《规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号S582.65密级：公开论文编号：201801032067贵州大学2018届硕士研究生学位论文规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究学科专业：预防兽医学研究方向：动物传染病病原分子生物学导师：汤德元教授研究生：胡玲玲中国﹒贵州﹒贵阳2018年6月 贵州大学2018届硕士研究生学位论文贵州省农业攻关资助项目贵州省规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病净化综合技术集成与示范项目编号:黔科合NY字（2014）3055号 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究目录中文摘要.........................................................................................................................IAbstract........................................................................................................................IV第一章文献综述..........................................................................................................11猪瘟和猪伪狂犬病病原学特征..........................................................................11.1猪瘟病毒....................................................................................................11.2猪伪狂犬病病毒........................................................................................42猪瘟和猪伪狂犬病流行病学状况......................................................................62.1猪瘟流行病学研究....................................................................................62.2猪伪狂犬病流行病学研究........................................................................93猪瘟与猪伪狂犬病的国内外净化研究现状....................................................123.1国外对猪瘟和猪伪狂犬病的净化方案..................................................123.2国内对猪瘟和猪伪狂犬病的净化实施现状..........................................154本研究的目的和意义........................................................................................18第二章规模化猪场CSF和PR血清学调查研究....................................................201材料....................................................................................................................201.1样品来源..................................................................................................201.2主要试剂..................................................................................................211.3主要实验仪器..........................................................................................212方法....................................................................................................................212.1血液样本的处理......................................................................................212.2猪瘟病毒ELISA抗体检测.....................................................................212.3猪伪狂犬病毒ELISA抗体检测............................................................222.4猪伪狂犬病毒gE-ELISA抗体检测.......................................................233结果....................................................................................................................243.1CSF血清学检测结果..............................................................................253.2PR血清学检测结果................................................................................264讨论....................................................................................................................275结论....................................................................................................................28第三章规模化猪场CSF和PR病原学调查研究....................................................291材料....................................................................................................................291.1样品来源..................................................................................................291.2主要试剂..................................................................................................301.3主要溶液的配制......................................................................................301.4主要实验仪器与耗材..............................................................................312方法....................................................................................................................322.1引物设计与合成......................................................................................322.2病毒核酸的提取......................................................................................332.3猪瘟病毒E2基因RT-PCR检测............................................................332.4猪伪狂犬病病毒gE基因PCR检测......................................................342.5CSFV的分离鉴定...................................................................................352.6PRV的分离鉴定.....................................................................................353结果....................................................................................................................373.1规模化猪场CSFV和PRV病原学检测结果.......................................37 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究3.2CSFV分离鉴定结果...............................................................................383.3PRV分离鉴定结果.................................................................................404讨论....................................................................................................................455结论....................................................................................................................47第四章规模化猪场PRV和CSFV分子流行病学调查研究..................................481材料....................................................................................................................481.1样本来源..................................................................................................481.2主要试剂..................................................................