海藻对博莱霉素致间质性肺病大鼠的作用机制研究

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．．Ｖｙ枝．■分类号：单位代码：１０４４１＞２０１３０２５４２：密级：学章±学位化女＇ｔ中文题目：海藻对博莱霉素致间质性肺病＇．大麵作用奶制硏究：教八，ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＳｅａｗｅｅｄｏｎ，英文题目嘴奔是：＂！％ｂ－ｓｓｅｏｒａｔｓ讓ｌｅｏｍｙｃｉｎｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｌｕｎｇｄｉｅａｆ｜胃申请人姓名入学年月２０１３年９月学科专业中西医结合临床指导教师张传．—；ｉ学位类型临床医学专业学位Ｉ＇‘’■．．，Ｖ２０１６年巧２旧＇一．一 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立完成的，文中除注明引用的内容外，不包含任何其他已经发表的科研成果。。对本文研究做出重要贡献者，均已在文中明确方式表明本声明的法律责任完全由自己承担。＾＾口＾论义作者答名／金裳蘇导师答名＞＾八、女＞／日期＿／＾关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部口机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅１＾将本学位论文的全部或。本人授权山东中医药大学可部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。论（保义作密论者答文在解密后应遵守此规定）名导师答名＾日期Ｖ 提要目的：为明确海藻在间质性肺病治疗中的作用机制，通过动物实验造模法建立间质性肺病大鼠模型，从病理切片观察、氧化应激机制、相关基因表达及细胞因子等多角度探究海藻对间质性肺病大鼠的作用机制。方法：根据课题要求，选取化痰药海藻作为本次研究对象。动物实验研究：将60只清洁级健康Wistar雄性大鼠，随机分为6组：空白对照组、间质性肺病模型组、高浓度海藻组、中浓度海藻组、低浓度海藻组、吡非尼酮组。在IVC鼠笼中适应性喂养3d后，采用气管内滴注博莱霉素的方法造模，根据分组给予对应的药物灌胃进行干预。喂养第28d处死各组大鼠，ELISA法检测各组大鼠肺组织匀浆中VEGF、TGF-β1的表达水平，化学荧光法检测各组大鼠肺组织匀浆中SOD、MDA、GSH的含量。实验结果及结论：动物实验研究结果表明，应用海藻煎取液后，大鼠各项检测指标较模型组均有不同程度改善，具有统计学意义,部分指标的治疗效果与海藻的剂量有关。提示化痰类中药海藻可以通过多途径对间质性肺病大鼠起治疗作用，其机制可能与纠正间质性肺病大鼠氧化-抗氧化失衡，改善并延缓其气道重塑，抑制病变部位血管新生等有关。关键词间质性肺病；海藻；吡非尼酮；SOD；MDA；GSH；VEGF；TGF-β1 Studyonthemechanismofseaweedonbleomycin-inducedinterstitiallungdiseaseofratsSpeciality:MedicalDepartmentofTCMAuthor:JinYanqiangTutor:ProfessorZhangWeiAbstractObjective:Inordertoclarifytheroleofseaweedinthetreatmentofinterstitiallungdisease,throughanimalexperimentmodelingmethodtoestablishinterqualitypulmonarydiseaseratmodel,fromtheobservationofpathologicalsection,mechanismofoxidativestress,geneexpressionandcytokines,multianglestudyonthemechanismoftheeffectofseaweedoninterstitiallungdiseaseinrats.Methods:Accordingtotherequirementsofthetask,selecttheseaweedastheresearchobjectofthisstudy.Animalexperiment:ThisexperimentchoosestheSPFlevelmaleWistar60rats.Afteradaptivefeeding7days,randomlydividedinto6groups:Theblankgroup,modelgroupandhighconcentrationofseaweedgroup,middleconcentrationofseaweedgroup,lowconcentrationofseaweedgroup,pirfenidonegroup.Afteradaptivefeeding3days,weusethemethodofintratrachealbleomycintoestablishinterstitiallungdiseaseratmodelandgivethecorrespondingdrugintragastricadministration.Theratsweresacrificedattwenty-eighthdays,thepathologicalchangesinlungtissueofratsineachgroupwereobservedunderlightmicroscope.ELISAmethodwasusedtodetecttheexpressionofVEGFandTGF-β1inlunghomogenateofratsineachgroup.ThecontentofSOD,MDAandGSHinlunghomogenateofratsineachgroupwasdetectedbychemicalfluorescencemethod.ResultsandConclusion:TheresultsofanimalexperimentsshowedthatAfterapplicationofseaweedextractthedetection,thedetectionindexesoftheratswereimprovedcomparedwiththemodelgroup,someindicatorsoftreatmentoutcomerelatedtodoseofseaweed.Themechanismofactionofseaweedforinterstitiallungdiseaseinratsmayberelatedtotheoxidativestressstate,improvingairwayremodeling,inhibitingtheneovascularization.KeywordsInterstitiallungdisease;Seaweed;Pirfenidone；SOD；MDA；GSH；VEGF；TGF-β1 