDN7是一种封闭性claudin。然而，关于CLDN7的渗透功能的研究发现CLDN7在TJ渗透率方面有着复杂的功能。在猪肾中CLDN7过表达时，上皮细胞系LLC-PK1可以通过降低Cl-细胞旁渗透性、形成Na+孔道增加TER[22]。虽然CLDN7与TJ的离子和电荷选择性孔道有关，可以降低离子的通透性，但是它可以增加TJ对非带电荷分子的通透性[68]。CLDN7表达沉默可以降低跨膜阻抗、提高Na+细胞旁渗透性大于Cl-[69]。然而，在Madin-Darby犬肾细胞（MDCK）中，CLDN7表达沉默可以降低跨膜阻抗、Cl-细胞旁渗透性大于Na+[69]。由此可见，CLDN7对TJ的作用可能与其背景细胞有关。通过WNK4激酶使CLDN7的C端磷酸化可以调节CLDN7的渗透性，提高细胞旁离子渗透性、增加TJ的Cl-渗透性[70]。因此，不同的细胞类型中CLDN7渗透性的不同也可能与转录蛋白后修饰有关。目前没有关于CLDN7基因敲除小鼠肺表型的描述。然而，CLDN7敲除导致肾脏盐浪费和慢性缺水[71]表明CLDN7在离子跨膜转运中起重要作用。在肠内诱导敲除CLDN7基因的小鼠中通过下调上皮细胞黏附分子(EpCAM)影响其横向黏附复合物的表达[72]，在无器官特异性CLDN7基因敲除的小鼠中通过下调整合素α2影响其横向黏附复合物的表达[73]。只有在后一种情况中，肠上皮的粘膜结构由于CLDN7基因敲除而被严重影响[73]。在气道上皮细胞中，CLDN7的定位贯穿上皮细胞的整个侧模[27]。气道上皮细胞之间的粘附连接可能是CLDN7的主要功能之一。在人肺癌细胞中CLDN7通过与整合素β1相互作用调节细胞间黏附性[74]再一次证明了上述假设。CLDN18有四个亚型。CLDN18-1和CLDN18-2两个亚型是由第一个编码27 外显子选择性剪接产生。第四和第五个编码外显子选择性剪接产生CLDN18-1.1、CLDN18-1.2、CLDN18-2.1和CLDN18-2.2。CLDN18-1亚型主要在肺部表达，而CLDN18-2亚型主要在胃部表达[75]。CLDN18基因敲除的小鼠表现出相当温和的表型。CLDN18基因敲除扰乱肺泡上皮细胞中TJ的形成，这与细胞旁渗透性增加相一致[76]。在CLDN18基因敲除的小鼠中，尽管屏障功能受到干扰，肺泡液体内环境仍能保持稳定，并且呼吸机诱导的肺损伤的易感性甚至降低。这种温和的表型可能与水和离子的运输能力增加及CLDN4表达代偿性升高有关[77]。因此，CLDN18-1与TJs相关并可能与肺泡上皮的封闭性有关。本课题通过RT-PCR法检测CLDN1、CLDN3、CLDN5、CLDN7和CLDN18的mRNA在H7N9禽流感病毒感染肺细胞中的相对表达量。目前研究表明CLDN1、CLDN7和CLDN18在肺组织中起封闭性作用，CLDN3在肾细胞和胃上皮细胞中起封闭性作用，但在肺泡上皮细胞培养中，CLDN3增加了对细胞的渗透性并抵抗CLDN4的封闭效果[78]，CLDN5具有封闭和渗透双重功能，病毒感染性肺损伤与CLDN5表达水平下调有关[30,65,66]。本项研究发现，H7N9禽流感病毒感染时肺部气道紧密连接蛋白CLDN1、CLDN5、CLDN7和CLDN8的mRNA相对表达量较健康对照组均降低，而CLDN3mRNA相对表达量较健康对照组明显升高。由此可见，H7N9禽流感病毒感染时，肺部的紧密连接蛋白的表达可能发生改变，可能导致气道和肺泡的渗透性增加，从而导致肺水肿、ARDS。某些细胞因子和宿主因子可以使claudin的表达改变，例如干扰素-γ、肿瘤坏死因子α-和白介素-13可促使claudin的内吞作用、使紧密连接渗透性增加[24]，本课题为通过调节一些细胞因子和宿主因子来调节claudin的表达进而增加肺上皮细胞紧密性治疗H7N9禽流感病毒感染的治疗方向提供了一定的依据；但紧密连接蛋白结构的改变尚需深入研究。2.3.4人感染H7N9禽流感肺表面活性蛋白改变肺表面活性蛋白不仅可以构成肺表面活性剂维持肺泡结构的稳定，还参与机体的固有免疫反应。