................................491.3主要溶液的配制......................................................................................491.4主要实验仪器..........................................................................................492方法....................................................................................................................502.1引物设计与合成......................................................................................502.2病毒核酸的提取......................................................................................502.3猪伪狂犬病病毒gE基因PCR检测.....................................................502.4猪瘟病毒E2基因RT-PCR检测............................................................512.5目的基因克隆、测序与分析..................................................................523结果....................................................................................................................523.1PRVgE基因PCR检测结果..................................................................523.2PRVgE基因序列分析结果....................................................................533.3PRVgE基因遗传进化树分析结果........................................................553.4CSFVE2基因RT-PCR检测结果.........................................................563.5猪瘟病毒E2基因序列分析结果............................................................573.6猪瘟病毒E2基因遗传进化树分析结果................................................604讨论....................................................................................................................605结论....................................................................................................................62第五章规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病净化效果研究............................................631材料....................................................................................................................631.1样品来源..................................................................................................631.2主要试剂..................................................................................................641.3主要溶液的配制......................................................................................641.4主要实验仪器..........................................................................................652方法....................................................................................................................652.1猪瘟和猪伪狂犬病的净化监测技术......................................................652.2猪瘟及猪伪狂犬病的免疫程序及监测..................................................672.3病毒抗体ELISA检测.............................................................................682.4病毒核酸的RT-PCR/PCR扩增.............................................................683结果....................................................................................................................694讨论....................................................................................................................715结论....................................................................................................................72参考文献......................................................................................................................73附录一攻读硕士学位期间发表论文及成果..........................................................83附录二本文用到的部分英文缩写及含义说明........................................................86致谢..............................................................................................................................88 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究中文摘要猪瘟（CSF）和猪伪狂犬病（PR）是感染猪的两种重要疫病，农业部于2008年将猪瘟列为一类动物疫病，伪狂犬病列为二类动物疫病，目前这两种疫病在我国一些规模化猪场普遍存在，直接或间接地影响着我国养猪业的持续健康发展。近年来，随着我国CSF和PR诊断技术和综合防控措施研究的不断突破与创新，以及CSF和PR的净化技术的成熟，规模化猪场CSF和PR的净化已被列入《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020）》。为进一步探索研究完善规模化猪场CSF和PR科学可行的净化方案，本研究对已建立的规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病净化方案在规模化猪场中的应用效果进行监测净化研究，并在以净化为目的条件下对规模化猪场CSF和PR展开了流行病学调查以及病原的分离鉴定工作。以期为后期规模化猪场CSF和PR的流行、变异、防控及净化提供一定的参考。1、规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病血清学调查研究为了更好的实施CSF和PR净化方案，试验对贵州省实施方案前的某规模化猪场采集的1430份血液样品进行CSF和PR抗体ELISA检测，结果显示，在所检测的样品中，PRVgB抗体阳性率87.2%（1247/1430）；其中种猪、后备猪、保育猪和育肥猪的PRVgB抗体阳性率均在85%以上。PRVgE抗体阳性率4.48%（46/1430）；保育猪群中检出PRVgE抗体阳性率最高，为5.26%（12/228），育肥猪群中检测阳性率最低，为4.14%（11/266）。猪瘟抗体阳性率为84.27%（1205/1430）；其中种猪、后备猪、保育猪和育肥猪的猪瘟抗体蛋白阳性率均在80%以上。该研究结果为后期规模化CSF和PR的净化提供本底调查，并为贵州规模化CSF和PR的流行状况提供参考依据。2、规模化猪场CSFV和PRV病原学调查研究为了掌握规模化猪场CSFV和PRV的感染状况及相应病原特征，试验对贵州省实施方案前的某规模化猪场采集的1430份扁桃体及血液样品进行CSF和I 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究PR的mPCR和单一PCR/RT-PCR检测，并对PCR/RT-PCR检测阳性的部分样本进行CSFV和PRV的分离鉴定。结果显示，猪伪狂犬病病原核酸阳性率为1.96%（28/1430）；实验成功分离得到1株猪伪狂犬病病毒，命名为Guizhou-T1株。该毒株接种Vero细胞盲传至第3代时开始产生CPE，盲传至第5代出现稳定的CPE，其TCID-10.1150为10/100µL；电镜下可见呈椭圆形、有囊膜、直径为120～180nm病毒粒子，核内见呈晶格状排列的病毒包涵体；病毒悬液过滤后接种引起家兔奇痒、麻痹死亡。猪瘟病原核酸阳性率2.59%（37/1430），其中保育猪群野毒阳性率最高，为3.07%（7/228）；分离鉴定了一株猪瘟病毒，命名GZA株。该毒株接种PK-15细胞后连传7代RT-PCR均能扩增出CSFVE2基因阳性条带。间接免疫荧光试验表明CSFV确在PK-15细胞中得以增殖；病毒粒子在电镜下呈椭圆形或圆形，直径30～80nm。研究结果初步摸清了规模化猪场PRV和CSFV病原学特点，为后期规模化猪场开展CSF和PR的净化提供了本底调查。3、规模化猪场CSFV和PRV分子流行病学调查研究为了解贵州省某规模化猪场CSFV和PRV的分子流行病学状况，本试验对该规模化猪场中的已检测CSF和PR部分阳性样品进行CSFVE2及PRVgE全基因进行的克隆、测序及序列分析。结果显示，4株PRV贵州流行株gE基因核苷酸同源性为99.6%～99.9%，氨基酸同源性为99.1%～99.8%，Guizhou-T1～T4株在gE48和gE496位有天冬氨酸（AspD）的插入；遗传进化树显示：gE基因序列与2011年后所报道的变异毒株序列同属一个分支。并且Guizhou-T1株与GZ-Z1株和Guizhou-DY株同源性分别为97.5%和99.3%；与GuizhouDY株之间有8个氨基酸突变位点，与GZ-Z1株之间有26个氨基酸突变位点。实验获得的CSFVGZA株和GZB株E2基因与参考毒株的CSFVE2基因的核苷酸同源性为82.8%～83.4%，氨基酸同源性为88.7%～90.6%，经遗传进化树分析得出CSFV贵州分离株E2基因与参考毒株之间差异较大。