目录引言...............................................................................................................................1第一部分实验研究...........................................................................................................2一、实验材料.......................................................................................................................2（一）实验动物...................................................................................................................2（二）实验试剂和药物.......................................................................................................2（三）实验仪器和设备.......................................................................................................2二、实验方法.......................................................................................................................2（一）实验分组与方法.......................................................................................................2（二）标本采集与指标检测...............................................................................................3三、统计学处理...................................................................................................................5四、实验结果及分析...........................................................................................................5（一）一般情况比较...........................................................................................................5（二）肺组织外观及病理观察...........................................................................................5（三）各组大鼠肺组织中SOD、MDA、GSH的含量....................................................7（四）各组大鼠肺组织中TGF-β1、VEGF的表达水平..................................................8第二部分讨论...............................................................................................................10一、中医药治疗间质性肺病的理论基础.........................................................................10（一）病名.........................................................................................................................10（二）病因病机.................................................................................................................10（三）治法治则.................................................................................................................11二、痰浊在间质性肺病中的研究.....................................................................................11（一）中医学对痰的认知.................................................................................................11（二）痰浊的产生及致病特点.........................................................................................12（三）化痰法应用于肺痿的理论基础.............................................................................13三、海藻的现代药理研究.................................................................................................14（一）抗氧化作用.............................................................................................................14（二）免疫调节作用.........................................................................................................15 （三）抗病毒、抗菌作用.................................................................................................15（四）抗肿瘤作用.............................................................................................................15四、海藻对间质性肺病大鼠作用机制的实验研究分析.................................................15（一）海藻对间质性肺病大鼠抗氧化作用的影响.........................................................15（二）海藻对间质性肺病大鼠转化生长因子表达的影响.............................................17（三）海藻对间质性肺病大鼠血管内皮生长因子表达的影响.....................................18结语.............................................................................................................................19参考文献.............................................................................................................................20综述.............................................................................................................................24致谢.............................................................................................................................31发表论文.............................................................................................................................33 引言本论文系国家自然科学基金（编号：81273704）“化痰类中药多途径调节肺间质纤维化抗氧化机制的研究”中海藻对肺纤维化模型的干预作用部分。