SPA具有高度的亲水性，属于C型凝集素家族；C型凝集素家族是一个固有免疫反应成分家族。在人类和其他灵长类动物中，SPA由2个密切相关的蛋28 白组成，SPA1和SPA2，分别由SFTPA1和SFTPA2基因编码。SPA1和SPA2是前蛋白，以分泌小泡的形式分泌到肺泡表面。成熟的SPA是由6个结构子单元组成的花状结构，其中的6个结构子单元，每一个都由2个SPA1分子和1个SPA2分子通过二硫键在N-末端域中结合，形成一个630kDa分子[79]。SPA主要由肺泡上皮细胞产生，小部分由气道上皮产生，包括club细胞[80]。有研究发现SPA在妊娠21周时在分散的上皮细胞和部分支气管中首次表达，然而通过免疫染色发现在妊娠29周直至39周在ATⅡ细胞中均有表达[81]。SPA在表面活性剂的代谢中起重要作用。SPA被ATⅡ细胞释放后，迅速与分泌的层状体形成管状骨髓结构。SPA还聚合表面活性剂的磷脂，使表层物质吸附到空气流体界面上。此外，SPA还参与表面活性剂的再循环和ATⅡ细胞对磷脂吸收[79]。SPA的C-末端的凝集素区域识别并结合病原体的非宿主低聚糖，使它们可以被固有免疫细胞吞噬（巨噬细胞和单核细胞等）。作为一个例外，SPA与病毒之间的一些相互作用需要将病毒凝集素与SPA上的复杂的低聚糖结合[82]。甲型流感病毒（IAV）感染时，宿主的抗病毒活性可以通过SPA的唾液酸化多糖与病毒HA结合来调节[83]。SPA基因敲除小鼠表现为肺部感染及全身扩散可能性增加[84]。禽流感病毒（AIV）感染SPA基因敲除小鼠，病毒滴度及炎性反应均有适度的增加[83]。SPA还可以通过增加粘膜纤毛聚合和清除来促进病原体的消除。它还可以通过增加细菌的渗透性和脆性来进行直接抗菌活动。SPA通过与局部炎症细胞和细胞因子的相互作用参与宿主免疫反应[79]。SPA基因的表达可以被许多因素调节，包括生长因子如TGF-β、激素和细胞因子[84,85]。肺泡表面丰富的表面活性剂类脂对免疫细胞功能有抑制作用，然而SPA可能有刺激[86]和/或抑制双重效应[87]。在正常的肺中，通过维持各种表面活性剂成分的适当比例维持对免疫细胞刺激和抑制之间适当的平衡[86]。现在的研究表明SPA可能是一种预测疾病预后的生物标记物。在各种类型的间质性肺病（ILD）中，支气管肺泡灌洗液（BALF）的SPA水平比健康对照组低，然而，肺纤维化中血清SPA水平是升高的。此外，血中SPA浓度与肺泡炎症程度相关，在致命性病人的血中SPA水平更高[88]。COPD病人呼出气中SPA浓度较对照组明显降低[82]。目前恢复在肺泡结构内的功能性SPA是一种新的治疗方向的研究。SPB是一种大约18kDa的79-氨基酸二聚物[89]。SPB基因敲除小鼠表明SPB在表面活性复合物的合成及代谢中至关重要，SPB表达缺陷在新生儿期是致命的[90]。在转基因小鼠的研究中发现ATⅡ细胞表达的成熟的SPB对维持肺功能29 的正常是必需的，然而在Club细胞中表达的SPB没有此作用[91]。SPB与SPC的合成有关，SPB完全不表达可导致SPC的表达水平显著下调[92]。SPC是一种高度疏水性蛋白质，和SPB一起增强磷脂界面中磷脂的吸附和扩散，从而促进表面活性剂降低表面张力的能力[93]。SPC可将表面活性剂的磷脂重新吸收到ATⅡ细胞中，这表明SPC在表面活性剂的循环和降解过程中扮演着重要的角色[94]。SPC仅由ATⅡ细胞表达[94]。在动物炎性模型中，SPCmRNA及SPC的表达均下调[94]。在博来霉素诱导的ARDS和肺纤维化的动物模型中，SPCmRNA及SPC的表达水平显著下降[95]。高氧症也导致SPC表达降低[96]。感染曲霉或肺孢子菌的小鼠模型中，SPC表达下调[97,98]。SPC表达下调的途径之一似乎是由肿瘤坏死因子α（TNF-α）介导的[94]。一项研究表明，SPC可以与吞噬细胞（如巨噬细胞）表面的CD14受体相互作用，从而识别出LPS[99]。SPD是肺发育过程中最早出现的表面活性蛋白。