该研究结果为贵州规模化猪场CSF和PR的遗传变异状况提供参考依据。4、规模化猪场猪瘟和伪狂犬病净化效果研究为研究规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病净化方案的应用效果，本试验分4次采集该方案实施猪场的1776份扁桃体和1776血液样品份，采用已建立的CSFVII 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究RT-PCR检测技术（(GB/T16551-2008)）、PRVgE/gB-ELISA检测方法（GB/T18641-2002）和本实验室已建立的鉴别猪瘟和猪伪狂犬病野毒和疫苗毒mPCR方法，对贵州省某规模化种猪场CSF和PR开展了净化研究。对贵州省某规模化种猪场CSF和PR分4个阶段开展了净化研究。结果显示，实施净化方案后所检测PRVgB抗体阳性率从83.98%（367/437）上升到98.17%（429/437）；PRVgE抗体阳性率从5.72%（25/437）下降到0.23%（1/437）；猪伪狂犬病病原阳性率从2.75%（12/437）下降到0；猪瘟抗体阳性率从85.81%（375/437）上升到98.63%（431/437）；猪瘟病原阳性率从2.06%（9/437）下降到0，表明采用该净化方案对猪场猪瘟和猪伪狂犬病的净化达到了预期的效果。该研究为规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病的净化思路提供一定的参考依据。关键词：猪瘟；猪伪狂犬病；病毒的分离鉴定；分子流行病学；净化III 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究EpidemiologicalInvestigationandPurificationofSwineFeverandSwinePseudorabiesinLargeScaleSwineFarmsAbstractClassicalswinefever(CSF)andPseudorabies(PR)aretwoimportantdiseasesaffectingpigs.TheMinistryofAgricultureclassifiedswinefeverasaclassofanimaldiseasesin2008andpseudorabiesasaclassIIanimaldisease.Thesetwodiseasesarecurrentlypresent.InChina,somelarge-scalepigfarmsarewidespread,whichdirectlyorindirectlyaffectsthesustainableandhealthydevelopmentofChina'spigindustry.Inrecentyears,withcontinuousbreakthroughsandinnovationsinCSFandPRdiagnostictechnologiesandcomprehensivepreventionandcontrolmeasuresinChina,andthematurityofCSFandPRpurificationtechnologies,thepurificationofCSFandPRinlarge-scalepigfarmshasbeenincludedintheMiddleandlong-termAnimalDiseaseControlPlan(2012-2020).InordertofurtherexploreandimprovethescientificandfeasiblepurificationprogramsforCSFandPRinlarge-scalepigfarms,thisstudywillmonitorandpurifytheestablishedpigfarmswinefeverandswinepseudorabiestreatmentprograminlarge-scalepigfarms.Inaddition,epidemiologicalinvestigationsofCSFandPRonlarge-scalepigfarmsandisolationandidentificationofpathogenswereconductedundertheconditionsofpurification.Inordertoprovidesomereferencefortheprevalence,variation,preventionandcontrolandpurificationofCSFandPRinlarge-scalepigfarmsinthelaterperiod.1.SerologicalinvestigationofswinefeverandswinepseudorabiesinscaledpigfarmsInordertobetterimplementtheCSFandPRpurificationprograms,ELISAtestsofCSFandPRantibodieswereperformedon1430bloodsamplestakenfromalarge-scalepigfarminGuizhoupriortotheimplementationoftheplan.TheresultsshowedthatPRVswerethesamplestested.ThepositiverateofgBantibodywas87.2%(1247/1430).ThepositiverateofPRVgBantibodyinbreedingpigs,reservedIV 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究pigs,nurserypigsandfinishingpigswereallabove85%.ThepositiverateofPRVgEantibodywas4.48%(46/1430);thepositiverateofPRVgEantibodydetectedinnurseryherdswasthehighest,being5.26%(12/228),andthelowestpositiverateinfinishingpigswas4.14%(11/266).Thepositiverateofswinefeverantibodywas84.27%(1205/1430).Thepositiverateofswinefeverantibodyantibodyinbreedingpigs,reservedpigs,nurserypigsandfinishingpigswasallabove80%.Theresultsofthisstudyprovidebackgroundinvestigationsforthepurificationoflarge-scaleCSFandPRinthelaterperiod,andprovidereferencefortheepidemicsituationofCSFandPRinGuizhou.2.InvestigationoftheetiologyofCSFVandPRVinswinefarmsInordertomastertheinfectionstatusandcorrespondingpathogeniccharacteristicsofCSFVandPRVinlarge-scalepigfarms,mPCRandsinglePCR/RTofCSFandPRwereperformedon1430tonsilandbloodsamplescollectedfromalarge-scalepigfarmbeforetheimplementationoftheprojectinGuizhouProvince.-PCRdetectionandidentificationofCSFVandPRVinPCR/RT-PCRpositivesamples.Theresultsshowedthatthepositiverateofpathogenicrabiesvirusinpigswas1.96%(28/1430).ApigpseudorabiesviruswassuccessfullyisolatedandnamedasGuizhou-T1strain.ThestrainwasinoculatedwithVerocellsinblindpassagetothethirdpassageandbegantoproduceCPE.ThepassagefromtheblindpassagetothefifthpassageshowedstableCPEwithaTCID-10.1150of10/100μL.Theelectronmicroscopeshowedanoval,capsule,anddiameter.For120-180nmvirions,theinclusionofvirusesinthenucleusappearstobeintheformofalattice;virusinfiltrationafterfiltrationoftheviruscausesitchingandparalysisinrabbits.Thepositiverateofpathogenicnucleicacidofswinefeverviruswas2.59%(37/1430).Thehighestpositiverateofwildpigsinthenurserywas3.07%(7/228).AswinefeverviruswasisolatedandidentifiedasGZAstrain.AfterthestrainwasinoculatedwithPK-15cells,continuoustransmissionof7-generationRT-PCRcouldamplifypositivebandsofCSFVE2gene.IndirectimmunofluorescenceassayshowedthatCSFVdidproliferateinPK-15cells;virusparticleswereellipticalorcircularunderelectronmicroscopywithdiametersof30-80nm.TheresultsofthestudypreliminarilyfiguredV 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究outthepathogeniccharacteristicsofPRVandCSFVinlarge-scalepigfarms,andprovidedabaselinesurveyforthepurificationofCSFandPRinlarge-scalepigfarmsinthelaterperiod.3.EpidemiologicalsurveyofmolecularCSFVandPRVinlarge-scalepigfarmsTounderstandthemolecularepidemiologicalstatusofCSFVandPRVinalarge-scalepigfarminGuizhouprovince,thisstudytestedthecloningandsequencingofCSFVE2andPRVgEgenesinthepositiveCSFVandPRpartialsamplesfromthelarge-scalepigfarms.Andsequenceanalysis.TheresultsshowedthatthegEgenehomologyofthe4PRVGuizhouepidemicstrainswas99.6%-99.9%,theaminoacidhomologywas99.1%-99.8%,andtheGuizhou-T1-T4strainhadaspartameinpositionsgE48andgE496.Insertionofacid(AspD);phylogenetictreeshowsthatthegEgenesequencebelongstothesamebranchasthemutantstrainreportedafter2011.TheGuizhou-T1strainshared97.5%and99.3%homologywiththeGZ-Z1strainandtheGuizhou-DYstrain,respectively;therewere8aminoacidmutationsitesbetweentheGuizhouDYstrainand26strainsbetweentheGZ-Z1strainandtheGuizhouDYstrain.Aminoacidmutationsites.ThenucleotidehomologiesoftheCSFVGZAstrainandGZBstrainE2geneandthereferencestrainCSFVE2genewere82.8%-83.4%,andtheaminoacidhomologywas88.7%-90.6%.TherewasasignificantdifferencebetweentheE2geneandthereferencestrainoftheCSFVGuizhouisolate.ThisstudyprovidedareferenceforgeneticvariationofCSFandPRinlarge-scalepigfarmsinGuizhou.4.StudyonpurificationeffectofswinefeverandpseudorabiesinscaledpigfarmsInordertostudytheapplicationeffectofthepurificationplanforswinefeverandswinepseudorabiesinlarge-scalepigfarms,thetrialcollected4programstoimplement1,776tonsiland1776bloodsamplesfromthefarm,usingtheestablishedCSFVRT-PCRtest.Technology(GB/T16551-2008),PRVgE/gB-ELISAdetectionmethod(GB/T18641-2002)andthelaboratoryestablishedmPCRmethodforidentifyingwildswinefeverandswinepseudorabieswildvirusandvaccinevirus,ApurificationstudywasconductedonCSFandPRinalarge-scalebreedingfarminVI 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究GuizhouProvince.ThepurificationofCSFandPRinalarge-scalepigfarminGuizhouprovincewasconductedinfourphases.TheresultsshowedthatthePRVgBantibodypositiverateincreasedfrom83.98%(367/437)to98.17%(429/437)afterthepurificationprotocolwasimplemented;thePRVgEantibodypositiveratedroppedfrom5.72%(25/437)to0.23%(1/437);Thepositiverateofpathogenicrabiesinpigsdecreasedfrom2.75%(12/437)to0;thepositiverateofswinefeverantibodyincreasedfrom85.81%(375/437)to98.63%(431/437);thepathogenicityofswinefeverwaspositive.Theratedroppedfrom2.06%(9/437)to0,indicatingthattheuseofthispurificationschemehasachievedtheexpectedresultsforthepurificationofpigfarmswinefeverandswinepseudorabies.Thestudyprovidedacertainreferenceforpurificationideasofpigfarmsandswinepseudorabiesinlarge-scalepigfarms.Keywords:Classicalswinefever;Pseudorabies;Isolationandidentificationofviruses;Molecularepidemiology;PurificationVII 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究第一章文献综述猪瘟（ClassicSwineFever，CSF）是由猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）引起的一种高度接触性、急性、热性和致死性极高的病毒性传染病，1885年该病在美国最早流行发病时被称为猪霍乱（Hogcholera，HC），在英国发生流行时又称为猪热病，而随后逐渐蔓延至欧洲的国家，被当地人称为古典猪瘟，与之相对应的感染病原被称为HCV（Hogcholeravirus）；在我国由于该病导致大部分发病猪出现肠道溃烂，因此通常将其称为“烂肠瘟”。国际兽医局（OIE）将猪瘟与禽流感等并列为A类动物传染病，按照我国对动物疫病分类，将猪瘟列为“一类动物疫病”。伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由猪伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）所引起的一种主要通过呼吸道进行传染的传染性疫病，又名为奥叶基氏病（Aujeszky′s,AD），该病毒对多种皮毛类家畜和野生动物都会引起以奇痒（猪除外）、发热及脑脊髓炎为典型特征的一种急性、传染性疫病。根据我们国家的动物疫病分类，将伪狂犬病（PR）列为二类动物疫病（CramerSDetal，2011）。在自然状态下猪是猪伪狂犬病病毒的最佳潜伏及携带动物体（PomeranzLEetal，2005）。猪瘟和猪伪狂犬病目前已被列入我们国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020）。为了验证国家和本实验室已建立的规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病净化方案的应用效果，本研究根据已建立的规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病的净化方案对实施净化方案的规模化猪场展开血清学和病原学的跟踪监测，为以后更好的推行或改善规模化猪场猪瘟与猪伪狂犬的净化方案提供一定的实践参考。并对实施净化方案前的规模化猪场进行猪瘟和猪伪狂犬病的流行病学调查和遗传变异分析，对所检测的部分CSFV和PRV野毒阳性样品进行分离鉴定，以期为猪瘟和猪伪狂犬病的流行及变异状况对规模化猪场的净化提供参考。在对规模化猪场病原特征及流行病学遗传多样性分析的基础上开展的净化方案的应用效果研究，为猪群实现猪瘟与猪伪狂犬病的净化提供一定的参考及实践基础。1猪瘟和猪伪狂犬病病原学特征1.1猪瘟病毒1 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究1.1.1CSFV病原学特征猪瘟（ClassicSwineFever，CSF）是由猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）引发的一种急性、热性、高度接触性传染病，临床上主要表现高温、坏死、全身出血、梗塞。被世界动物卫生组织列为必须报告的动物传染病，我国也将其列为一类动物疫病。最近几年中，尽管不断有新型有效的疫苗在开发利用，并在我国猪场猪瘟的预防控制中发挥了极大作用，但猪瘟的流行还是时有发生，猪瘟病毒的带毒感染和持续散毒感染现象普遍存在，给我国养猪业带来了极大的经济损失（LinMetal.2005;DreierSetal.2007）。1833年，猪瘟首次在美国被发现。1885年，有研究学者对猪瘟病毒、沙门氏菌病及猪丹毒作了鉴别分类诊断。1903年，国外相关研究学者证明了引起猪瘟病发作的感染源是猪瘟病毒。1925年，我国东南大学农科院有相关研究学者开始研制免疫血清防制猪瘟。多年来世界各国均有报道，猪瘟具有较强的传染性及死亡率，被养猪人员及研究学者认为是与PRV、FMDV等疫病具有同等危害的疫病，是危害养猪业发展的重要传染病之一。猪瘟病毒（CSFV）、羊边界病病毒（BDV）和牛病毒性腹泻病病毒（BVDV）同属于黄病毒科（Flaviridae）瘟病毒属（Pestivirus），其中与牛病毒性腹泻病毒之间存在密切的抗原性，并可发生血清学的交叉反应及交叉性保护作用，而且宿主易感性也相差不大；有研究显示CSFVE2基因引物能够扩增BVDV相应的核酸序列。CSFV为正链RNA病毒，有囊膜，病毒粒子呈球形或椭圆形，直径34nm～50nm，核衣壳直径约29nm，内部核心的直径约29nm～30nm，病毒粒子表面有纤突结构，超薄切片中呈六角形，具有20面对称性，如图1-1（田宏等，2007）。病毒粒子外层包裹有含3种糖蛋白分别为Ems/Eo）、El和E2三种脂蛋白囊膜所构成，囊膜围绕着等轴的核心，病毒粒子表面有麦芒似的糖蛋白纤突，长约6～8nm，内部是二十面体对称的核衣壳，由单一C蛋白构成，直径约为30nm（殷震等，1997）。2 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究图1-1CSFV病毒粒子结构模式图Fig.1-1StructuremodeloftheCSFVpartical（田宏，2007）猪瘟病毒粒子对外界环境抵抗力很弱，存活时间常常会受到各种含毒介质的影响，且不同来源、类型的毒株对温度和pH的敏感性差异不同。猪瘟病毒在接种细胞后，取细胞病毒液经56℃培养1h或者60℃培养10min就会使猪瘟病毒粒子失活，且病毒粒子内含有较多的蛋白质，该蛋白质在经64℃温育1h或经68℃温育30min后依然能保持较好的活力和感染性。当生存环境在pH为5～10时猪瘟病毒仍然能够稳定存活，过低或过高pH都会导致猪瘟病毒的感染性和活力改变，当pH为2.9时在室温条件下放置5h，病毒感染滴度将会急剧下降（朱化鹏等，2010）。CSFV对生活中常见的多种去污剂及常用消毒剂等均有较高敏感性（比如乙醚、氯仿、脱氧胆酸等脂溶剂和皂角素等），对胰蛋白酶的敏感性稍低，2%氢氧化钠溶液是日常生产应用中消灭该病毒的最佳消毒剂。二甲基亚砜（DMSO）可使病毒粒子囊膜中的脂蛋白和脂质趋于稳定，因此试验研究中常用此保存病毒，猪瘟病毒常保存于10%DMSO液中，在实验过程中还发现保存的猪瘟病毒对反复冻融有较好的抵抗力。除此以外病毒与甘油混合后在低温下保存效果良好，有研究表明猪瘟病毒粒子在-5～12℃可存活3个月，且在蛋白质含量越高的环境中CSFV的存活越趋于稳定。1.1.2CSFV基因组结构CSFV为单股正链RNA病毒，其全基因组大小约为12.3kb，在全基因组中间存在一个大的开放性阅读框（Openreadingframe，ORF）以及两端的非编码区3 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究5′-UTR（5′-untranslatedregion，5′-UTR或“前导序列，leader”)）及3′-UTR（3′-untranslatedregion，3′-UTR或“尾随序列，trailer”）构成。该ORF编码一个由近4000个氨基酸残基所构成的多聚蛋白，该蛋白在翻译的同时或之后，在细胞的信号肽酶和特异性蛋白酶作用下可裂解成12种成熟蛋白；前导序列和尾随序列的长短与毒株的来源、类型及不同的序列存在一定的关联，前导序列在每一个毒株种的整个基因组中是最为保守的序列，特别是前导序列编码第一个结构蛋白的C基因的主要编码区域保守性极高（王莹等，2006）。CSFV基因组中前导序列无帽子结构（即m7GPPPN结构），表明该病毒在翻译成蛋白的过程中可不需要帽子结构，但在内部核糖体进入位点序列（Internalribosomeentrysite,IRES）介导的机制的过程中进行，其前导序列是诱导下游蛋白翻译的起始至关重要，尾随序列无poly（A）尾结构。CSFV基因组结构存在两个非编区（前导序列和尾随序列），这两个非编码区的二级结构和核苷酸序列同源性均较高。有相关研究结果表明，前导序列和尾随序列是CSFV基因组结构复制与表达过程中不可忽视的调节位点，引物当中存在某一些顺式作用元件或是复制起始的识别位点、宿主细胞的转录因子结合位点或核糖体起始蛋白质合成作用位点。