在近年来的实验研究及临床实践中表明，炎症反应、氧化应激、细胞因子异常释放、免疫系统失调、微循环障碍及细胞增殖、重构等与肺间质纤维化的形成有关，其中炎症反应、细胞因子异常释放等启动因素均与氧化应激有关。课题组通过体外抗氧化实验筛选，选取海藻作为本实验研究对象之一，在进行抗氧化指标检测同时，对其它机制也进行了实验如气道重塑、血管生成方面，以期探究化痰类中药海藻在肺间质纤维化发展过程中的治疗机制。间质性肺病（Interstitiallungdisease，ILD）病因较多，目前仍未明确其发病机制，主要累及肺间质以及肺泡的弥漫性肺疾病。特发性肺纤维化（Idiopathicpulmonaryinterstitialfibrosis，IPF）是原因不明的慢性间质性肺疾病较为常见的代表性疾病，病理表现为UIP（Unusualinterstitialpneumonia），病情可进一步发展，可因呼吸衰竭而死亡。西医主要采取糖皮质激素或联合细胞毒性药物如环磷酰胺或硫唑嘌呤治疗本病，但长期使用存在一定的不良反应及疗效不确切性等。其中特发性肺间质纤维化发病迅速，进展快，预后差，2015年ATS/ERS/JRS/ALAT特发性肺间质纤维化治疗指南中强不推荐糖皮质激素等治疗，并没有强推荐用于IPF治疗的药物，[1]对吡非尼酮、尼达尼布等新药及抗酸治疗等治疗改为有条件推荐。其发病率、病死率的升高困扰临床诊治。近些年来，中医药治疗本病有较好疗效，多项实验及临床研究证实多种单味中药或中药复方可延缓间质性肺病的进展，提示其有较好的应用前景。近些年来间质性肺病的中医药研究取得重大进展，对化痰法及化痰药物防治间质性肺病的机制已有了一定的研究，且部分化痰药物对本病有较好的治疗作用，但是缺乏从海藻单味药角度研究其对间质性肺病的干预作用。本研究通过博莱霉素致间质性肺病大鼠模型作为实验观察对象，分析海藻对本病的作用机制，为中医药治疗间质性肺病的进一步研究及中医临床遣方用药提供理论依据。1 第一部分实验研究一、实验材料（一）实验动物SPF级雄性Wistar大鼠60只(山东大学实验动物中心提供，动物生产许可证号(SCXK鲁20110009号)，鼠龄为49±3天，重量为（200±20）g。（二）实验试剂和药物10%水合氯醛(山东大学齐鲁医院，批号：20140706)；博莱霉素（BLM）（日本化药株式会社，进口药品注册证号H20090885）；海藻（购自山东中医药大学附属医院）；PBS缓冲液(pH=7.4)；大鼠SOD、GSH、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)；大鼠TGF-β1、VEGF试剂盒（厦门慧嘉生物科技有限公司）；吡非尼酮（北京康蒂尼药业有限公司，批号141102）（三）实验仪器和设备显微镜（日本奥林巴斯，BX51T-PHD-J11）；电子天平（万分之一）（上海卓精电子科技有限公司）；微量高速离心机（国产，型号：TG16W）；移液器（德国Eppendorf）；洗板机：（芬兰ThermoLabsystems，型号：AC8）；医用微波炉（浙江临安爱迪仪器厂YWY781B型）；低温冰箱（日本三洋公司，型号MDF-382E型）；切片机（德国莱卡RM2015）；HH-2数显恒温水浴锅（金坛市城东新瑞仪器厂）；多功能酶标仪（芬兰LabsystemsMultiskanMS，型号：352型）；隔水式恒温培养箱（国产，型号：GNP-9080型）；病理图像分析（CX41-32rflOLYMPUS）；美国GATANCCD图像处理系统；显微数码相机，CMOS（日本奥林巴斯）；FSH-2A可调高速匀浆机（中国上海医疗器械厂）；多功能真彩色细胞图象分析管理系统（美国MediaCybernetics公司Image-ProPlus）。二、实验方法（一）实验分组与方法1.实验分组选取60只清洁级健康雄性Wistar大鼠，采用IVC鼠笼喂养，将室温设定为24℃～26℃，注意保持笼内湿度，并对食物、水、垫料进行灭菌处理。在实验过程中对食物、水不做限制。对大鼠适应性喂养3d后，采用随机数字表法将其分为6组，每组10只：空白对照组、间质性肺病模型组、高浓度海藻组、中浓度海藻组、低浓2 度海藻组、吡非尼酮组。2.造模方法[2][3]参照张伟等及Szapiel的方法，并加以改良，于室温环境下，将大鼠称重后根据3.5ml/Kg的比例腹腔内注射10%水合氯醛，麻醉后，采取仰卧位固定于鼠板，头低位以便暴露声门，右手水平插入16号套管针，于咽喉部时压低针尾，针头抬高约15～30度，缓缓插入大鼠气管内部约3/4长度，拔出针芯。B、O、M、N、Y组大鼠1s内经气管内一次性灌注博莱霉素药液（按5mg/kg剂量），A组大鼠经气管内一次性灌注等体积的无菌生理盐水。灌注博莱霉素后立即将大鼠直立旋转数圈，以便于药物均匀分布在肺内各气道，用听诊器可听到造模大鼠喉中哮鸣音，提示造模成功。待动物清醒后常规饲养3d。3.给药方法造模完成后第3天起，空白组、模型组正常饮食，对于中药组及吡非尼酮组分别给予不同类别药物，每天给药一次，中药组每日灌胃的低、中、高三种海藻煎取液浓[4][5]度分别按人-鼠等效量的0.5倍、1倍、2倍给药。大鼠所需药量n=N/70×m×6.3（大鼠重量m，人体重量按70kg,人所需药物N，大鼠所需药物量n）。高浓度海藻组大鼠每日给予海藻生药量1.08g/kg灌胃，中浓度海藻组每日给予海藻生药量0.54g/kg灌胃，低浓度海藻组大鼠每日给予海藻生药量0.27g/kg灌胃，吡非尼酮组大鼠每日给予吡非尼酮0.162g/kg灌胃。模型组：按照4ml/kg的剂量给予生理盐水灌胃；空白组：正常饲养，相同温度、湿度的环境下自由饮食，饮水、喂食时间及进食量均与其它组大鼠同步，不予以任何药物干预，28天后处死动物。（二）标本采集与指标检测1.动物一般情况监测每天观察大鼠的日常活动，全身皮毛光泽度，对外界反应的灵敏度，体重，进食量，口唇鼻毛色泽，呼吸频率，鼻腔分泌物，排泄物性状及死亡等情况。2.大鼠肺组织病理观察用10%水合氯醛溶液（3.5ml/kg）对各组大鼠进行充分麻醉后打开胸腔，取出完整新鲜右下肺组织后立即应用PBS缓冲液清洗肺组织周围的血液等污物，经10%中性福尔马林48小时充分固定后，梯度酒精进行脱水，二甲苯透明，再经过石蜡包埋，4μm连续切片4张，并通过常规HE染色，光镜下观察肺组织。并剪取左下肺组织于3 PBS缓冲液中清洗，清洗后置于密封袋中，置于-80℃冰箱中保存，择期进行其他法检测。3.化学荧光法检测各组大鼠肺组织中SOD、GSH、MDA的含量取肺组织洗净后称重，在冰盘上剪碎，加入生理盐水是肺组织的9倍，冰浴下以转速15000r/min在组织匀浆机中研磨，制成10%的肺组织匀浆，以12000r/min转速4℃下离心15min，留取上清液，经过蒸馏水调零、比色，测定吸光数值并进行计算。后根据南京建成生物工程所试剂盒说明书测定SOD、GSH、MDA含量。4.ELISA法检测各组大鼠肺组织中TGF-β1、VEGF的表达水平经同样步骤留取肺组织上清液，应用ELISA法测定肺组织匀浆中TGF-β1、VEGF的表达水平。（具体步骤如图1）表1ELISA法检测各组大鼠肺组织中TGF-β1、VEGF的表达水平具体步骤4 三、统计学处理采用SPSS17.0软件对所有收集到的实验数据进行统计学的处理，连续变量用(X±s)的方式表示，组间及组内比较均应用单因素方差进行分析。P<0.01表明差异具有显著统计学意义，P<0.05提示差异具有统计学意义。四、实验结果及分析（一）一般情况比较空白组大鼠活动灵活，饮食正常，反应灵敏，毛发顺滑，呼吸匀称，体态均匀，体重逐渐增加，偶见厮咬打斗现象，无特殊不良表现。造模后各组大鼠出现不同程度的活动能力下降，拱背蜷缩，毛发凌乱、脱毛、毛色暗淡无光泽，反应迟钝，懒动倦怠，易被激惹，呼吸喘促，频率增加，甚至出现呼吸困难的表现，同时口鼻分泌物增加，饮食量较少，体重增幅降低。