SPD可能对免疫反应的致病因素、炎症介质的表达及免疫反应强度与对病原体的适度反应的平衡有影响，因此认为SPD是肺部固有免疫的组成部分和免疫反应的内在调节因子[100]。SPA和SPD具有识别病原体和调节宿主防御能力的能力，被归类为“分泌性病原体识别受体”[101]。SPD可以通过直接与微生物相互作用和经过一系列的细胞受体调节宿主细胞反应来发挥抗微生物和抑制炎症的作用[102]。SPD可以结合细菌、病毒、真菌和肠虫的寄生虫通过吞噬细胞识别加以清除[103-106]。然而，低蛋白浓度、遗传变异、生化修饰和蛋白水解可诱导多聚体SPD分解为低分子量形式，从而可能诱发促炎的SPD信号传导[102]。SPD与呼吸系统疾病的发展有关，包括呼吸窘迫综合征、支气管肺发育不良、过敏性哮喘和慢性阻塞性肺病[102]。在ARDS中，SPA和SPD在BALF中的较低浓度及血浆中的较高浓度与较重的病情及更坏的预后相关[107]。IAV感染时，宿主通过与病毒HA的寡糖结合强烈抑制病毒传染性[83]。AIV感染SPD基因敲除小鼠，病毒滴度和炎症增加[83]。由上述可见，SPA和SPD主要参与肺部固有免疫，SPB和SPC主要用于降低肺表面张力维持肺泡结构稳定。人感染H7N9禽流感中，SPA、SPB、SPC和SPD均会参与其中，但其机制目前尚未发现。本课题通过qRT-PCR法监测人感染H7N9禽流感后肺泡表面活性蛋白SFTPA、SFTPB、SFTPC和SFTPDmRNA相对表达量的变化。研究发现，肺泡表面活性蛋白SFTPA和SFTPDmRNA相对表达量较对照组明显降低，表明H7N9禽流感病毒感染后肺部固有免疫能力可能发生改变；SFTPCmRNA相对30 表达量较对照组明显降低而SFTPBmRNA相对表达量明显升高，表明H7N9禽流感病毒感染后肺泡的结构可能遭到破坏。本课题为通过调节SPB、SPC的表达提高肺泡结构稳定性和调节SPA和SPD的表达调节固有免疫反应等治疗方向提供了一定的依据；但是基因表达后的修饰及结构等是否发生变化尚需进一步研究。2.4小结H7N9禽流感病毒感染后，肺部可见肺出血，纤维组织增生。气道粘蛋白MUC2、MUC5B和MUC5ACmRNA表达量可能增加，气道粘液纤毛清除功能可能发生改变。气道紧密连接蛋白CLDN1、CLDN5、CLDN7和CLDN8的mRNA相对表达量降低，CLDN3mRNA相对表达量明显升高；肺部的紧密连接蛋白表达可能发生改变，肺上皮细胞的屏障功能可能发生改变、渗透性可能增加。肺泡表面活性蛋白SFTPA、SFTPC和SFTPDmRNA相对表达量明显降低，而SFTPBmRNA相对表达量明显升高；肺泡表面活性蛋白表达量可能改变，H7N9禽流感病毒感染后肺泡的结构可能遭到破坏，且肺泡的固有免疫亦可能发生改变。人感染H7N9禽流感肺部的防御屏障气道粘液纤毛清除功能、肺上皮细胞屏障功能、肺泡结构稳定性及肺部固有免疫能力可能发生改变。31 结论1、人感染H7N9禽流感好发于中老年人群，尤其是患有基础疾病的人群。人感染H7N9禽流感多表现为持续高热、咳嗽、呼吸困难等症状，并可迅速进展为感染性休克、ARDS、急性肾功能损伤等。人感染H7N9禽流感患者胸部影像学都表现为肺实变及磨玻璃样改变，实验室检查可呈现淋巴细胞减少症和血小板减少症，及时采取相应的化验检查有利于疾病早期诊断。早期抗病毒治疗与预后相关，故及早诊治可有效防止疾病进展、改善疾病预后。2、人感染H7N9禽流感患者肺部典型的病理表现为急性弥漫性肺泡损伤、肺出血及后期弥漫性肺损伤后纤维增生。H7N9禽流感病毒感染后，气道粘蛋白MUC2、MUC5B和MUC5ACmRNA表达量可能增加，肺上皮紧密连接蛋白CLDN1、CLDN5、CLDN7和CLDN8的mRNA相对表达量降低，CLDN3mRNA相对表达量明显升高，肺泡表面活性蛋白SFTPA、SFTPC和SFTPDmRNA相对表达量明显降低，而SFTPBmRNA相对表达量明显升高；肺部的防御屏障即气道粘液纤毛清除功能、肺上皮细胞屏障功能、肺泡结构稳定性及肺部固有免疫能力可能发生改变。