1.1.3CSFV编码蛋白CSFV粒子是表面具有嚢膜的正链单股线状RNA病毒，在CSFV的全基因序列中每一部分的ORF基因序列对应编码出相应的多聚蛋白，它们在空间结构的裂解下可分别独自形成相应的成熟蛋白，在这12种蛋白中包括有4种结构蛋白和8种非结构蛋白，这其中的4种结构蛋白是多聚蛋白在翻译过程中依靠细胞内信号肽酶的切割过程中而裂解成的相对成熟的蛋白质基团，当中有3种为糖蛋白，1种为核蛋白（殷震等，1997）。1.2猪伪狂犬病病毒猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由猪伪狂犬病病毒（PRV）引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病，对世界养猪业造成的经济损失是不可忽视的（Luoetal.2014；Szparaetal.2011；Wangetal.2014）。猪伪狂犬病首次在美国被发现，是由匈牙利学者Aujeszky分离所得到的，因此以他的名字命名，以此纪念（AujeszkyAetal，1902）。4 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究根据相关文献报道全世界大部分的国家都曾有过或正在发生该病（KetusingNetal，2014），据不完全统计，我们国家大部分地区已有超过20多个省、地区、直辖市发生流行过该病。在国外已有部分国家对PRV进行净化根除，在北美和欧洲的部分发达国家已经彻底根除了猪伪狂犬病（Brittleetal.2004；Ketusingetal.2014；Kluppetal.2004）。我们国家自从猪伪狂犬病的发生到今日，PR在2011年以前的一段时间内也得到了较为明显的控制，并且在那一段时间里PR对我国造成的经济损失也科研工作人员和养殖人员的共同努力下在逐步减少并挽回。但从2011开始PR在又开始在我国许多地区肆虐流行（Guetal.2015；Wangetal.2014；WuRetal.2013；YuXetal.2014）。该病在传染性和致病力上都属于典型且非常难防疫的自然疫源性疫病，且易与其他病毒性疫病或细菌性疫病形成混合感染，给养猪业造成了巨大的经济损失（MaesDetal，2008）。1.2.1病毒的形态结构猪伪狂犬病病毒属于疱疹病毒目疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科水痘病毒属的DNA病毒（KingAMQetal，2012）。该病毒粒子成椭圆形或圆形，成熟的病毒粒子有囊膜、纤突的直径为150～180nm。一个成熟的病毒粒子或一个具有感染性的颗粒主要由4个结构单元构成，包括病毒核酸、核衣壳、囊膜及纤突，如图1-2。其中遗传物质部分核心是由双链DNA与蛋白质缠绕而成，电镜下呈现均匀一致的电子致密区（称包涵体）；外层衣壳呈二十面体的对称，在电镜在呈晶格状排列，由162个相互连接并可形成放射排列且有中空轴孔状的壳粒构成；病毒粒子的最外层为囊膜，由多种病毒糖蛋白组成（HomaFLetal，2013）。PRV基因组所编码的产物大部分都参与病毒粒子的组装。PRV的囊膜表面有8～10nm呈放射状排列的纤突，其与病毒的感染密切相关。此外，有研究表明伪狂犬病毒的核衣壳也具有感染性。5 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究1-2PRV结构示意图（PomeranzLEetal，2005）Fig.1-2ThestructureschematicdiagramofPRV（PomeranzLEetal，2005）1.2.2病毒的基因组特征PRV全基因组约为150000bp左右，为双股双链线性DNA病毒，有相关研究报道由于PRV全基因组G+C百分比占总数的三分之二以上，因此使得对该病毒的基因测序非常困难，在2004年时许多的科学家及研究学者通过将部分测序的6个病毒株的所测序列片段进行拼接，才合成得到完整的全基因组序列（KluppBGetal，2004）。PRV的致病是由需对的基因共同协调控制，主要包括有gD、gE、TK和gI基因4毒力基因（Fanetal.2016；Kimmanetal.1992；Kitsetal.1985；Lüetal.2014），其中TK基因是影响毒力至关重要的基因（姚卫东等，2002；Krameretal.2013；Shibataetal.1991）。TK基因若失活，则PRV对易感动物的致病力起到很大的影响作用；PRV囊膜糖蛋白在病毒感染的病理过程（KratchmarovRetal，2013）、病毒与细胞的相互作用（徐志文等，2009）、免疫原性（MillerLCetal，2010）、病毒生长与繁殖（ZhuLetal，2011）以及新型疫苗研制等方面各具特殊作用。2猪瘟和猪伪狂犬病流行病学状况2.1猪瘟流行病学研究2.1.1猪瘟流行情况王锡祯等针对甘肃、宁夏地区的猪瘟发病情况进行调查发现典型猪瘟的死亡率平均为51.66%，最低为21.63%，最高达75.71%；非典型性猪瘟的死亡率平均为26.92%，最低为0.73%，最高达65.38%（王锡祯等，1998）。吴健敏等收集6 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究广西地区8地州市40个不同规模猪场共43份样品作CSFV检测，从发病的情况看非典型CSF居多占69.2%（吴健敏等，2010）。其中母猪繁殖障碍占46%，新生仔猪死亡占45%，典型的CSF发病仅占23.1%。这表明目前CSF的流行趋势仍以非典型CSF、母猪繁殖障碍、新生仔猪死亡为主，母猪带毒造成的垂直感染不仅直接造成新生仔猪发病、死亡还间接引起仔猪先天免疫麻痹、免疫耐受。王泽洲等调查发现，我国临床非典型猪瘟已是常见的一种病型，而典型猪瘟发病的情况已经很少见，常见的发病对象有哺乳仔猪、断奶仔猪等，临床表现主要为体温升高2～3℃、腹泻至脱水、死亡率不高，达10～20%，个别高达40%。冯力萍等对2015年上半年采自山东、吉林、黑龙江和河北的4个省的疑似CSF病料样本采用RT-PCR的方法进行检测，检测结果显示在采集到的28份样品中有14份样品是CSFV阳性，将检测出的阳性样品进行E2全基因组序列测定，并进行生物信息学分析；结果显示本试验中的14个分离株中有11株属于2.1d新基因亚型，2.1d新基因亚型毒株在E2基因R31、S34、K303和A3314个氨基酸上具有相同的分子特征（冯丽萍，2016）。2.1.2CSFV的分离鉴定及CSFV-E2基因流行变异研究李红卫等在国内开展了CSFV标准弱毒株、强毒与少数流行株E2基因序列的比较研究，发现不同来源厂家提供的疫苗C株和Shimen株之间存一定的差异，推测出不同来源的C株抗原表位存在不同，可能最终导致免疫效果的差异（李红卫等，1998）。王宁等发现，与国内的疫苗毒株同源性比对，Shimen株最低，推测国内疫苗毒株的E2基因在生产过程中具有较大的变异，从而可能导致抗原漂移（王宁等，1999）。刘伯华等对甘肃省6株猪瘟流行野毒及C株疫苗毒株E2基因进行分析，发现在中和抗原决定簇上流行野毒与C株有部分氨基酸存在差异，可能是影响C株对流行野毒的中和滴度的原因（刘伯华等，2001）。赵耘等研究表明，我国猪瘟病毒流行毒株向着远离疫苗株的方向变异，且呈现出多样性（赵耘等，2002）。邓雨修等对2004～2005年在江苏和上海3家猪场分离的猪瘟病毒扩增E2基因比较分析后，结果也表明近年来猪瘟流行毒株的变异呈现出多样性（邓雨修等，2008）。王宁等对石门株E2基因及其推导氨基酸进行分析，发现石门株E2囊膜糖蛋白具有5个潜在糖基化位点和15个半胱氨酸残基，与国外报道的5株猪瘟病7 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究毒的E2囊膜糖蛋白的位置和数量相同，表明E2囊膜糖蛋白骨架结构相同。石门株E2囊膜糖蛋白也具有与其它瘟病毒的E2囊膜糖蛋白一样的细胞受体序列（RYLAIVH）类似的保守序列RY-LASLH（王宁等，1999）。杨健等对贵州省动物疫病研究所鉴定并保存的猪瘟阳性病料中扩增并测定了CSFV基因部分，同源性结果显示，CSFV贵州流行株E2基因与GenBank收录的9株CSFV差异较大；将所获序列与国内外常用的4株疫苗毒株进行序列比较，核苷酸同源性为85.0%～86.0%。初步证实了贵州流行的猪瘟病毒株E2基因发生变异较大（杨健等，2011）。吴旭锦等分析了陕西省5株猪瘟病毒流行毒株的E0和E2基因，这5株流行毒株E0基因核苷酸同源性为94.4%～99.80%，与其他11株参考毒株同源性在80.4%～96.3%，推导氨基酸同源性在86.5%～99.3%；5株流行毒株E2基因核苷酸同源性在91.1%～98.0%，与参考毒株比对，核苷酸同源性为77.7%～94.6%，氨基酸同源性为85.2%～95.9%，而与流行毒株发生免疫逃逸相关的E2蛋白关键位点中，3个位点发生了变异，表明陕西省CSFV流行毒株E2基因序列变异明显，且E2蛋自关键位点变异较大（吴旭锦等，2012）。冯力萍等对2015年上半年采自黑龙江、山东、河北和吉林的4个省的疑似CSF病料样本采用RT-PCR的方法进行检测并测序分析，结果显示14株分离株中，11株属2.1d新基因亚型，且2.1d新基因亚型毒株在E2基因的R31、S34、K303和A3314个氨基酸上分子特征相同（冯丽萍，2016）。以上研究表明，我国CSFV流行毒株E2基因已呈现出明显的变异，然而也有学者持相反的观点。如王琴等对12株CSFV的E2基因主要抗原区域的序列进行分析，结果疫苗株HCLV与国外C株的E2基因相同区域核苷酸及氨基酸同源性分别为99.1%和100%，初步证明我国使用的疫苗株HLCV是稳定的；将我国流行的部分野毒株对应HCLV株研制的疫苗免疫的猪攻毒，试验表明，免疫猪对野毒均具较强的抵抗力，进一步表明HCLV株E2基因主要编码区未发生关键性变异（王琴等，2000）。综上，在我国猪瘟流行毒株的差异情况较为复杂，各地区流行毒株的E2基因主要趋向于远离疫苗株的变异，同时，也存在与Shimen株等疫苗株同源性较高的经典毒株的流行。8 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究2.2猪伪狂犬病流行病学研究2.2.1猪伪狂犬病流行情况目前，世界上已有50多个国家和地区报道猪伪狂犬病的发生及流行，猪伪狂犬病（PR）传播速度快，流行范围广（KetusingNetal，2014），在我国有20多个省市区流行过此病，该病是危害我国甚至全球养猪业发展的重要疫病之一，为此该病在2012年被我国列为《国家中长期动物疫病防治规划》中。20世纪50年代左右，猪伪狂犬病在东欧等国家广泛流行，由于当时感染该病毒的患病猪临床症状表现温和，未导致母猪群大量流产以及仔猪群大量死亡现象，给生猪产业造成的经济损失是缓慢持续的。然而在20世纪60～70年代，由于强毒株的出现，徐小国等发现猪场暴发此病的数量显著增加，症状明显加剧，而各种日龄的猪均可感染（徐小国等，2012）。日本、韩国、英国、美国、法国、越南、泰国等发达及发展中国家都有猪伪狂犬病发病的报道，我国在1947年首次有猪伪狂犬病发病的报道（袁庆志等，1987），但后期由于基因缺失疫苗的使用，我国猪伪狂犬病的流行、发生情况一段时间趋于稳定状态，未见大规模的暴发流行，但至2011年赵鸿远等所报道的变异毒株的出现，一时间全国各地大中小型规模化猪场开始频繁发生猪伪狂犬病（包括已免疫的猪场），相关文献报道。自2012年到2016年中文数据库中报道猪伪狂犬病发生、流行及防控文献就近2000余篇，由此可见猪伪狂病近年来给世界养猪业所带来的经济损失的巨大的。据不完全统计，伪狂犬病已在我国北京、上海、广西、江西、湖北、湖南、安徽、香港和台湾等各个省、市（区）发生和流行。猪伪狂犬病的发生一般无明显季节性，由于猪伪狂犬病病毒主要以呼吸道进行传播，因此该病在冬、春季节发病较多。目前猪伪狂犬仍然时常发生，但以散发为主，个别猪场因免疫、防疫等控制手段不到位可暴发流行。猪是伪狂犬病病毒自然界唯一天然贮主，除各种日龄的猪都易感染外，在自然条件下，可引起多种家畜及皮毛动物发病。现已证实猪、牛、羊、狗、兔、狐狸、猫、大鼠等35种动物可被感染（覃庆玉等，2009）。人类对该病具有抵抗性（何启盖等，2000）。但目前最新研究表明该病毒在某种条件下可感染人。伏鹏等对我国2005～2015年近11年的猪伪狂犬血清流行病学资料进行汇总分析及gE基因变异情况研究，结果显示11年中涉及的3732个猪场中有2189个为阳性场，阳性率为9 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究58.65%（2189/3732），共有272144份血清样本，其中79754份阳性，血清阳性率为29.31%（79754/272144）。