其中空白组死亡1只，模型组死亡2只，吡非尼酮组死亡2只，高浓度海藻组死亡0只，中浓度海藻组死亡0只，低浓度海藻组死亡2只。（二）肺组织外观及病理观察肉眼观大体标本示：空白组大鼠两肺呈粉红色，弹性良好，表面光滑；模型组及各药物组均可查见程度不同的点状的出血和灶状的瘀斑，其中模型组可发现肺脏表面苍白，肺部表面分布有灶状的瘀斑，表面凹凸不平、粗糙，双肺体积较空白组可见缩小，部分死亡大鼠肺叶呈暗红色、水肿明显，可见肺脓肿。模型组大鼠肺脏外观异常最为明显，用药组实验大鼠双肺外观均出现不同程度的异常表现，但优于模型组。肺组织病理切片观察（HE染色放大200倍）：图1-1空白组空白组：肺泡间隔未见增厚，肺内结构清晰，未见炎性改变，肺泡壁无水肿、充血及纤维组织增生，肺泡腔内无明显渗出，呼吸膜厚度正常（见上图）；5 图1-2模型组模型组：间质毛细血管充血明显，部分肺叶存在出血，大鼠肺泡结构破坏，间隔明显增厚增宽，存在大量炎性细胞浸润，纤维细胞和胶原纤维增生明显，泡壁增厚水肿，部分肺泡腔融合、闭陷（见上图）；图1-3吡非尼酮组吡非尼酮组：大鼠肺泡结构呈现轻度破坏，肺泡间隔增厚增宽、充血，光镜视野中可见到炎症细胞浸润及纤维组织轻度增生（见上图）；图1-4高浓度海藻组高浓度海藻组：间质毛细血管轻度充血、水肿，肺泡壁增厚水肿，轻度炎性细胞浸润，纤维组织轻度增生（见上图）；图1-5中浓度海藻组中浓度海藻组：大鼠肺泡结构破坏较轻，肺毛细血管可见轻度充血，间质毛细血管轻度增生，肺泡间隔增厚且明显变形，存在炎性细胞浸润及成纤维细胞增多（见上图）；6 图1-6低浓度海藻组低浓度海藻组：大鼠肺泡结构呈现破坏，肺泡间隔增宽增厚、充血、少量水肿，存在炎性细胞浸润，成纤维细胞增多（见上图）。（三）各组大鼠肺组织中SOD、MDA、GSH的含量1.各组大鼠肺组织中SOD含量与空白组比较，模型组大鼠肺组织SOD活性明显减弱（P<0.01）；与模型组比较，吡非尼酮组、高浓度海藻组、低浓度海藻组大鼠肺组织SOD活性明显增强（P<0.01），中浓度海藻组大鼠组织SOD活性增强（P<0.05）；与吡非尼酮组比较，高、中、低浓度海藻组SOD活性无显著性差异；高、中、低浓度海藻组组间对比SOD活性无显著性差异。（见表2-1）表2-1各组大鼠肺组织中SOD含量（x±s）组别SOD含量空白对照组4.71±0.65模型对照组3.50±0.30▼吡非尼酮组4.67±0.49◆海藻高浓度4.64±0.52◆海藻中浓度4.41±0.90◇海藻低浓度4.60±0.40◆◆◇▼▽注：与模型组比较：P<0.01，P<0.05；与空白组比较，P<0.01，P<0.05；与吡非尼酮组●○比较：P<0.01，P<0.052.各组大鼠肺组织中MDA含量与空白组比较，模型组大鼠肺组织MDA含量明显增多（P<0.01）；与模型组比较，海藻中浓度组大鼠肺组织MDA含量明显降低（P<0.01），与模型组比较，吡非尼酮组、海藻高浓度组、海藻低浓度组大鼠肺组织MDA含量降低（P<0.05）；与吡非尼酮组大鼠比较，高、中、低浓度海藻组MDA含量无显著性差异；高、中、低浓度海藻组组间对比MDA含量无显著性差异。（见表2-2）7 表2-2各组大鼠肺组织中MDA含量（x±s）组别MDA含量空白对照组0.31±0.12模型对照组0.60±0.13▼吡非尼酮组0.34±0.12◇海藻高浓度0.36±0.07◇海藻中浓度0.28±0.25◆海藻低浓度0.35±0.14◇◆◇▼▽注：与模型组比较：P<0.01，P<0.05；与空白组比较，P<0.01，P<0.05；与吡非尼酮组●○比较：P<0.01，P<0.053.各组大鼠肺组织中GSH含量与空白组比较，模型组大鼠肺组织GSH含量明显减少（P<0.01）；与模型比较，吡非尼酮组及高、中、低浓度海藻组大鼠肺组织GSH含量明显升高（P<0.01）；与吡非尼酮组比较，高、中、低浓度海藻组GSH含量明显升高（P<0.01）；高、中、低浓度海藻组GSH含量组间对比无显著性差异。（见表2-3）表2-3各组大鼠肺组织中GSH含量（x±s）组别GSH含量空白对照组2.42±1.12模型对照组0.82±0.33▼吡非尼酮组2.64±1.72◆海藻高浓度4.83±1.01◆●海藻中浓度4.87±1.07◆●海藻低浓度4.02±1.23◆●◆◇▼▽注：与模型组比较：P<0.01，P<0.05；与空白组比较，P<0.01，P<0.05；与吡非尼酮组●○比较：P<0.01，P<0.05（四）各组大鼠肺组织中TGF-β1、VEGF的表达水平1.各组大鼠肺组织中TGF-β1的表达水平与空白组大鼠比较，模型对照组大鼠肺组织TGF-β1的表达水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，高浓度、中浓度海藻组大鼠肺组织TGF-β1的表达水平明显降低（P<0.01），吡非尼酮组大鼠肺组织TGF-β1的表达水平降低（P<0.05），低浓度海藻组大鼠肺组织TGF-β1的表达水平无显著性差异；与吡非尼酮组比较，高、中、低浓度海藻组TGF-β1的表达水平无差异；高、中、低浓度海藻组组间对比表达8 水平无显著性差异。（见表2-4）表2-4各组大鼠肺组织中TGF-β1的表达水平（x±s）组别TGF含量空白对照组156.42±31.94模型对照组214.61±20.13▼吡非尼酮组173.96±39.40◇海藻高浓度150.67±46.00◆海藻中浓度152.36±25.72◆海藻低浓度188.27±41.06◆◇▼▽注：与模型组比较：P<0.01，P<0.05；与空白组比较，P<0.01，P<0.05；与吡非尼酮组●○比较：P<0.01，P<0.052.各组大鼠肺组织中VEGF的表达水平与空白组大鼠比较，模型组大鼠肺组织VEGF的表达水平明显升高（P<0.01）；与模型组大鼠比较，吡非尼酮组、高浓度、中浓度海藻组大鼠肺组织VEGF的表达水平的表达水平降低（P<0.05），低浓度海藻组大鼠肺组织VEGF的表达水平无显著性差异；与吡非尼酮组比较，高、中、低浓度海藻组VEGF的表达水平无显著性差异；高、中、低浓度海藻组组间对比VEGF的表达水平无显著性差异。（见表2-5）表2-5各组大鼠肺组织中VEGF的表达水平（x±s）组别VEGF含量空白对照组176.61±24.39模型对照组256.89±37.61▼吡非尼酮组211.04±37.61◇海藻高浓度211.21±33.26◇海藻中浓度214.13±39.31◇海藻低浓度241.69±53.38◆◇▼▽注：与模型组比较：P<0.01，P<0.05；与空白组比较，P<0.01，P<0.05；与吡非尼酮组●○比较：P<0.01，P<0.059 第二部分讨论一、中医药治疗间质性肺病的理论基础（一）病名在中医古代文献中与间质性肺疾病相对应的描述及完全相同的病名并不存在，在中医学体系中与该病相关疾病有“肺痿”、“肺痹”、“肺胀”、“喘病”、“短气”、“络病”等，古代大多数疾病及病因、病机的研究仅为宏观整体、取类比象所及，其具体归属目前尚存在争议，且各专家学者各有其观点、论据及独具特色的辨证论治思路，但随[6]着对本病认识的逐渐加深，多数学者认为将其归为“肺痿”范畴更为贴切。“肺痿”的病名首次提出是在张仲景的《金匮要略》专著中，把肺痿列为专篇，对其病因、病机、症状、辨证展开较为详细的描述。《金匮要略·肺痿肺痈咳嗽上气病脉证治》曰：“寸口脉数，其人咳，口中反有浊唾涎沫者何？师曰：为肺痿之病”，“痿者萎也，如草木之萎而不荣”。另外《金匮要略·脏腑经络先后病脉证第一》中云：“息张口短气者，肺痿唾沫”。以上文献已经提出肺痿的主要临床表现有干咳、气促、憋喘或咳吐清涎痰液等。后世历代医家学者在前人记载描述的基础上总结出肺中燥热、肺气虚冷、久病损肺、误治津伤、外感六淫等为肺痿的主要病因，进一步补充对肺痿的认知。同样认识到肺痿是多种肺系疾病的慢性病理转归，如肺痨、喘哮、久嗽、肺痈等都有进展为肺痿的可能。唐代医家王焘在《外台秘要》中提到：“肺气嗽者，不限老少，宿多上热，后因饮食将息伤热，则常嗽不断，积年累岁，肺气衰便成气嗽，此嗽不早疗，遂成肺痿。”表明久病损肺以致肺痿。历代医家对肺痿预后差有详细的认识，金代张从正认为此证当属“死证”:“则变成肺痿⋯⋯渐至形瘦脉大，虽遇良医，亦成不救。呜呼!人之死者，岂为命耶?”明代医家陈实功在《外科正宗﹒肺痈论》中云：“又久嗽劳伤，咳吐痰血，寒热往来，形体消削，此必十死八九，最为难治。”表明肺痿在古代也是临床难题，病死率较高，历代医家潜心钻研，在近二千年的历代中医历史文献中，记载了大量应用中药方剂治疗肺痿的丰富经验。（二）病因病机当代医家学者对于间质性肺病高度重视，在前人研究基础上，并进行了大量实验研究及临床观察，对其病因、病机、治法方药进一步完善。张纾难认为本病为本虚标[7]实，本虚为气虚、阴虚为主，标实多为瘀血、痰浊、热毒等。周老认为先天禀赋不足、初起外邪犯肺，久病伤及肺脾肾，连及五脏。热灼津为痰，气虚、阴虚、血虚、10 [8]痰凝则致血瘀，痰瘀交结，肺络痹阻则成肺间质纤维化。曹世宏将先天不足、后天失调、肺脾肾虚及痰凝血瘀作为本病发病的关键原因。也有医家根据该病进展过程进行分期辨证。如不同病理阶段对应有不同的病机表现，如初起邪热伤肺、气阴两虚，迁延不愈，进一步导致阳气亏虚、痰凝血瘀，后期则以肺脾肾虚、痰瘀阻肺为主要病[9]机。姜良铎认为反复外感、环境毒邪、肺肾亏虚最易诱发本病，病理产物为瘀血痰[10]浊，痰瘀凝结深伏、肺络痹阻作为主要病机贯穿本病始终。孙增涛等认为该病的病机特点是因虚致病、因虚致瘀，本虚标实，虚实夹杂，以气虚血瘀为基本病机表现，[11]存在于本病各个阶段。“正气存内邪不可干，邪之所凑其气必虚”，综上所述，本病不外乎正虚邪实，病变进一步发展，虚实夹杂，或因先天禀赋不足，饮食劳倦内伤，或因年老体虚，或外受邪气，内生邪毒，导致肺失宣降，或气滞痰凝，或气虚血瘀，或瘀久化热，热毒凝结，病程缠绵难愈，肺络痹阻，肺叶痿弱不用而成肺痿。（三）治法治则对于肺痿的治疗，历代以来，医家积累总结了丰富的治疗经验，如《医门法律·肺痿肺痈门》中说：“大要缓而图之，生胃津，润肺燥，下逆气，开积痰，止浊唾，补真气以通肺之小管，散火热以复肺之清肃”，认为本病予培土生金之法，益气生津化痰，恢复肺之宣降。也有医家结合肺痿的病机演变过程，进行分期和分型，辨证施治。[12]周庆伟则将本病分为Ⅰ期肺泡炎期、Ⅱ期肺纤维化期、Ⅲ期蜂窝肺期。其中Ⅰ期治疗应清肺化痰止咳联合活血化瘀治疗，Ⅱ期治疗当在止咳化瘀解毒的基础上运用敛肺益气养阴之品，Ⅲ期则主要表现为脾肾气虚或阳虚，治之以温阳化气通络法。王小平［13］等将本病分为4型:痰浊阻肺型、气阴两虚型、燥热伤肺型、气滞血瘀型，并给予燥湿化痰、益气养阴、清肺润燥、活血化瘀等治疗。本病以祛痰活络、活血化瘀、补肺健脾益肾等法治疗，临床取得较好成效。近年来研究多集中在活血化瘀类及补益类中药方面的研究，而化痰类中药的研究相对较少且未成体系，故研究化痰药中海藻对间质性肺病的作用机制，具有较长远意义。二、痰浊在间质性肺病中的研究（一）中医学对痰的认知《内经》整篇文字无“痰”之论，“痰饮”一词首见于汉·张仲景《金匮要略》，并立专篇展开论述。“夫饮有四，何谓也？师曰：有痰饮、有悬饮、有溢饮、有支饮。”11 在本篇中，着重谈“饮”而略谈“痰”，并指出咳痰、喘、肿、小便不利等是痰饮的临床主要表现征象。隋唐至金元，痰的病理学说进一步发展，并提出“百病兼痰”的认识，痰和饮开始单独论述，痰浊变为一个单独病证。如隋代巢元方在《诸病源候论》中首次对痰病、饮病进行了区分，创立了痰病学说，提出“因病生痰”和“因痰致病”，导致病机错综复杂难愈。宋代杨仁斋《仁斋直指方》中提出“浊稠者为痰，清稀者为饮”，使痰与饮更加明确区分。金代张从正提出“痰迷心窍”，元代朱丹溪提出“湿热生痰”、“怪病多属痰”、“痰火生异证”等理论并加以详述完善。明·张景岳《景岳全书》：“痰即人之津液，无非水谷之所化⋯⋯而痰涎皆本血气，若化失其正，则脏腑病，津液败，血气即成痰涎。”对痰的形成作了论述。清代冯兆张《冯氏锦囊秘录》中写道：“痰之为物，随气升降，无处不到，或在脏腑，或在经络，所以病之多也。”解释痰病之多是由于痰随气而升降，无处不到，所以脏腑、经络之病多有痰这一病理产物。清代沈金鳌在《杂病源流犀烛》提出：“痰为诸病之源，怪病皆由痰成也”。至此，痰病的理论研究日渐完善，内容更加充实，有内痰、外痰之议，更有“有[14]形之痰”、“无形之痰”之说。“百病多由痰作祟”，痰致病广泛，特别对于疑难怪病的治疗，从痰论治，收效显著。所以完善中医痰病理论可指导临床，在肺系病的治疗中，痰浊作为致病因素，也是病理产物，对痰浊的研究意义重大。（二）痰浊的产生及致病特点痰的生成是机体脏腑病理改变的产物，不论是外感还是内伤等致病因素，影响人体的津液代谢均可导致痰的形成。《医碥》云：“痰本我身之津液，⋯⋯苟气失其清肃而过于热，则津液受火煎熬，转为稠浊，或气失其温和而过于寒，则津液因寒而积滞，渐至凝结，斯成痰矣。”痰的形成，多与外感六淫，气化失司，或七情内伤，气不布津，或饮食不节，积湿生痰，或劳欲体虚，脾肾亏虚，水谷不化等，总属脏腑功能失调，气化失司，水液在运行、代谢过程中受阻，津液停聚而成。痰的产生，主要与肺、脾、肾三脏功能失调和三焦气化不利有关。故有“脾为生痰之源，肺为贮痰之器”、“痰之本，肾也”之说。若肺失宣降，治节无权，脾失运化，升清降浊受限，肾失开合，难分泌浊，蒸化无权，三焦气化不利，决渎失职，水道不通，影响肺脾肾三脏输[15]布调节水液代谢的机能，痰浊由生。痰作为一种致病因子，其致病特点多重浊、粘滞、致病怪异、易流窜、易复发、[16]逐渐蓄积、致病广泛等。临证表现也颇为复杂，根据视之有无，存在有形之痰证和12 无形之痰象之分。有形之痰证可以包括：视之咯吐痰涎，闻之痰声辘辘，凝聚于机体某一部位的有形之物，触而有形的痰核，如瘿瘤、瘰疬。无形之痰如《冯氏锦囊秘录》言：“痰之为物，随气升降，无处不到，或在脏腑，或在经络，所以病之多也”。如此，痰就无形可征了，即所谓无形之痰，能借助于气游溢周身以致病。只见征象，不见其[17]形质的无形之痰象包括痰流注于脏腑、经络之中如眩晕、癫狂、关节肿胀等。（三）化痰法应用于肺痿的理论基础1.肺痰的生成及临床治疗肺痰，属于痰邪的一种，主要由肺脏产生，可分为有形之肺痰和无形之肺痰。对于肺痰概念的理解，简言之就是:肺痰既可作为病理产物同时又可作为致病因素作用于肺脏。其中有形之肺痰因肺失宣降，水液失司，津聚为痰，是视之可见的呼吸道分泌物如粘液样或泡沫样等有形之痰。无形之肺痰是肺系病中那些只见痰的征象，不见其形质的痰病，临床上多表现为干咳、气短、胸闷憋喘，甚至出现痰扰清窍出现眩晕、[15]嗜睡等痰病征象。2.从痰论治肺痿肺痿为本虚标实之病，基本病机为“虚、痰、瘀”，痰瘀痹阻肺络存在于该病的[19]每个病理阶段。所以无论从病理产物论，或从病机演变论，化痰法理应贯穿治疗该病的始终。肺脏在痰的产生中有很重要作用，痰浊产生后又对肺脏产生不利影响，即肺痰是病理产物同时又是致病因素。正虚是间质性肺病的重要内因，肺脾肾亏虚为本虚，而肺脾肾三脏在水液代谢、痰浊生成中起到不可替代的位置，若三脏亏虚，功能受损，不仅易生痰浊，且对痰浊无力输布调节，循环往复，从而极易形成恶性循环，进而导致津液、气血不断耗伤，导致正虚邪更甚的局面。肺脏宣发肃降失常等病变导致对水液代谢功能下降产生痰湿，成为肺痰留伏于肺，脾肾等他脏所生之痰，随气而行，无处不到，上达于肺，存[20]于肺而成为肺痰，导致相应的咳喘等肺系病证。肺痰又会与血瘀、热邪、毒邪等相互搏结，导致痰瘀痹阻、痰热互结等证型。正如名老中医邓铁涛对痰和瘀之间的关系总结为：“痰是瘀的初期阶段，瘀是痰浊的进一步发展”。痰瘀为有形病理产物，痰浊重浊蓄积，阻滞气机，气机不畅而出现气滞血瘀，痰浊与瘀血一旦生成，由于其互生互化的特性，极易相互胶结难除，导致病史缠绵。凡能祛痰或消痰，治疗“痰证”为主的药物，称为化痰药。化痰药主要治疗痰浊13 作为病理产物引起的病证，因“百病多由痰作祟”，所以病证尤多。根据痰的性质，采用不同法则：对疾病急性期，热痰宜清热化痰，寒痰宜温化，燥痰宜滋润，湿痰宜燥湿化痰，对于风痰、郁痰、顽痰给予宣散、开郁、软化等治疗。缓则求其本，通过[21]调理肺、脾、肾三脏水液代谢等功能以祛痰。治疗肺痰的方剂，常见有二陈汤燥湿化痰，清气化痰丸清热化痰，贝母瓜蒌散润燥化痰，三子养亲汤祛风化痰，温化寒痰[22]可选用苓甘五味姜辛汤加减，疏表宣肺化痰常用止嗽散等。现代研究表明化痰类中药一般具有祛痰、镇咳、平喘、抑菌、抗病毒、消炎利尿等功能，部分药物还可有镇[23]静、镇痛、抗痉厥、改善血液循环、调节免疫作用。因此，鉴于痰邪在肺痿发病过程中的病机变化，化痰药在肺痿的治疗起重要作用。