总之，人感染H7N9禽流感肺部粘蛋白呈高分泌状态，紧密连接蛋白表达发生改变，肺上皮细胞屏障功能可能改变，肺表面活性蛋白表达发生改变，肺泡结构稳定性及固有免疫反应可能发生改变。但是，由于本课题纳入病理数较少，数据可能存在偏倚，需要增加样本量进一步研究。32 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附录表1H7N9组及对照组肺部紧密连接蛋白相对表达量(×10-3)CLDN1CLDN3CLDN7CLDN5CLDN18Normal6.5505.3770.5589.051152.487H7N94.1589.7770.0035.19010.167表2肺部紧密连接蛋白相对表达量的比值（H7N9患者/对照组）CLDN1CLDN3CLDN7CLDN5CLDN18H7N9/NL0.6353.6780.0070.5730.067表3H7N9组及对照组肺部表面活性物质的相对表达量SPASPBSPCSPDNL0.8350.9744.6930.029H7N90.05320.1030.008表4肺部表面活性物质相对表达量的比值（H7N9患者/对照组）SPASPBSPCSPDH7N9/NL0.0642.0540.0220.26943 表5H7N9组及对照组肺部粘蛋白的相对表达量MUC2MUC5ACMUC5BNL7.281E-080.0267.281E-08H7N90.00050.0660.004表6肺部粘蛋白相对表达量的比值（H7N9患者/对照组）MUC2MUCACMUCBH7N9/NL7237.5552.53352911.24144 综述人感染H7N9禽流感在2013年3月，3个上海和安徽的居民先后出现进行性进展的下呼吸道感染，被发现是感染了一种新型的流感病毒感染——H7N9禽流感病毒。患者一般症状表现为发热、咳嗽、呼吸困难，常出现急性呼吸窘迫综合症和多脏器功能衰竭等并发症，并且具有高病死率。本文对新型H7N9病毒的来源、流行特征、临床表现、诊疗措施等方面进行了总结。1人感染H7N9禽流感流行病学特征1.1流行概况人感染H7N9禽流感最先出现在长江三角洲地区，包括江苏、浙江和上海[1-6]，并且此地发病例数最高；发病例数第二的地区是广东，即珠江三角洲地区。其传播呈现从东到西的趋势[1]。到目前为止，人感染H7N9禽流感实验室确诊病例已超过1600例，其病死率近40%（CDC）。H7N9禽流感病毒感染病例中，男性患者较女性患者多[1,4,7]。就发病年龄而言，大多数患者发病年龄在40-60岁之间，有的甚至大于60岁[1,3]。自2013年，每年都会出现一次发病高峰，至今共出现5次H7N9发病高峰，且发病高峰均为冬春季[1,8]；研究表明，H7N9在第五次高峰流行中发生了如下改变，发病年龄由老年趋向于中年，发病地区由城市趋向于郊区及农村[9]。1.2传染源将患者呼吸道分泌物和咽试子中获得的病毒基因与家禽中获得的H7N9禽流感病毒对比发现有高度同源性[10,11]，且85%的患者患病前有家禽接触史[1]，通过控制活禽市场及捕杀感染禽类极大的降低了发病率[12]，以上均直接或间接的证明人感染H7N9禽流感的传染源可能是感染H7N9禽流感病毒的禽类；此外，也存在密切接触人感染H7N9禽流感患者后发病的病例，故不除外人传人可能[13]。1.3传播途径传播途径主要通过呼吸道传播[14]，也可能通过接触感染禽类的分泌物或排泄物而获得感染或通过接触病毒污染的环境感染[8]；散养家禽和活禽市场是人感染H7N9禽流感感染的重要危险因素[15]。此外，有少数家族聚集发病的报道，这表明可能存在有限的人传人现象，但还未发现3个以上的聚集性发病病例。45 1.4易感人群人感染H7N9禽流感患者多为中老年人，且有高血压、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病、糖尿病、冠状动脉性心脏病等基础疾病，且长期服药[16]。研究表明患病的严重程度与基础疾病、年龄、免疫状况有高度相关性[8,16]。