对各阶段猪群野毒调查得知经产母猪、后备母猪、商品猪、种公猪、哺乳仔猪、保育猪的平均阳性率分别为29.66%、20.79%、20.62%、32.99%、23.38%、21.83%；根据调查结果显示：在所调查的猪场中种公猪的野毒阳性率最高，其次为经产母猪；最低的为商品猪和后备猪；说明与我们日常最重视猪群免疫结果不相一致。各地的调查结果显示中南地区、东北地区、华北地区、华东地区、西北地区、西南地区、河南地区规模化猪场PR野毒阳性率平均为22.23%、27.74%、34.53%、26.93%、24.89%、23.89%、34.85%（伏鹏等，2016）；说明猪伪狂病的流行在我国北部地区流行发生状况较高。该病的传播源主要来自带毒猪、病猪以及带毒鼠类，除此，患病康复猪和隐性感染猪均可带毒排毒感染健康猪群。猪伪狂犬病病毒的传播方式主要包括垂直传播和水平传播。伪狂犬病病毒一旦垂直传播给胎儿，对胎儿将是致命的危害，该病毒也可以通过空气进入呼吸道传播，感染健康猪群。被污染的饲料、乳汁、饮水、生产器械等也是不可忽视的传播途径。本病还可经呼吸道粘膜、破损的皮肤和配种等发生感染。成年猪感染后多耐过，不发病呈隐性感染，长期带毒排毒；公猪精液也是一种带毒排毒媒介。2.2.2PRV的分离鉴定及PRV-gE基因流行变异状况魏春华等对福建某猪场发病仔猪脑、肺脏进行检测，并从中中分离到一株伪狂犬病病毒，根据NCBI中已发表的PRVgE基因的序列，设计合成一对引物，采用PCR方法扩增、测序及分析（魏春华等，2012）。测序结果与GenBank中有代表性的6株参考毒株相应基因序列比较，核苷酸和氨基酸序列相似性分别为95.5%～99%和91.8%～98%；系统进化树结果表明分离株与湖北Ea株亲缘关系最近。表明该毒株依然与此前所分离得到的毒株gE基因序列有较高的同源性。占松鹤等对伪狂犬病病毒安徽分离株的gE基因进行PCR扩增和序列分析。应用相关的生物信息学软件对得到的gE基因序列核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性分析。结果表明，与参考毒株相比猪伪狂犬病病毒安徽分离株之间的核苷酸同源性分别为96.8%～99.7%，氨基酸序列同源性为97.9%～100.0%，与GenBank收录的国内外其他地区的标准参考毒株的核苷酸同源性为97.0%～10 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究99.7%，氨基酸序列同源性为97.4%～100.0%（占松鹤等，2013）。表明gE基因序列具有较高的保守型。薛双等将HNJZ株PRVgE基因与从GeneBank上已公布的国内外PRVgE基因序列进行核苷酸序列同源性和推导氨基酸序列同源性的比较；分析结果显示：PRV不同地域毒株之间的gE基因同源性很高，核苷酸同源性达97.3%～99.9%，推导氨基酸序列同源性达94.8%～99.8%。HNJZ株与国外毒株中的yangshan株和国内毒株中的Min-A株gE基因的核苷酸同源性和氨基酸同源性均为最高，核苷酸同源性均为99.4%，氨基酸同源性均为99.1%（薛双等，2008）。伏鹏等调查结果显示我国2005～2015年感染的PR野毒株同源性介于99.4%～99.8%，而与其他国内外参考株的同源性介于92.6%～100%；数据显示gE基因相比之下具有较高的保守性（伏鹏，2016）。张青占等通过对江苏某猪场已免疫猪伪狂犬病疫苗的发病仔猪脑组织进行检测，并对其进行分离鉴定得到一株PRV野毒，命名JS-2012；与此同时对该毒株的主要相关基因进行测序、一系列的生物学鉴定和特性分析，（张青占等，2013）。分析结果表明，所分离毒株的gE，gB，gC和gD这4的基因变异程度相对较大。其中，gE全基因序列与2012年所分离毒株的相似性高达99.9%，且系统进化树位于同一个分支。与此前广泛流行的经典毒株相比，该毒株在氨基酸gE48和gE496这两个部位存在3个连续的碱基的插入，氨基酸序列增加了2个天冬氨酸。另外病毒的囊膜蛋白、被膜蛋白以及核衣壳蛋白编码基因都有不同程度的变异，非结构蛋白基因变异主要集中在与病毒复制和包装相关的基因，有些非编码区的调控序列也有较大变异，比如增强子和复制起点序列。由上述信息表明，gE基因具有较高的保守型，但在如此高的保守性下仍然导致变异毒株的出现，并且变异位点相对较于稳定，我国在过去的11年中猪场平均阳性率为58.65%，血清平均阳性率为29.31%。由此可知在12年之前我国对PR的防控具有一定的成效，尤其是在gE缺失疫苗的应用使得PR的感染发病率有了很大的降低，但在2012年之后由于变异毒株的出现使得我国猪伪狂犬病的感染情况不断加重，并且呈每年上升趋势，对我国养猪业造成了巨大的经济损失。推测这可能与我国的养猪业不断发展，从国外大批量引种有关，应严格控制引种环节（伏鹏，2016）。11 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究3猪瘟与猪伪狂犬病的国内外净化研究现状3.1国外对猪瘟和猪伪狂犬病的净化方案3.1.1美国猪伪狂犬病根除方案美国猪伪狂犬病根除项目是由美国农业部年建立，并由联邦政府、州政府、企业三方合作和投资的一项长期计划。该项目包括监测猪伪狂犬病流行率、系统地对猪群进行鉴定、注射伪狂犬病疫苗、消除隐性感染源和建立阴性动物群（刘芳，2012），具体的根除方案分两个阶段：第一阶段（1989～1998年）：是分工实施猪伪狂犬病净化方案阶段。其中由美国农业部动植物健康检疫局负责协调该项目的各项工作，再由各地州政府颁布并实施，企业公司则负责样品的采集、监测与注射伪狂犬病疫苗，并按规定对圈舍进行清扫、消毒等。该项目主要包括以下五个步骤：1准备期为美国农业部制定PRV净化的相关程序，如组织成立伪狂犬病毒的国家咨询委员会、确定可行的PRV监测程序、先关部门与行业协作实施PRV的净化工作、建立健全的分配监管制度。2控制期按净化要求对需实施净化的猪群开始实施净化，其中包括周边饲养畜禽及外来流动畜禽的监测，防止传播。3畜群强制净首先继续第二步的标准执行，并开始对净化猪群进行流行病化期学诊断和监测，对与养猪场相关联的屠宰场、市场或农场猪也进行相关的监测和注射疫苗，防止扩散。4监测期净化期监测至少要3年才能完成，对猪场监测到的阳性猪群强制捕杀，并保证在监测期前1年内无PRV新病例出现。5无疫期在监测期过后，并且1年内无PRV新病例出现，且严格控制猪的进出口，在此期间免去PRV疫苗的免疫，严格控制各州间猪群的移动。第二阶段（1999～2001年）：提升猪伪狂犬病净化效果阶段，采用更加科学地、有效的、可行的全群扑杀的方法快速清除PRV检测阳性猪群。由政府部门向各地的兽医以公平的市场价格向猪场购买患病猪，最终将患病猪进行无害化12 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究处理。根据以上美国的猪伪狂病净化方案，美国在净化和控制猪口蹄疫、猪瘟、牛布氏杆菌病及牛结核病上相应取得了较大的收获。3.1.2美国猪瘟根除计划猪瘟除水平传播外，该病也可经过胎盘垂直感染胎儿。美国猪瘟扑灭计划大致可分为四个分阶段（李树清等，2002）：第一部分准备阶段主要对猪场猪瘟的感染流行状况、分布、（1961～1966年）阳性率等作基本的掌握。第二、三部分降低发病率和在这个阶段为主要实施净化方案的阶段，（1966～1970年）消灭猪瘟阶段通过疫苗的免疫，定期作病原或抗体的监测，并对野毒感染阳性猪群进行隔离淘汰。第三、四部分防止再次感染此阶段已经对猪瘟的病情及流行状况等到（1970～1977年）阶段了较有效的控制，而最重要的就是要维持所控住猪瘟的流行状态，也是十分不易的。3.1.3西班牙猪伪狂犬病根除方案西班牙猪伪狂犬病根除方案（Allepuzetal,2009），其净化措施包括在每个猪场安排专门负责根除伪狂犬病的兽医；对能繁母猪和后备母猪进行每年3次的基因缺失疫苗强制接种工作；育肥猪每年疫苗免疫至少2次（10～12周龄时接种第1次，间隔3～4周后接种第2次；育龄母猪在进入生殖周期前须免疫3次；每年在产仔到断奶和产仔到出栏这个时期进行血清流行病学调査；所有能繁母猪在进入生殖周期时都要进行抗体检测，其中阴性猪留用，阳性猪淘汰；育肥猪的血清流行病学检测只对纯育肥猪舍和产仔到出栏母猪舍强制执行。3.1.4荷兰猪瘟和猪伪狂犬病根除方案荷兰猪伪狂犬病的根除方案分6个阶段进行（StegemanA，1997）。第一阶段是对净化猪场进行免疫。对于经产母猪首先免疫2次，每次间隔2周；以后每隔4个月重复1次。对于后备猪群先进行2次基础免疫，免疫间隔时间为4周，以后每年免疫3次。对于育肥猪群分别在10周龄和14周龄进行免疫13 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究接种，种猪的替换是出于经济方面的考虑，后备母猪则只要检出抗体阳性即予以淘汰。第二阶段是开展区域净化措施。主要是严格控制猪只移动，并对净化区域实行免疫政策。第三阶段是开展全国性净化措施。第四阶段是控制阶段。按以下免疫程序进行强制免疫：种猪：在10～12周龄和14～16周龄进行2次免疫，25周龄进行第3次免疫，以后每4个月加强免疫1次。育肥猪：在10～12周龄免疫1次，14～16周龄免疫1次。对无伪狂犬病的猪场颁发证书；并在荷兰全国进行伪狂犬病血清学监测，当gE抗体阴性母猪的检出率低于10%，即可进入下一阶段。第五阶段是继续执行上述免疫程序，维持净化状态；并且所有被检出感染的猪群一经检出即予淘汰。第六阶段是监测阶段，即无伪狂犬病阶段，这时将停止免疫程序。荷兰猪瘟的根除方案：荷兰于1997/1998年出台实施的根除措施，也延续了以扑杀为主的方针，以限制转群和活动为基础，同时，在其根除计划中也首次使用了一些附加手段，比如说预先扑杀与感染猪场接触的领近猪场的猪只、区域化运送以及在己建立监控区域的猪群中每月进行一次血清学调查。3.1.5英国猪伪狂犬病净化1984年英国采用：第一阶段对所净化猪场开展PRVgE抗体阳性率的调查，以期对猪场感染情况及是否有净化必要。第二阶段再对已确定进行净化的猪场全面展开净化要求：对PRVgE抗体阳性的所有种公猪、种母猪以及后备猪淘汰，经此方法逐渐实施开展，最终取得较好的净化效果，目前已宣布猪伪狂犬病得以净化。3.1.6法国猪伪狂犬病净化随着欧洲许多国家对猪病的净化逐渐成熟，法国于1989年也开始逐渐实施猪伪狂犬病的根除计划，该净化计划大多借鉴了英国猪伪狂犬病根除计划中比较好的方法，他们都选择了首先了解所净化猪场该病的流行分布状况，然后筛选出可净化猪场，最终才对净化猪场实施该病的净化步骤。根据不同猪场的感染情况14 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究采取了不同的净化措施，高感染率的采用部分隔离再部分监测，底感染率的采用一次性淘汰的净化方式。实施该净化方案10年以后法国猪伪狂犬病病毒gE抗体阳性率由1995年的24.7%降至4.5%。3.1.7欧盟猪瘟净化方案欧盟采用严格的扑杀制度进行猪瘟的净化，禁止使用疫苗来对猪瘟进行控制，但效果不明显，整个欧盟并没有彻底地消灭CSFV。究其原因，野猪是欧盟乃至整个欧洲暴发流行的祸根。野猪分布于欧洲广大山区，其数量日益增多，而且长期存在持续感染，是该病毒的自然贮存宿主和欧盟国家暴发猪瘟的最重要传染源目前欧盟采取的计划需要投入大量物资确保顺利实施，虽然近年来也有研究希望研制出一种标记疫苗作为传统扑杀的辅助手段，但目前仍未见这方面的相关报道。3.1.8其他国家猪瘟的净化日本自成功研制弱毒疫苗并在全国范围内推广应用后，该病得到了很好控制（彭远平等，2016）。墨西哥南部区域是CSFV净化控制区，但到目前为止仍有CSFV流行，一直采用疫苗免疫防制措施进行控制净化。巴西是世界上第6大生猪肉产出国，一直使用我国的C株疫苗防制CSF，与此同时，采取现场防控和实验室相结合的措施进行监测，1992年出台的“控制与扑灭计划”将巴西分为3个地区，该病也随之被逐渐消灭，其中南方3个大型养殖基地已无CSF流行，不使用疫苗的第2个区情况是仍有流行并且养猪量相对较多，同时规模化程度也很高，此区域内实行强制免疫。第三个区域的情况是养猪规模化程度不高，要求其进行疫苗接种，但并不强制。这一计划的实施取得了显著效果。3.2国内对猪瘟和猪伪狂犬病的净化实施现状3.2.1净化方案的制定根据国外根除猪病的净化方案为例，大部分的主要监测猪病的流行状况、疫苗免疫状况、消除隐性感染源和建立阴性猪群。因此，我国在动物疫病的净化过程中是需要有计划、有步骤地循序渐进的开展，且须针对不同的感染情况和净化15 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究对象分别设计合理可行的净化措施。