痰邪得清，则肺脏宣降功能趋于正常，利于水液正常代谢，津液正常输布，肺叶得以濡养，则宣发肃降正常。根据肺纤维化的病因病机及致病特点，化痰类中药可能通过祛痰、镇咳、平喘、抑菌、改善血液循环、调节免疫等，对肺纤维化发挥一定的治疗作用。三、海藻的现代药理研究海藻是马尾藻科植物海蒿子或羊栖菜的干燥藻体，有广泛的药用价值及历史悠久的用药经验，性味苦、咸、寒，归肝、胃、肾经，主要作用有消痰软坚散结，利水消[24]肿。可用于瘿瘤、瘰疬，痰饮水肿等病的治疗。现代药理表明，海藻中主要生物活性物质有多糖类、蛋白类、大环内酯类、多酚类、萜类、甾醇类等，具有抗氧化、免[25-27]疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗辐射等多种药理作用。（一）抗氧化作用近年来越来越多的证据表明，海藻提取物具有抗氧化活性的作用，过多的活性氧自由基对吞噬细胞、组织和生物大分子均具有破坏作用，海藻多糖一方面能够清除活性氧，另一方面，能有效地降低脂质过氧化物的含量，主要通过提高酶的活性如超氧［28］化物歧化酶及过氧化物酶，使抗脂质过氧化能力提升及清除过多自由基。杨方美等-2·在对鼠尾藻多糖进行了纯化分离后，发现其对·OH和O均有清除作用，清除率可达[29]到30%以上。欧阳小琨等运用微波辅助的方法提取鼠尾藻多酚，测得其DPPH自由基清除率可高达50%，具有比较强的抗氧化能力。有研究表明海藻硫酸多糖（SPS）具有清除氧自由基的作用，而大叶海藻多糖与SPS一样具有抗氧化活性，SP-1，SP-2，SP-3对二苯代苦味酰基自由基(DPPH)具有良好的清除作用，治疗浓度为3.8mg/ml[30]时清除率分别为17.8%，19.1%，10.2%。14 （二）免疫调节作用海藻中多糖成分是一种具有调节机体免疫功能的天然活性物质，它主要可以通过促进淋巴细胞的增殖与分化、提高巨噬细胞吞噬功能、促进细胞因子和抗体产生等途[31]径实现对机体免疫系统功能的调节。如杨运高等通过实验发现海藻多糖可提高免疫低下的小鼠红细胞C3bR的活性，从而起到对大鼠免疫功能进行调节的作用。（三）抗病毒、抗菌作用实验研究发现，羊栖菜、鼠尾藻、海带等提取成分对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等致病菌均有一定的抑制作用，说明藻体内含有抑制病原菌活性的成[32]分。（四）抗肿瘤作用海藻具有抗肿瘤作用，主要归结于活性多糖可通过增强机体的免疫功能而间接抑制或杀死肿瘤细胞，促进LAK细胞、NK细胞活性，并通过诱导巨噬细胞产生肿瘤坏[33]死因子，从而实现抗肿瘤的作用。四、海藻对间质性肺病大鼠作用机制的实验研究分析（一）海藻对间质性肺病大鼠抗氧化作用的影响在正常的生理条件下，机体会产生一定的氧化物质和抗氧化物质，自由基所导致的组织损伤可被内源性抗氧化物质所抑制，氧化机制和抗氧化机制会处于平衡状态，当机体受到某种或者某些外界因素（如环境污染、生物因素、生活方式、炎症、创伤等病理因素）的刺激和作用后，氧化抗氧化平衡状态被打破，体内自由基和活性氧在机体内大量堆积，终致体内细胞、组织、器官的氧化损伤。即抗氧化物不足以抵抗大[34]量的氧化物时，氧化/抗氧化系统失去平衡，组织就会发生不可逆性损伤。间质性[35]肺病的发生、进展过程中存在着氧化/抗氧化的失衡。氧自由基与其清除剂间保持[36]动态平衡可维持组织细胞的正常结构及功能，氧化应激反应导致肺组织损伤，释放出细胞因子，并通过多种机制使肺成纤维细胞增殖，进一步导致细胞外基质沉积，呼[37]吸膜变厚，肺部的顺应性降低，由此导致了间质性肺病的发生发展。活性氧在博莱[38]霉素造模后的大鼠中对肺纤维化的形成有重要作用。超氧化物歧化酶（SOD）是生物体的重要抗氧化物质，是清除自由基的一种主要酶，因其超强的抗氧化作用被称之“生物体内抗氧化系统的第一道防线”，主要作用机制是催化超氧阴离子发生歧化反应以平衡生物体产生的氧自由基，进一步清除氧自15 [39][40]由基，使细胞不受损伤，SOD活性大小是机体抗氧化能力的体现。丙二醛（MDA）在脂肪酸链式反应中生成，可引起氧自由基的一系列反应，使活性氧作用增强，可反映出组织受自由基攻击及组织氧化损伤程度。随着氧化/抗氧化机制的失衡，氧化应激反应不断增强，正常肺组织的细胞膜遭到破坏，体内脂质过氧化产物进一步增多，MDA的含量随之升高。BLM致间质性肺病大鼠的血清中SOD活性[41]降低，而肺组织匀浆及血清中MDA较健康大鼠含量升高。谷胱甘肽（GSH）是一种重要的具有催化过氧化氢分解作用的酶，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的三肽，在机体内广泛的存在，也是人类细胞质中天然合成的一种肽类，广泛存在于机体的各个器官内，是人体内非常重要的非酶类抗氧化剂。有研究表明，在活的生物体内肺上皮细胞衬液中含有高浓度的GSH，与血浆中[42]浓度相比约高出100倍，但在肺间质病变的机体中其含量及浓度明显降低。考虑机体的氧化/抗氧化系统平衡失调，自由基产生过多，使GSH进一步消耗，含量下降。本实验研究中：将吡非尼酮作为标准对照药物，将其他中药组与其比较，是因为吡非尼酮是目前临床治疗肺间质纤维化药物，以此药作为对照，可进一步评价中药的疗效。SOD可以反映抗氧化的程度。模型组中SOD含量较空白组显著降低（P<0.01），原因是间质性肺病进展中，组织细胞产生较多自由基，以此消耗大量SOD有关。与模型组相比，吡非尼酮、海藻煎取液低、中、高浓度组大鼠组织SOD活性明显升高，有显著统计学意义（P<0.01），说明海藻煎取液低、中、高浓度及吡非尼酮均可改善大鼠肺组织的SOD活性，但吡非尼酮组及海藻煎取液低浓度组、中浓度组、高浓度组之间两两比较，并无统计学意义（P>0.05），说明吡非尼酮与海藻煎取液在通过提高SOD含量来抗氧自由基具有相同效果，海藻煎取液在BLM致间质性肺病大鼠肺组织中是否发挥效用与其浓度无关。模型组及其他造模组相比于空白组，MDA的表达增高（P<0.05），提示在间质性肺病进展中，MDA含量会增长，考虑与疾病过程中存在大量氧化反应，增强的脂肪酸链式反应产物MDA增多所致。吡非尼酮组及海藻煎取液低、中、高浓度组大鼠组织MDA均低于模型组（P<0.05），提示有治疗意义。吡非尼酮组及海藻煎取液低浓度组、中浓度组、高浓度组之间两两比较，并无统计学意义（P>0.05），说明吡非尼酮与海藻煎取液均有降低组织中MDA含量的作用，且效果相当。与空白组比较，模型组GSH含量显著降低，与间质性病变发展过程消耗大量GSH16 有关，与模型组比较，吡非尼酮组及海藻低、中、高浓度组GSH含量显著增高(P<0.01），提示用药组治疗有意义，海藻煎取液低浓度组、中浓度组、高浓度组两两比较无统计学意义（P>0.05），说明海藻煎取液是否提高GSH活性与浓度无关，海藻煎取液低、中、高浓度组分别与吡非尼酮治疗组之间比较，有显著统计学意义（P<0.01），说明海藻煎取液在提高GSH活性方面优于吡非尼酮。BLM模型大鼠体内GSH、SOD的活性显著下降，MDA含量明显上调，这与机体肺部纤维化形成关系密切。SOD、GSH与MDA，可反映生物体肺组织清除氧自由基的能力及组织细胞受自由基攻击的程度，因此，我们推测，海藻煎取液通过提高SOD、GSH活性，降低MDA含量，以应对氧化/抗氧化的失衡，增强局部抗氧化能力，抑制氧化应激进程，缓解肺泡炎程度，以延缓间质性肺病的进程。（二）海藻对间质性肺病大鼠转化生长因子表达的影响[43]转化生长因子（TGF-β1）由肺泡巨噬细胞产生，是细胞外基质（extracellular，[44]ECM）和纤维连接蛋白的调节剂，是导致多种疾病如间质性肺病、肝肾纤维化、肝硬化、动脉粥样硬化的重要因子。肺细胞因子网络失衡存在于间质性肺炎进展中，TGF-β1作为其中的关键性因子，可促进成纤维细胞的增殖、分裂，主要是促进成纤维细胞表型向着成肌纤维细胞表型转化，而成肌纤维细胞与气道重塑密切相关。此外，TGF-β1通过刺激胶原和纤维粘连蛋白的合成，促进胞外基质受体蛋白的形成，参与[45]细胞外基质沉积，在间质性肺病进展中起着非常重要作用，并具有选择性抑制基质金属蛋白酶的合成，且增加金属蛋白酶组织抑制因子的合成和分泌，抑制新合成基质[46]蛋白酶解功能，胶原蛋白降解降低，基质沉积增多。