患者男性多与女性，且多数居住农村，可能与农村中老年男性因生活或工作原因较多接触禽蛋类和接触饲养禽类环境有关[17]。2新型H7N9禽流感病毒的遗传学2.1H7N9禽流感病毒的基因来源及重组H7N9禽流感病毒由8个重要单链vRNA片段组成。每个片段编码一种重要的蛋白，包括主要的表面糖蛋白血凝素HA和神经氨酸酶NA、核衣壳蛋白NP、3个RNA依赖的RNA核糖核酸聚合酶（RdRP）的亚单位（PA、PA-X、PB1、PB2、PB1-F2）、结构蛋白（M1、M2）及非结构蛋白NS1和NS2[18]。通过基因测序发现基因片段HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS均为禽源性；其中HA基因与甲型/鸭/浙江/12/2011(H7N3,亚型ZJ12)具有高度相似性，NA基因与甲型/野鸟/韩国/A14/2011(H7N9,亚型KO14)非常接近，其余6个内部基因与甲型/燕雀/北京/16/2012/H9N2非常相似[2]。物种分析结果表明新型重组甲型禽流感病毒H7N9至少是三重重组的产物，其中有6个内部基因来源于甲型禽流感病毒H9N2，HA基因来源于甲型禽流感病毒H7N3，NA基因来源于甲型禽流感病毒H7N9[2]。2.2遗传漂变和基因转移流感病毒表面的血凝素与宿主上皮细胞表面的血凝素受体结合，侵入细胞，在细胞内复制、表达、重组形成新的流感病毒，以出芽形式突出宿主细胞，但病毒表面的血凝素分子末端的唾液酸残基与宿主细胞的血凝素受体分子表面的糖基团以2-6或2-3糖苷键连接，使之不能脱离宿主细胞，神经氨酸酶可催化水解唾液酸与糖蛋白之间的糖苷键，使病毒颗粒脱离原宿主细胞感染新的上皮细胞。流感病毒对不同唾液酸糖苷键的亲和力是决定病毒致病范围和致病力的一个重要因素[19,20]。人呼吸道上皮细胞富含α-2-6受体[21]。人类流感病毒优先结合α-2-6唾液酸糖苷键,而大多数禽类病毒优先结合α-2-3唾液酸糖苷键[22,23]。H7和H5型病毒中的Q226L被报道可以增强与α-2-6受体结合力。实验室设计使HA的210环上的Q226L发生突变，发现可以将禽源性受体结合改变为人型受体结合，这可能提高了病毒空气传播的能力，与之前的报道相符[24,25]。而且，150环上糖基化位点的缺失可能降低与α-2-3禽源受体的亲和力。研究发现H7N9禽流感病毒HA基因可发生Q226L及G186V突变，由此可增强对α-2,6型受体（唾液酸受体）的结合能力；HA基因150环46 上发现T160A突变减弱了病毒与α-2,3型受体的结合能力[26]。在血凝素受体结合位点基因片段上发生G225D基因替换增加了病毒对α-2,6型受体（唾液酸受体）结合的能力，并增加了上呼吸道传播的可能性[26]。在神经氨酸酶(NA)茎区中发现了5个氨基酸的缺失（69-73），在H5N1中也有类似的缺失，与病毒对呼吸道趋性的改变有关或可以增强病毒复制能力[27,28]，这种缺失可能是病毒在家禽中的适应和传播导致的[29,30]。其他突变如PB2上的89V、A558V、D701N和E627K被认为与提高病毒在哺乳动物中的复制有关[31-33]。神经氨酸酶抑制剂及M2离子通道阻滞剂是一线的抗病毒药物。M2蛋白发生S31N置换，导致H7N9禽流感病毒对金刚烷胺等M2离子通道阻滞剂的抵抗[8]。NA的R292K、NAE119V、R152K和I222K/R可能导致H7N9禽流感病毒对神经氨酸酶抑制剂的抵抗[1,34,35]。3人感染H7N9禽流感的临床表现人感染H7N9禽流感潜伏期一般小于7天，。从发病到去医院看病的平均间隔时间为5天，从发病到实验室确认人感染H7N9禽流感感染评价间隔时间为8天，从发病到死亡的平均间隔时间为14天[1,4,36]。轻症患者一般表现为流感样症状，如发热、咳嗽、少痰，可伴有肌肉酸痛、头痛和全身不适。重症患者病情迅速进展为重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，并出现呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速出现急性呼吸窘迫综合征、感染性休克、横纹肌溶解、脑部病变、急性肾损伤及继发感染等并发症，最终可导致死亡[2,37-43]。