因此，完善我国的动物疫病净化措施需要分阶段、分情况地提出，使得净化工作具体化、清晰化。我国猪病的净化措施，大多侧重在净化各项技术措施的实施，而忽略了净化方案的制定。此外，我国国内所建立的疫病净化方案（江西省动物疫病净化方案和广东省无疫区建设方案）相对于国外的动物疫病净化根除方案，在内容上显得有些薄弱，涉及的范围略窄，存在许多不全面内容。因此，我国以后在考虑净化方案的建立时，不仅要考虑长效性，还要使得净化工作具体化、全面化、清晰化。2012年，我国提出《中长期动物疫病防治规划》，说明当前我国政府十分重视净化动物疫病，但长期的养殖现状及条件给净化工作造成难度，导致区域内病原体持续长期存在，使得净化较难实现。维持在净化方案的规划中应包含免疫退出计划。例如，荷兰猪伪狂犬病的净化方案的最后一个阶段为停止免疫，以及美国猪瘟净化中的第2阶段禁止使用活疫苗，第3阶段不使用疫苗，最终在停止免疫后都成功净化该病。此外，本研究提出的净化ELISA抗体检测结合多重PCR监测的思路，根据我国国情应用于生产实际是切实可行的。因此，在实施动物疫病净化方案时，首先对净化猪场进行ELISA抗体监测，初步了解猪场的流行分布状况是很有必要的。在生产实际中，设立隔离屏障体系，划分净化区域和隔离区域范围，根据净化方案，按照净化计划，逐步由免疫无疫过渡到非免疫无疫。3.2.2国内对猪瘟和猪伪狂犬病的净化实施江西省动物疫病净化方案中的猪痕和猪伪狂犬病的净化措施如下（刘芳，2012）：①严格的防疫体系。必须确保生猪得到有效的防疫和隔离，避免接触到传染源而发生再次感染，同时，种猪场（站）要对猪舍、栏圈定期消毒。②实施早期断奶技术，降低或控制其他病原的早期感染，建立健康猪群。③实施全进全出制度，生猪调入调出前后用不同的消毒药物彻底清洗消毒栏舍。④对生猪实施部分清群。首先对能出售的生猪销售清空，其次对疫病多而复杂的生猪进行清群或分场管理，对濒临淘汰的生猪及早淘汰。对于上述清群后的猪舍进行清洗、消毒、空舍等处理。16 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究⑤禁止在种猪场、生猪人工授精站内饲养其它动物，实施灭鼠措施。⑥加强生猪的保健工作。净化措施会涉及频繁而且数量较多的转群，对转群前后生猪和产前产后母猪进行药物预防保健。⑦疫苗免疫措施。种猪在疫苗免疫后测定抗体，不合格者淘汰或隔离出猪场（站）；仔猪疫苗免疫后按猪群5%的比例抽血清测定抗体水平，评价免疫的效果。对于抗体水平较低且生长不良的仔猪尽量能追溯到生产它的种猪，进一步核查是否种猪感染病毒。⑧监测淘汰法。以种猪场（站）为单位，对检测阳性猪群进行扑杀或淘汰处理；后备猪群混群前应严格检测，阴性后备猪才可留用；引进的种猪必须是从无猪瘟的猪场引进，要有《种畜种禽合格证》和《检疫合格证明》，引进后隔离饲养30～60d经检测合格后才可混群饲养。除此以外，当猪场母猪产仔出现弱仔猪、死胎、流产胎儿应及时收集，取其扁桃体、脾脏、肾脏和淋巴结等病毒首要侵害组织器官进行病原检测，将检测阳性猪群淘汰；对于生产记录不佳的种猪，收集所产仔猪的脐带血作病毒抗体检测，根据检测结果，合理淘汰种猪。我国宝岛台湾自1992年开始实施伪狂犬病根除计划，根除计划主要内容为免疫——监测——扑杀，首先对猪群进行免疫，其次是对猪群进行持续监测，发现阳性猪进行扑杀，引进猪只必须隔离观察3周，伪狂犬病野毒感染抗体血清学阴性才可入群。通过根除计划的实施，台湾猪群猪伪狂犬病野毒感染阳性率明显下降，目前大部分猪群猪伪狂犬病已根除。贺继云等制定了针对性的伪狂犬病净化策略，该策略包括：A、采用高效gE单基因缺失弱毒疫苗按科学免疫程序进行种猪群每年3次普免；仔猪实行早期（0～10日龄）滴鼻免疫，8～9周龄每头再注射1头份。B、每年定期2次抽样检测整体猪群伪狂犬病的免疫效果和病毒感染状况，评估伪狂犬病病毒感染压力；C、引进或选用伪狂犬病病毒阴性后备猪群并至少加强免疫1次。D、至少每年2次定期检测全群公猪伪狂犬病病毒感染状况，淘汰病毒感染阳性公猪。该策略在部分猪场推广使用，取得较好的净化效果（贺继云，2009）。梁世忠等研究猪场结果显示仔猪伪狂犬病抗体水平的试验，确定最佳首免日龄为30日龄；采用伪狂犬TK/gE基因缺失苗进行免疫并结合血检和淘汰阳性种17 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究猪的方法是有效可行的（梁世忠，2012）。宋兵等制定“免疫→检测→淘汰→监测”循环体系，成功完成自繁自养的猪场猪伪狂犬病净化（宋冰，2015）。郝建伟等对猪场进行猪瘟、猪伪狂犬病的净化，该研究从现有抗原抗体检测方法中筛选了几种简便易行、灵敏性高的手段组成猪瘟、猪伪狂犬病检测集合，并应用其对合作猪场进行流行病学调查，确定了方法的可行性，通过检测了解猪场疾病状况，分析了猪场防控的程序，制定计划实行净化（郝建伟，2009）黑龙江省于1997～2000年开展了种猪场有关疫病净化技术研究的科研项目研究，对22家种猪场进行猪伪狂犬病净化工作。主要内容为：首先进行血清学摸底调查，确定猪伪狂犬病野毒感染阳性率，其次是对种猪场种猪进行全群监测，对阳性猪只进行淘汰处理，净化计划实施1年后，种猪场猪伪狂犬病野毒感染阳性率由原来30.05%下降至0.02%。4本研究的目的和意义我国在2006年以前CSFV能得到较好的控制，但2006年后CSFV在E2基因的部分序列改变，使得猪瘟的防控变得较为严峻，出现了新一轮CSF我国一些地方流行。2011年赵鸿远等报道PRV变异毒株出现，变异毒株导致新一轮的PR的流行高峰，给养殖业带来极大的经济损失。国家疫控中心近几年对大部分种猪场进行定点疫病监测：CSF病原阳性率达3.2%、PRVgE抗体阳性高达22.2%。至此，《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020）》明确提出CSF和PR为优先和重点防控的两种病，在防治规划要求2020年三分之二的原种猪场的猪场必须达到净化标准。本研究首先对实施净化方案前的某规模化猪场中的CSF和PR血清学进行调查研究；在血清学研究的基础上再对CSF和PR病毒核酸进行研究，并对该规模化猪场病原学检测的CSF和PR部分阳性样本进行病毒的分离鉴定；由于CSFVE2基因和PRVgE分别是猪瘟和猪伪狂犬病最主要的毒力基因之一，因而本试验接着对规模化猪场病原学检测中部分CSF流行株的E2基因和PR流行株的gE基因进行PCR/RT-PCR全基因的扩增、克隆、测序及遗传变异分析，为净化方案的实施提供真实有效的素材。最后运用已建立的CSFVRT-PCR检测技术（(GB/T16551-2008)）、PRVgE/gB-ELISA检测方法（GB/T18641-2002）和本实验室已建立的鉴别猪瘟和猪伪狂犬病野毒和疫苗毒mPCR方法，对贵州省某规模化猪场18 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究猪瘟与猪伪狂犬病净化方案的应用效果进行研究。以期为贵州规模化猪场的CSF和PR流行情况、遗传变异状况及猪场CSF和PR净化提供参考依据。19 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究第二章规模化猪场CSF和PR血清学调查研究猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）可引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病（陈溥言，2006）。该病易与其他疫病混合发生（郝飞等，2012）。2011～2015年PR的流行呈持续上升趋势（林文耀等，2016）。PRV宿主范围广泛，在自然状态下除感染猪等多种家畜外，多种野生动物也可发生感染。成年猪多为隐性感染，能长期带毒排毒；妊娠母猪发生流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍；仔猪通常出现发热、呕吐、衰竭或明显的神经症状，死亡率可高达100%。该病自1813年在美国牛群中首次发生以来，50多个国家和地区均有该病发生的报道，给养猪业造成了严重的经济损失。目前，该病已被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病，我国也将其列为二类动物疫病。猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）是一种引起猪的急性、热性和高度接触传染的病毒性传染病病原，该传染病称猪瘟（Classicalswinefever，CSF）（陈溥言，2006）。早在20世纪60年代我国就成功研制出享誉世界的猪瘟兔化弱毒疫苗，并有效地控制了猪瘟的大范围流行。但近年来，猪瘟的流行及发病情况发生了新的变化，主要表现为母猪隐性感染，胎盘感染，母猪流产、死产，新生仔猪免疫耐受，新生仔猪死亡等特征。本试验通过对贵州省某规模化猪场实施净化方案前所采集的样品进行猪瘟和猪伪狂犬病的血清学调查研究，旨在了解贵州规模化猪场PR和CSF流行免疫抗体状况，为猪瘟和猪伪狂犬病的防控、净化研究和根除的提供指导。1材料1.1样品来源样品来源于2015年12月贵州省某规模化猪场所采集的1430份血液样品（该猪场存栏量约12000头，种猪群和后备猪群为全群采样，保育猪群和育肥猪群则以5%比例进行样品的采集）。其中种猪群样品各464份、后备猪群样品各472份、保育猪群样品各228份及育肥猪群各266份。全血的采集方式：包括耳缘静脉和前腔静脉采血2种。该猪场均在2015年1月份已免疫猪瘟和猪伪狂犬病疫苗。20 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究1.2主要试剂猪瘟病毒抗体蛋白ELISA检测试剂盒，购自武汉科前生物科技有限公司；猪伪狂犬病病毒gB/gE抗体蛋白ELISA检测试剂盒，购自武汉科前生物科技有限公司。1.3主要实验仪器可调微量移液器，Gilson公司产品；酶标仪（GF-M3000），购自山东高密彩虹分析仪器有限公司；恒温培养箱（HH·CP-01W），购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；数显鼓风干燥箱，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；高速冷冻离心机，Heraens有限公司。2方法2.1血液样本的处理将送检血样按常规方法处理后，分离得到血清，3000rpm离心5～15min取上清，严格按照猪伪狂犬病病毒gB/gE抗体ELISA检测试剂盒及猪瘟抗体ELISA检测试剂盒操作说明书进行。2.2猪瘟病毒ELISA抗体检测使用前说明：浓缩洗涤液应该恢复至室温（25℃左右），并摇动使其沉淀溶解（37℃水中加热5～10min），作20倍稀释（例如：每板用30mL浓缩液加上570mL蒸馏水），稀释好的洗涤液可在2～8℃存放7d。对照样品稀释：在血清稀释板中以1:40分别稀释阳性对照和阴性对照（若234µL样品稀释液中加6µL对照血清）。待检样品稀释：按1:40的体积稀释待检血清样品（若195µL样品稀释液中加5µL待检血清样品）。21 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究操作步骤：（1）取抗原包被板（根据样品多少可拆开并分次使用），分别将稀释好的待检血清与对照各取100µL加入到抗原包被板的孔中，待检样品做1孔，阴性对照与阳性对照各设2孔，每孔为100µL。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃进行温育30min。（2）甩掉板孔中的溶液，每孔应加稀释好的洗涤液200µL，并静置3min倒掉，再在吸水纸上拍干，应洗涤5次，（3）每孔加羊抗猪酶标二抗100µL，置37℃进行温育30min。（4）洗涤5次，方法同2。注意每次在干净吸水纸上拍干。（5）每孔先加入底物液A一滴（50µL）、再加入底物液B一滴（50µL），混匀，室温（18℃～25℃）避光显色10min。（6）每孔加入终止液一滴（50µL），10min内测定其结果结果判定标准：在酶标仪上测各孔OD630nm值。试验成立的条件是阳性对照孔平均OD630nm值≥0.6，阴性对照孔平均OD630nm值必须＜0.3。样品OD630nm值＞0.35，判为阳性；样品OD630nm值＜0.35，判为阴性。注意：用620～650nm波长测定结果均有效。2.3猪伪狂犬病毒ELISA抗体检测使用前说明：浓缩洗涤液应该恢复至室温（25℃左右），并摇动使其沉淀溶解（37℃水中加热5～10min），作20倍稀释（如：每板用30mL浓缩液加入570mL蒸馏水），稀释好的洗涤液可在2～8℃存放7d。