从上述研究看，TGF-β1在很多环节参与了间质性肺病的形成过程，TGF-β1是导致间质性肺病纤维组织增生和气道重塑的重要因子，可以作为反映间质性肺病进展过程的指标。本研究结果显示，与空白组大鼠比较，模型组大鼠肺组织匀浆中TGF-β1含量明显升高（P<0.01），提示TGF-β1在间质性肺病进展中有重要作用。与模型组比较，高、中浓度海藻组、吡非尼酮组，可显著抑制TGF-β1的表达，其值降低（P<0.01），说明高、中浓度海藻组、吡非尼酮干预有积极治疗意义。低浓度海藻组与模型组比较无统计学意义（P>0.05），提示海藻煎取液是否发挥干预作用与浓度梯度有关，具体效量关系需再进一步研究。以此，我们推出，一定浓度的海藻煎取液能够有效抑制BLM致间质性肺病大鼠肺17 组织TGF-β1的表达水平，作用机制为抑制TGF-β1的表达，并在一定程度减少成纤维细胞增殖及其他相关因子表达，抑制细胞外基质沉积，减缓气道重塑，可有效延缓间质性肺病进程，其疗效发挥与其浓度梯度有关。（三）海藻对间质性肺病大鼠血管内皮生长因子表达的影响血管内皮生长因子（VEGF）是作用于血管内皮细胞，近年来研究发现可以促进血[47]管内皮细胞增殖、血管通透性增加、血管新生，维持血管正常状态及完整性的作用。[48]同时，有研究表明，血管内皮生长因子可以促进成纤维细胞生长，而成纤维细胞在[49]肺纤维化进程中起重要作用。Turner-Warwick首先提出间质纤维化的肺组织内存在新生血管增多的情况。之后大量的研究不断证实，在肺间质纤维化过程中增多的新生血管在其病情进展中也起到了一定的作用。在肺纤维化进程中，VEGF一方面促进血管生成，血管增生充斥在纤维组织增生进展中，并在维持血管系统中起作用。VEGF还通过增加毛细血管通透性，而使得炎性细胞及蛋白质渗出，促使细胞外基质大量形成，是成纤维细胞的迁移、毛细血管网的建立的基础，形成基质，促进成纤维细胞聚[50]集，促进了纤维化的进程。所以，在间质性肺病进展中，VEGF的表达能够随着血管重塑的程度而改变。本实验表明，与空白组比较，模型组及其他各组肺组织匀浆中VEGF含量都有一定程度升高，表明在间质性肺病大鼠中VEGF高表达，与文献研究对应，且模型组与空白组相比明显升高，有显著统计学意义（P<0.01）。中、高浓度海藻组及吡非尼酮组与模型组相比，VEGF含量降低，其结果具有统计学意义（P<0.05），考虑中、高浓度海藻及吡非尼酮可抑制VEGF表达，具有治疗意义，但三组之间相比无统计学意义，低浓度海藻组与模型组相比无统计学意义（P>0.05），提示在间质性肺病大鼠治疗过程中，海藻是否发挥抑制VEGF表达，与其自身浓度密切相关，具体效量关系需再进一步研究。可以看出，VEGF在大鼠肺间质病变中起重要作用，高、中浓度海藻组可抑制VEGF的表达，从而减缓间质性肺病进程，低浓度海藻组与模型组相比无意义。因此，我们推断，在间质性肺病治疗中，适当剂量海藻可起到延缓间质性肺病进展的作用，能够降低肺纤维化大鼠肺组织中VEGF表达，减轻了肺部损伤。其作用机理可能与抑制了VEGF表达，从而减少了成纤维细胞聚集，与胶原纤维合成减少有关，具体效量关系需进一步研究得出。18 结语弥漫性间质性肺病是一组疾病的总称，累及肺间质、肺实质，病理表现为肺泡壁[51]（间隔）炎性细胞浸润、纤维化改变。肺间质纤维化因其发病率逐年升高、病情进展快，预后差引起广泛关注。目前国内外专家至今尚未明确其具体发病机制。现代医学缺乏有效的防治手段，糖皮质激素及免疫抑制剂等一方面疗效有限，另一方面存在着较多的副作用。近年来中医药在对本病的辨证治疗中存在一定的优势，且临床疗效显著，并做了一系列临床研究，成为社会及肺病领域广泛关注的热点问题，其具体治疗机制的实验研究仍不全面。本文通过实验研究，应用高、中、低三种浓度的海藻煎取液治疗博莱霉素所致间质性肺病大鼠，并与吡非尼酮组进行比较，分别从氧化/抗氧化失衡、气道重塑、血管重塑等细胞因子层面角度研究，检测BLM致间质性肺病大鼠SOD、MDA、GSH、TGF-β1、VEGF等各项指标，观察多种机制对间质性肺病治疗作用，不同浓度海藻煎取液在不同途径干预效果不同，综合分析，海藻煎取液治疗组大鼠各项指标总体优于模型组大鼠，具有统计学意义（P<0.05），提示一定浓度的海藻煎取液可以在治疗间质性肺病中通过多途径延缓病情发展。本实验为进一步研究海藻治疗间质性肺病提供理论基础。本实验从化痰药物对间质性肺病的作用为切口，深入挖掘祖国医学精华，并通过实验研究的证实，佐证了痰浊在间质性肺病中的重要作用，填补了海藻在治疗间质性肺病的实验研究空白，为临床用药提供理论支持。临床可通过辨证论治，适当采用海藻化痰治疗，充分发挥中医中药优势。因研究周期、笔者学术水平等诸多因素限制，本实验研究尚有不足之处。如无规范的治疗效果评价标准，不同浓度、不同病理阶段药物干预效果是否相同等，有待于进一步系统的实验及临床研究。本论文系国家自然科学基金（编号：81273704）“化痰类中药多途径调节肺间质纤维化抗氧化机制的研究”中海藻对肺纤维化模型的干预作用部分。感谢课题组各成员在实验准备、动物饲养、数据处理等步骤中的团结协作。19 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综述间质性肺病的中医研究进展间质性肺病（interstitiallungdisease，ILD）是一组疾病的总称，是多种原因引起的急慢性肺部疾病的共同结局，主要累及肺间质，主要的受累区是肺泡上皮细胞和血管内皮细胞之间的区域，并常伴有肺实质受累，如肺泡炎、肺泡腔内蛋白渗出等改变，即所说的弥漫性肺实质疾病（diffuseparenchymallungdisease，DPLD）。ILD病因多达200余种，病理表现肺泡壁炎性细胞浸润、纤维化改变。其临床表现主要为刺激性干咳、进行性呼吸困难，限制性通气功能障碍伴弥散功能降低，最终可因病情进展导致呼吸衰竭。特发性肺间质纤维化(idiopathicpneumoniafibrosis，IPF)是一种原因尚不明确的、呈进行性发展的、病变主要局限于肺部的以纤维化伴蜂窝样改变为主要特征的疾病，是特发性间质性肺炎(idiopathicinterstitialpneumonia，IIP)的常见类型，此病较为凶险，病因多与吸烟、环境暴露、微生物因素、胃食管返流、遗传因素等有关，随着社会经济发展，人们生活方式、饮食起居习惯、工作模式等改变，人口、社会、自然环境矛盾日益突出，该病发病率呈逐年上升趋势，并因其预后不良、死亡率高带来严重家庭及社会经济负担。目前国内外专家大多从炎性反应、氧化应激、血管的生成等角度研究，但至今仍未明确其发病机制，缺乏科学有效的防治手段，5年[1]生存率20%-40%。目前医学领域不断探索该病的新的治疗方案。西医对间质性肺病的治疗主要采用激素、免疫抑制剂、抗纤维化药物、肺移植等药物及措施进行治疗。但其发病率及病死率仍在升高，应该引起广大医护人员的重视。药物治疗疗效不显著及副作用明显，调查显示糖皮质激素类药物对IPF患者的显效[2][3]率最高不过16%，且新的指南不再推荐糖皮质激素治疗IPF，肺移植是目前治疗肺纤维化最有效的手段，适当IPF患者建议行肺移植，移植成功就可改善患者症状，提高生活质量，延缓生命。然捐献器官资源缺乏、费用昂贵、排斥反应、感染、并发症[4]制约了其推广应用于临床。现代医学对于本病的发病机制仍未阐明，认为涉及炎症、损伤、异常损伤修复的各个环节，其中肺泡上皮细胞、肌成纤维细胞、TGF-β1、TNF-α、IFN-γ、Th1/Th2细胞因子失衡、MMP和TIMP局部表达失衡及氧化应激等在其发病过程中有着重要作用，这些方面也是目前现代医学新药研究的主要作用靶点。然而遗憾24 [5]的是，目前为止的研究表明，现有的治疗药物对本病的治疗未显示出良好的效果。近年来，中医药在防治间质性肺炎方面成为该领域热点，中医辨证论治可改善患者症状、提高患者生活质量、延缓其发展等方面疗效显著，且对中药复方、单药做了大量实验、临床研究，并应用于临床，其抗炎、抗纤维化机制正在完善中，相信在可预见的未来，现代医学在本病的治疗会取得一定的进展。下面对近些年来应用中医中药治疗间质性肺病的动态整理如下。从我国现存最早的医学经典著作《黄帝内经》起查阅，并没有找到与间质性肺病完全对应的病名，与之相关的定义有“咳嗽”、“喘证”、“肺胀”、“肺痿”、“肺痹”等。