4人感染H7N9禽流感的影像、实验室检查及病理改变胸部X线及胸部CT主要表现为单侧或双侧肺实变、磨玻璃样改变等，并可进展为白肺。此外，还可出现胸腔积液、气胸、纵隔气肿、皮下气肿等[43,44]。实验室检查结果显示白细胞正常或轻度降低。天冬氨酸转移酶、肌酸激酶、乳酸脱氢酶水平升高[11,43]。急性期患者血清中细胞因子及趋化因子MIG、IP-10、MCP-1、IL-8、IL-6等显著增高，提示“细胞因子风暴”可能是导致患者重症感染的机制之一[11]。尸检发现患者肺内表现为急性弥漫性肺损伤和巨大化肺泡细胞、肺泡间系出血、后期弥漫性肺泡损伤后肺纤维化及肺泡二型上皮细胞胞核及胞浆核蛋白沉积[45,46]。其他脏器也受到累及，如骨髓像可见嗜血细胞现象、脾组织可见淋巴组织萎缩、肝组织可见空泡状脂肪变性、肾组织可见肾小管变形及坏死及骨骼肌可见横纹肌溶解等[45]。47 5疫苗疫苗接种是控制人类流感病毒感染传播的主要措施[35]。在WHO协调下研发的人畜共患流感候选疫苗病毒（CVVs）仍然是防备流感大流行的全球战略的重要组成部分。人畜共患流感候选疫苗病毒（CVVs）的选择和研发是及时研发疫苗的第一步，但是并不意味着可以开始推广生产。2013年5月，WHO推荐了A/Anhui/1/2013（H7N9）病毒作为CVV。但是，自2016年以来，一些H7N9禽流感病毒在接种了A/Anhui/1/2013和A/Anhui/2/2013的CVVs的雪貂中的抗血清反应并不理想[47]。因此，在2017年3月，WHO又推荐了一个新的A/Hunan/2650/2016CVV。另外，高致病性的H7N9禽流感病毒与2013CVVs在抗原上有明显的不同。因此，又一个新的源于A/Guangdong/17SF003/2016的CVV被推荐[47]。基于经典重组形式的（H7N9）疫苗还没有被报道。由反向遗传学技术构建的（H7N9）疫苗株系已经成功，其中包含H7N9禽流感病毒的HA和NA基因，以及来自A/PuertoRico/8/34（PR8）病毒的6个内部基因[47]。此外，一些新型疫苗正在研发当中。H7N9禽流感病毒样颗粒（VLP）疫苗，是由A/Anhui/1/2013的全长度、未经修饰的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）和来自A/Indonesia/05/2005（H5N1）的基质蛋白1（M1）组成的[48,49]。A/Anhui/1/2013H7N9VLP疫苗是利用重组杆状病毒在昆虫细胞中生产的。H7N9VLP可诱导相对较高浓度的HI抗体，可以与任何佐剂一起对抗同源病毒。而且，H7N9VLP还可以诱导产生抗神经氨酸酶（NA）抗体。A/anhui/1/2013（H7N9）感染接种H7N9VLP的野生鼠的挑战证明了接受H7N9VLP疫苗的动物存活率很高，数据显示重组H7N9疫苗可以快速发展，并具有免疫原性和有效性，支持在男性中作为流行性禽流感H7N9疫苗候选疫苗[49]。科学家们在雪貂中开发并评估了一种基于a/Leningrad/134/17/57（H2N2）冷适应供体病毒的鼻内流感减毒疫苗（LAIV）[50]。结果表明，LAIV在雪貂中毒性减弱、安全，并可以诱导较高的HA和NA抑制和病毒中和滴度。这种对HA的抗体对部分H7株系也有交叉反应。在雪貂模型中，H7N9LAIV可预防严重疾病和死亡，并抑制病毒的复制。巴克斯特开发了一种利用非辅助的Vero细胞培养技术依据A/Anhui/1/2013（H7N9）获得的减毒H7N9全病毒疫苗[51]。在小鼠和豚鼠体内，全病毒疫苗48 产生剂量依赖性的H7N9特异性的HI、MN和NA抗体。免疫接种的老鼠以一种剂量依赖性的方式免受致命的H7N9禽流感病毒感染。H7N9和H1N1pdm09疫苗同样具有免疫性。此外，在MDCK细胞中也采用了蛋源性流感H7N9重组。流感H7N9全病毒疫苗抗原是使用微载体培养系统制造的。MDCK细胞衍生的流感H7N9全病毒疫苗候选疫苗在雪貂中具有免疫性和保护作用[52]。H7DNA-H7N9单价灭活疫苗在Ⅰ期随机临床试验中是安全的和有免疫原性。通过H7N9单价灭活疫苗加强后的新型H7DNA疫苗是安全的、耐受性良好，尽管与单独使用单价灭活疫苗相比会引发更高的HAI和中和抗体效价[53]。首次以HA为基础的结构设计方法产生重组的复制性H7N9病毒疫苗(H7N9-53TM)，这种疫苗显示出广泛的保护作用。在H7N9-53TM的HA蛋白中包含一个替代的H3HA跨膜区域（TM）。在小鼠体内，与包含野生型HA的H7N9-53WT减毒疫苗相比，灭活的H7N9-53TM疫苗可以显著地提高HI滴度、HA特异性IgG滴度和IFN-γ产物。而且，经过H7N9-53TM免疫的小鼠对同源的H7N9-53病毒完全免疫、异源的H7N9禽流感病毒部分免疫[54]。6耐药和替代药物由于对M2阻滞剂的耐药性，在H7N9禽流感病毒感染期间，使用了神经氨酸酶（NA）抑制剂（NAIs），尤其是奥斯他韦和帕拉米韦，以减轻感染患者的疾病严重程度。然而，与其它抗病毒药物一样，耐药病毒变异的出现可能会影响到NAIs的治疗效果。自从2013年人感染H7N9禽流感爆发后，从患者中分离出的NA耐药位点已被报告：E119V、R292K、R152K和I222K/R等[1,34,35]。如上所述，在H7N9禽流感病毒中报告了携带减少对神经氨酸酶抑制剂敏感性标记的病毒变异，因此有必要研究其他类别的药物是否可以控制人感染H7N9禽流感。DAS181是一种具有丝分裂酶活性的重组融合蛋白，从呼吸道上皮细胞中去除唾液酸受体，防止流感病毒的附着和复制。结果表明，在小鼠体内，DAS181可以很好地抑制野生型H7N9禽流感病毒和其具有耐药性的R292K变异的H7N9禽流感病毒的复制[55]。利巴韦林是一种具有广泛代表性的广谱核苷抑制剂，用于阻断病毒RNA和信使RNA的合成和修饰。研究表明，利巴韦林对耐药的H7N9禽流感病毒感染有效[56]。一些关于H7N9禽流感病毒转录的研究表明，几种激酶抑制剂和FDA批准的药物，如曲格列酮和二甲胺四环素，可以调节宿主对H7N9禽流感病毒的反应，这些药物可能起到一定的抗病毒作49 用[57]。一种具有抑制H7N9禽流感病毒复制的天然干扰素AlferonN(IFN-α-n3)已投入使用[47]。氨羟二磷酸二钠具有抑制小鼠体内炎症反应与病毒复制的作用[58]。此外，有报道表示连花清瘟胶囊、疏风清热胶囊、银翘冲剂、麻杏石甘汤、金花清感颗粒等中药对禽流感有一定疗效[59]。7结语从2013年至今，大多数人感染的H7N9禽流感病毒是LPAIH7N9病毒，但最近在第五次流行高峰中发现了一些高致病性禽流感病毒株。第五次流行高峰发生的时间较早，扩散到更多地区，感染的人数比之前的四次流行高峰都要多。人感染H7N9禽流感病死率高，并有再发流行高峰风险，故人感染H7N9禽流感的防治仍不容懈怠。需要加强活禽市场的监管、感染病例的隔离等预防措施；并且需要加快深入研究其发病机制、研发新型抗病毒药物及特异性疫苗。综述参考文献[1]SuS,GuM,LiuD,CuiJ,GaoGF,ZhouJ,etal.Epidemiology,Evolution,andPathogenesisofH7N9InfluenzaVirusesinFiveEpidemicWavessince2013inChina[J].Trendsinmicrobiology.2017,25(9):713-28.50 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致谢光阴荏苒，日月如梭，转眼间研究生生涯已近尾声。时光倾吐芳华,岁月如墨留香。回首在这青春校园里的青葱岁月，一帧帧一幕幕，如在目前，却又飘渺悠远，目想心存，感念万千。首先要感谢我的研究生导师吴琦教授，感谢老师这三年的谆谆教诲。