[6]部分学者认为本病当归“肺痹、肺痿”的范畴，也有部分学者认为肺痹、肺痿分别[7]是肺间质病变在疾病进展阶段的病理概括，也有学者认为肺痿与肺纤维化最为贴切[8]，历朝历代医家对此争论不休，未有定论，但各医家都形成了相应的病因病机、治法方药体系，并逐渐完善。1.相关病因病机肺痿是一种性质可分为寒、热两端的慢性虚损性疾病，主要形成机制为机体痰热互结，咳嗽日久，热邪消耗肺脏津液，变生涎水清沫，肺脏干燥，肺阴枯竭，肺络失其濡养，而日渐枯萎。又或者是肺脏虚寒，久病伤肺，肺气亏虚，不能温化、固摄津[9]液，津液停聚上泛为涎沫，气津两伤，肺失濡养致痿即为肺痿。陈修园《金匮要略浅注》提出“肺喜温而恶寒”、“肺喜润而恶燥”之论，认为肺“温则润，寒则燥”，提示了肺中虚冷可致肺津不足。可见，在肺痿形成之初，“上焦虚热”与“肺中虚冷”病机可单一存在，但随着疾病进展，二者必兼夹致病，而“肺津不足”也同样存在肺痿疾病进展的始终。肺痿总以本虚为主，但在其发展过程中，多虚实夹杂，其中，痰瘀阻络为邪实。吴银根认为本病病机为肺络痹阻，致使痰浊瘀血互结。总结出主要病理特点是虚、痰、瘀，故临床应用时可采用祛痰通络、温阳益气、活血化瘀、滋阴补[10]肾等治法。崔红生等认为该病病理基础为外受毒邪、毒损肺络，虚、痰、瘀、毒阻络作为基本病机贯穿始终，病情的演变发展和预后转归与各病理因素消长盛衰、相互[11]转化影响有关。郭刚认为肺痿的发生发展与痰涎密切相关，肺气虚寒，气不化津，[12]则为痰为涎，胶粘肺络，虚滞相加，导致肺痿不用。姚楚芳等认为痰热闭肺是间质[13]性肺病的主要病机,治疗原则以清热宣肺、健脾祛痰为主，收效显著。关天宇等认为本病本虚标实，其本虚为肺气虚，标实为痰浊、瘀血、火热。并根据肺间质纤维化25 不同的病理分期概括其不同病机特点，如肺泡炎期：外邪侵袭肺脏，肺失宣发肃降功能，水道不通，内停于肺，积而化生痰饮，并渐生痰、饮、水、瘀等病理产物，相互搏结，恶性循环；肺损伤期:该期多属肺间质纤维化的中期或亚急性期，随病情的进一步进展，水饮痰瘀积而化热，煎熬机体津液，炼液成痰，使痰瘀互结，内阻肺络，造成病情的不断加剧。肺纤维化期(修复期):本期多属于肺间质纤维化慢性持续期或病变晚期，痰浊瘀血相互搏结，水湿积聚，气滞不畅，痰、瘀、湿等化热耗气伤阴，[14]肺气阴两虚，日久病及他脏。综上所述，随着理论研究及临床观察的深入，现代医家对于肺痿的病机认识有了进一步发展。包括气血津液与脏腑辨证结合，不乏有“三焦辨证”、“肺络论”、“脾肾论”等理论的发展，在辨证过程中，逐渐提升痰、瘀、虚的重要性。该病病机复杂，不能用单一病机概括其病程进展，但痰浊在本病的各个病理发展阶段中有重要作用，所以化痰法应贯穿本病始终。2.相关证治方药近些年来，间质性肺病存在着两种辨证论治的方法，一是直接辨证分型，再者是[15]根据病理分期进行辨病与辨证相结合治疗，都取得较好疗效。（1）直接辨证分型与分期辨证[16]孔祥文通过辨证将特发性肺纤维化分为三个证型，分别为痰热郁肺型、痰瘀互结型、肺肾气虚型。对于痰热郁肺型治以泻肺化痰平喘为法，以桑白皮汤为主方清肺化痰，根据病情佐以鱼腥草、瓜蒌皮等加减。痰瘀互结型以活血通络、平喘化痰为主，可选方剂有血府逐瘀汤、丹参饮合二陈汤加减等。肺肾气虚型以补肺纳肾，以平喘固本汤及补肺汤加减。[17]赵克明等根据该病病理是由肺泡炎向间质纤维化演变的现代医学认识，将本病分为5个证型，肺燥津伤型治以麦门冬汤合清燥救肺汤以清热生津、滋阴润肺；气阴两虚型生脉散加减以补益肺气；肺气虚冷型甘草干姜汤加味以温肺益气；肺肾气虚兼血瘀型治以平喘固本汤合桃红四物汤加减以活血化瘀，肺肾同补；肺肾气虚兼痰热型治以平喘固本汤合桑白皮汤加减以补益肺肾，清热化痰。[18]崔玉衡认为本病基本病机为肺肾亏虚，痰浊瘀滞，导致肺失宣降，临床辨证分3个类型：肺肾阴虚证治宜自拟滋阴活血汤加减以滋养肺肾，活血化痰；肺肾气虚证治宜自拟益气活血汤补肺益肾；瘀阻肺络证治宜以血府逐瘀汤加减以宣肺活血化瘀。26 根据患者发病的病程，结合症候表现可将本病进行分期治疗，每个阶段密切相关，并不是独立存在的，存在着共同的病因、病机。[19]赵勤萍将本病分3期治疗，在疾病初期或急性发作期，强调虚实相兼，实邪为主，以千金苇茎汤、补肺汤、小陷胸汤等合方加减化痰祛瘀、降逆行气；在疾病进展期，以桃红四物汤、宣肺渗湿汤等合方加减宣肺化痰行瘀，软坚散结。而在病变的后期，强调肺肾同补，常以金水六君煎、右归饮、参蛤散等合方加减。［20］崔红生等根据不同临床症候学特点将本病分为三期，早期、慢性迁延期、晚期。早期以气血不通，肺络痹阻为病机，常见证型是痰热郁肺与痰瘀阻络；慢性迁延期气虚血瘀痰阻并见，本虚标实，肺痹与肺痿并存；晚期则以本虚为主，气血不充、络虚失养，肺、肾、心多脏虚损，以致肺肾两虚、痰瘀阻络。临床治疗根据分期及证候特点辨证施治。［21］丁明桥等将本病分为三期：早期、慢性迁延期和晚期。认为肺间质纤维化早期以肺痹为主，发病迅速，标实为主，治宜辛通为主，具体临证时，需辨明寒热表里，常用方剂如三拗汤、小青龙汤、止嗽散、桑菊饮、银翘散、桑杏汤、杏苏散加减。肺间质纤维化慢性迁延期虚实夹杂，常见证型为气虚血瘀痰阻，此时肺痹与肺痿相互转化，治宜补虚泻实，通补兼施，根据其阴阳气血亏虚的不同，选用不同治法如温阳、滋阴、益气、养血，或多法合用。对于肺间质纤维化，晚期病机虚实夹杂，多以虚为主，治宜扶正固本。（2）医家经验及临床观察[22]刘亚娴提出对于本病治疗原则当以“降、化、行”为主，宜宣降气机、化痰行瘀，治以华盖散和金水六君煎为基本方剂加减治疗本病。[23]杨道文将肺纤维化病名归属于中医“肺痿”范畴，治宜补益肺肾、活血化瘀。重用巧用黄芪，精选补肺益肾药，常用药物有：生黄芪、炒白术、太子参、麦冬、蜂房、淫羊藿、水蛭等。并根患者具体病情精选方药。[24]李国勤认为该病为气虚、肺脾肾三脏不足，痰浊、瘀血痹阻肺络为实，以益气扶正，活血化瘀通络为治则，临床用药常以大剂量补气药扶助正气，其常用药物有：生黄芪、川芎、三棱、莪术、全蝎、蜈蚣、党参、杏仁、黄精、淫羊藿、巴戟天、山萸肉、紫河车、蛤蚧、冬虫夏草等。[25]晁恩祥教授从整体出发，更加注重个体化治疗，强调病程始终需重视调补肺肾，27 治以益气养阴、活血化瘀、调补肺肾，并根据具体病情予疏风、化痰、祛瘀。常用益气养阴药有太子参、黄芪、麦冬、黄精；补肾纳气有淫羊藿、菟丝子等；补肾阴用山茱萸、女贞子、枸杞子等；降肺气用紫菀、紫苏叶、杏仁、地龙；清热化痰常用橘红、鱼腥草、黄芩、金荞麦；活血常用丹参、川芎。[26]徐艳玲教授认为该病总属“肺痿”范畴，以补泻并用、标本同治为治则。祛痰化瘀治标，常用药物有茯苓、白术、桑白皮、金银花、瓜蒌、半夏、黄芪、陈皮、沙参、麦冬、丹参、当归、川芎、牡丹皮、甘草等。补肺益肾以治其本，常用药为熟地、山药、山茱萸、五味子、黄芪、麦冬等。并根据病情随证加减。［27］也有医家对于间质性肺病的治疗结合中医特色疗法，如李戎认为艾灸肺俞、膏肓穴可对阻抑特发性肺纤维化有确切的效果。3.总结肺痿属于慢性复杂性疾病，医家对其辨证论治的认识不同，治法、组方等方面存在一定差异，但在参考现代医学的基础上，并对中医中药进行实验研究，逐渐形成了很多共识，取得丰硕成果。随着科学研究及临床研究的进一步发展，中医中药在间质性肺炎的治疗中会发挥更大作用。参考文献[1]陈灏珠，林果为.实用内科学[M].14版.北京:人民卫生社，2013，1772-1785.[2]崔冰，胡卓伟.抗肺纤维化药物治疗研究进展［J］.生理科学进展，2008，39（3）：233-238.[3]宋宁，段林.2015ATS/ERS/JRS/ALAT特发性肺间质纤维化指南解读[J].临床荟萃，2015(9):1073-1080.[4]BrownKK,RaghuG.Medicaltreatmentforpulmonaryfibrosis:currenttrends,concepts,andprospects.ClinChestMed,2004,25：759-772.[5]王婷霄.特发性肺间质纤维化的中西医诊治进展及导师经验[D].北京中医药大学,2013.[6]张纾难，疏欣杨.对特发性肺纤维化中医临床研究的思考[J].环球中医药，2009，2（3）：296-298．[7]丁明桥，许朝霞，李晓红．肺间质纤维化中医分期辨证论治[J]．湖北中医杂志，2007，29（11）：41-42．28 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