老师医术精湛、医德高尚、德才兼备、师道尊严，我紧随其侧，耳融目染，受益良多。尽管医疗环境紧张，老师依旧不忘初心，在治病的同时还注重与患者的沟通，缓解患者的焦虑，并根据患者的病情、经济条件等情况选择最佳的治疗方案。“凡大医治病，必当安神定志，无欲无求，先发大慈恻隐之心”，老师作为大医，实至名归。尽管临床经验丰富，老师却不骄不躁，依然在繁忙的工作之余抽出时间继续学习，展现出了对医学的认真、热忱和无尽的追求。尽管忙得席不暇暖，老师也不忘关心我的生活、督促我学习。经师易遇，人师难遇，跟在老师身边三年的时间，老师不仅教给我很多医学知识，更重要的是交给我为人为医的道理，为人要尊敬师长，谦虚不骄傲，低调不张扬，为医要严谨负责，并关注患者的心理、经济等多方面的因素。在老师的潜移默化下，我对医学有了更浓厚的兴趣和热爱。虽然只是短短三年，但老师却是我一生的标杆，为我以后的医学之路树立了榜样，是我的人生导师。在此毕业之际，谨向我的导师吴琦教授献上我最真诚的感谢和最崇高的敬意！其次，我要感谢天津市海河医院基础医学实验中心的陈怀永研究员及其带领的科研团队。我非常幸运和荣幸的加入这个团队学习。陈怀永老师是基础医学方面的科研达人。在科研中，陈老师秉持严谨的科研态度，遵循求实的科研准则，利用开阔的科研思路克服了一个又一个的科研难题。在教学上，陈老师对学生恩威并重、公平公正。在这种实事求是、严谨认真、刻苦钻研的科研氛围的熏陶下，我拥有的一定的科研思维和科研素养，并真正掌握了一定的科研方法和技能。感谢科研团队里的李雪师姐、李玉师姐、李宽师兄和张秋阳的帮助，李雪师姐温婉贤淑、独立内敛，李玉师姐善解人意、笃实好学，李宽师兄风趣幽默、积极进取，张秋阳处事洒脱、不拘小节，四人各有千秋、相得益彰。刚去的时候，我是实验小白，感谢他们在各种实验方法、技术、原理上的耐心57 指导、细致解答，感谢他们在我生病的时候送我去医院跑前跑后，感谢他们让我在实验室里的生活在欢乐中度过。感谢孙昕副院长和武俊平科长对我们研究生生活、学习和科研上提供的帮助，让我们没有后顾之忧。感谢海河医院于洪志、王星、侯志丽、邵红霞老师，感谢他们在课题上给予的帮助，从他们身上我学到了勤奋、拼搏和不懈追求。感谢徐龙师兄的关心和照顾，各种琐碎的杂事感谢徐龙师兄的照拂。感谢我的同门。感谢已经毕业的杨立师兄、李红蔚师姐、李凡师姐、张素倍师姐、杨书香师姐，他们在生活和学习中给过我很多的帮助。杨立师兄热心助人、古道热肠，在科研上非常努力刻苦，教会我很多科研技巧，在生活和学习上给我很多提点和经验。张素倍师姐恬静贤淑、兰心蕙质，教会我很多科研方法，生活和学习中的难题也感谢她的帮助和疏导。他们让我的研究生生活不枯燥、不孤单、不茫然、不空虚，他们使我的研究生生活完整、充实而快乐。感谢天津医科大学总医院呼吸科的冯靖主任、谢薇老师和张鹏师兄，在气管镜的学习十分难得的，冯主任造诣高深、技术精湛，张鹏师兄精于病理阅片，和他们一起工作，收获很多。感谢呼吸科曹杰主任、吴月清老师、王娟老师、李津娜老师、任毅老师和护士老师，他们在临床中的诊疗逻辑思维清晰、对病人认真负责，在病房的工作中让我学到了很多。感谢我的室友，她们热爱生活、热爱医学、积极向上、吃苦耐劳、斗志昂扬，和她们一起学习、一起玩闹、一起哭、一起笑，这样的日子单纯而美好，时光深处，岁月静好。感谢她们这三年的陪伴，让我度过了一段充实、快乐的时光。最要感谢的是家人对我的支持、理解和包容，家是我最坚强的后盾，是我奋斗的动力，也是我失意时的慰藉。没有家人的付出、奉献就没有今时的我，感谢家人给我最无私的爱，我会带着这份爱继续前行，乘风破浪。最后感谢我所有的老师、同学，感谢我遇到的每一个人、每一件事。所有的事都不是偶然，他们或它们不断的打磨历练我，让我不断的成长、长成。今后我会继续怀着一颗感恩的心走下去。王巧兴2018年3月58 个人简历姓名：性别：女王巧兴出生年月：1989年5月籍贯：河北主要学习和工作经历：（从本科开始）2010年9月-2015年7月中国医科大学临床医学专业，获医学学士学位2015年9月-至今天津医科大学内科学呼吸系病专业59