对照样品稀释：在血清稀释板中应按1:1分别稀释阳性对照与阴性对照（如：120µL样品稀释液中加12µL阳性或阴性对照）。待检样品稀释：在血清稀释板中应按1:1的体积稀释待检血清样品（如：100µL样品稀释液中加入100µL待检血清）。22 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究操作步骤：（1）取抗原包被板（根据样品多少可拆分次并使用），将稀释好的待检血清样品与对照血清各取100µL加到抗原包被板孔中。待检样品做1孔，阴性对照与阳性对照各设2孔，轻轻振匀孔中的样品（勿溢出），置37℃下温育30min。（2）甩掉板孔中溶液，每孔应加稀释好的洗涤液200µL，静置3min后倒掉，再在吸水纸上反复拍干，共计洗涤5次。（3）每孔加入酶标记物100µL，置37℃温育30min。（4）应洗涤5次，方法同2，注意每次在干净吸水纸上反复拍干。（5）每孔先加入底物液A50µL，再加入底物液B50µL，混匀，室温（20℃～25℃）避光显色10min。（6）每孔加终止液50µL，10min内测定结果。结果判定标准：在酶标仪上测各孔OD630nm值。试验成立的条件是阴性对照孔平均OD630nm值与阳性对照平均OD630nm值之差≥0.4.S=样品孔OD630nm值，N=阴性对照孔平均OD630nm值。若S/N比值≤0.6，样品判为PRV抗体阳性。若S/N比值≤0.7但＞0.6，复检，结果仍相同，则过段时间后重新取样检测。若S/N比值＞0.7，样品判为PRV抗体阴性。注意：用620～650nm波长测定结果均有效。2.4猪伪狂犬病毒gE-ELISA抗体检测使用前说明：浓缩洗涤液应恢复到室温（25℃左右），并摇动使其沉淀溶解（37℃水浴锅中加热5～10min），作20倍稀释（如：30mL的浓缩洗涤液加入570mL蒸馏水），混匀，稀释好的洗涤液可在2～8℃可以存放7d。对照样品稀释：在血清稀释板中按照1:1的比例稀释（如：120µL样品稀释液中加入120µL对照血清）。23 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究待检样品稀释：在血清稀释板中按1:1的比例稀释（如：100µL样品稀释液中加100µL待检血清）。操作步骤：（1）取抗原包被板（根据样品多少可拆分多次并使用），分别将稀释好的待检血清样品与对照血清各取100µL加入到抗原包被板孔中。同时设2孔为阴性对照、孔为阳性对照，轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃下孵育45min。（2）弃去孔中的液体，并在每孔加入200µL洗涤液，每次静置3min后弃去洗涤液，并在吸水纸上反复拍干，共计洗板5次。（3）每孔加酶标记物100µL，置37℃下孵育20min。（4）应洗涤5次，方法同2。（5）每孔加入底物液A和底物液B各1滴（约50µL），混匀，室温（20～25℃）避光显色15min左右。（6）每孔加入终止液1滴（约50µL），混匀后10min内测定结果。结果判定标准：在酶标仪上测各孔OD630nm值。试验成立的条件是阴性对照孔平均OD630nm值与阳性对照平均OD630nm值之差≥0.3。S=样品孔OD630nm值，N=阴性对照孔平均OD630nm值。若S/N比值≤0.35，样品判为gE抗体阳性。若S/N比值≤0.4但＞0.35，判可疑，须复检。如结果仍相同，则gE抗体阳性。若S/N比值＞0.4，样品判为gE抗体阴性。注意：用620～650nm波长测定结果均有效。3结果在所检测的1430份样品中，猪瘟抗体阳性有1205份，合格率为84.27%（1205/1430）；其中种猪、后备猪、保育猪和育肥猪的猪瘟抗体阳性率均在80%以上，相比之下后备猪群抗体保护力较高，保育猪较差，结果见表2-1。24 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究表2-1规模化猪场猪瘟流行病学调查结果Table2-1Epidemiologicalsurveyresultsofswinefeveronscaledpigfarms猪瘟抗体阳性猪群种类样本数量样本数百分比种猪46440186.42%后备猪47239683.90%保育猪22818681.58%育肥猪26622283.46%合计1430120584.27%在所检测的1430份样品中，PRVgB抗体蛋白阳性有1247份，合格率为87.20%（1247/1430）；PRVgE抗体蛋白阳性有64份，阳性率为4.48%（64/1430）。其中种猪、后备猪、保育猪和育肥猪的PRVgB抗体阳性率均在85%以上。PRVgE抗体蛋白阳性率在4.0%～5.5%之间，在保育猪群中检出gE抗体阳性率最高，为5.26%（12/228），在育肥猪群中检测阳性率最低，为4.14%（11/266），结果见表2-2。表2-2规模化猪场猪伪狂病流行病学调查结果Table2-2EpidemiologicalsurveyofswinepseudorabiesinlargescalepigfarmsPRV-gB抗体阳性PRV-gE抗体阳性猪群种类样本数量样本数百分比样本数百分比种猪46440587.28%204.31%后备猪47241487.71%214.45%保育猪22819685.96%125.26%育肥猪26623287.22%114.14%合计1430124787.20%644.48%3.1CSF血清学检测结果在所检测的1430份样品中，猪瘟抗体阳性率为84.27%（1204/1430）；其中种猪、后备猪、保育猪和育肥猪的猪瘟抗体阳性率分别为86.42%（401/464）、83.90%（396/472）、81.58%（186/228）和83.46%（222/266），相比后种猪群抗体保护力较高，保育猪较差，结果见图2-1。25 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究图2-1各猪群CSF抗体阳性率Fig.2-1CSFantibodypositiverateofeachpig3.2PR血清学检测结果在所检测的1430份样品中，PRVgB抗体蛋白阳性有1247份，合格率为87.20%（1247/1430）；PRVgE抗体蛋白阳性有64份，阳性率为4.48%（64/1430）。其中种猪、后备猪、保育猪和育肥猪的PRVgB抗体蛋白阳性率分别为87.28%（405/464）、87.71%（414/472）、85.96%（196/228）和87.22%（232/266），相比之下后备猪群抗体保护力较高，保育猪较差。PRVgE抗体蛋白阳性率种猪为4.31%（20/464）、后备猪群为4.45%（21/472）、保育猪群为5.26%（12/228）及育肥猪群为4.14%（11/266）；除保育猪群中检出率相对较高以外，其他3个猪群差异不大，结果见图2-2。26 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究图2-2各猪群PRV-gE/gB抗体阳性率Fig.2-2PRV-gE/gBantibodypositiverateofeachpig4讨论本试验对贵州某规模化猪场采集的1430份血清样品进行PRVgB/gE、CSFV抗体蛋白的检测，结果表明贵州省PRVgB抗体蛋白阳性率在85.0%以上，PRVgE抗体蛋白阳性率为4.14%～5.26%。其中保育猪的伪狂犬病抗体保护力相对较薄弱，野毒检出率也大于种猪、后备猪和育肥猪，因此在养殖过程中应该加大对保育猪的免疫监测。猪瘟抗体检测结果显示，各猪群间抗体阳性率在81.58%～86.42%。造成各阶段猪群阳性率差异明显的原因，主要有以下几点：1)哺乳仔猪的抗体主要通过母乳获取，与母猪体内抗体含量成正比，并且哺乳仔猪在进行首免时，母源抗体活性较高会中和部分疫苗，造成抗体水平下降；2)育肥猪抗体阳性率较低的原因，可能是由于首免后抗体水平下降以及没有及时进行二次免疫；3)保育猪阳性率最低的原因，可能由于从28日龄开始，猪瘟母源抗体开始出现急剧下降，与此同时没有及时进行疫苗免疫。在2011年前PRV野毒感染率普遍在20%以下，在2011～2013年间PRV野毒的感染率呈螺旋式上升，至2014～2016年PR野毒感染率已居高不下，上海2013～2015年的感染率高达60.6%，新疆2014～2015年的感染率高达27 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究68.23%，2015年河北、河南、辽宁、山东、陕西等5省的感染率高达51.88%（祖立闯等，2017）。2016年江苏省PRVgB抗体阳性率为95.9%，gE抗体阳性率达43.2%（杨珊珊等，2017）；虽然抗体保护率很高，但野毒阳性率也很高，说明疫苗免疫对现今的野毒株抵抗力较低。由于目前所使用的抗体检测试剂盒无法鉴别CSF疫苗毒和CSF野毒。在疫苗接种剂量正常的情况下，要判断是否存在野毒感染，只能根据抗体水平高低和整齐度粗略判断是否是CSF野毒刺激产生的抗体。当抗体水平异常升高或者抗体整齐度很差时可初步认为有CSF野毒存在，而贵州省猪CSF和PR流行病学状况较为模糊。因此本试验对贵州规模化猪场CSF和PR血清学进行调查，同时，对后期规模化猪场开展猪瘟和猪伪狂犬病的净化提供就很重要的本底调查数据。本研究对伪狂犬病病毒和猪瘟病毒贵州规模化猪场流行株进行了分子流行病学的调查研究，在后续研究中，我们将从PRV和CSFV基因遗传变异规律、作用机理方面及疫苗防控方面进行研究，为进一步预防、控制和根除猪伪狂犬病的发生和流行提供一定的参考依据。5结论（1）完成了某规模化猪场中PR血清学调查。PRVgB抗体阳性率为87.20%（1247/1430）；其中种猪、后备猪、保育猪和育肥猪的PRVgB抗体蛋白阳性率分别为87.28%（405/464）、87.71%（414/472）、85.96%（196/228）和87.22%（232/266）。PRVgE抗体阳性率为4.48%（64/1430）；PRVgE抗体阳性率种猪为4.31%（20/464）、后备猪群为4.45%（21/472）、保育猪群为5.26%（12/228）及育肥猪群为4.14%（11/266）。（2）完成了某规模化猪场CSF血清学调查。猪瘟抗体阳性率为84.27%（1205/1430）；其中种猪、后备猪、保育猪和育肥猪的猪瘟抗体阳性率分别为86.42%（401/464）、83.90%（396/472）、81.58%（186/228）和83.46%（222/266）。28 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究第三章规模化猪场CSF和PR病原学调查研究猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）由伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）所引起，最早由匈利亚学者Aujeszky研究发现。PR以大部分家畜和皮毛类野生动物以发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为临床表征的一种急性传染病（陈溥言，2006），该病又称Aujeszky氏病（殷震等，1997），由于该病的传播方式主要通过呼吸道进行传播，针对该病的防控也变得极为困难，而且在临床发病案例中经常与CSF、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV2）及猪流行性腹泻病毒（PEDV）等常见疫病混合感染（郝飞等，2012）。2012年国家提出对重要疫病的净化是保障规模化养殖场科学健康持续养猪的重要策略之一，颁布了《国家中长期动物疫病防治规划》中提出在2020年以前对全国规模化养殖场实现CSF、PR等5种疫病的净化目标。因此准确掌握贵州规模化猪场猪场CSF和PR病原流行状况及特征分析对猪场净化提供可靠的基础。本实验通过对实施净化方案前某规模化猪场所采集的扁桃体样本进行CSF和PR病原学的检测，并对部分PR和CSF野毒阳性的病料进行处理、病毒分离鉴定、病毒效价的测定，旨在了解和研究贵州CSFV和PRV分离株病原特征，为CSF和PR的进一步防控和净化研究提供参考。1材料1.1样品来源样品来源于贵州省某规模化猪场所采集的与第二章中全血样品相对应猪只的1430份扁桃体及全血样品。其中种猪群样品各464份、后备猪群样品各472份、保育猪群样品各228份及育肥猪群各266份。扁桃体的采集：使用专用扁桃体采集器（购自四川成都德麟科技有限公司），首先使用开口器进行开口，将扁桃体采样器枪口轻放于扁桃体对应位置上，快速扣动扳机钩取一粒扁桃体于有生理盐水的离心管中，冷藏送检。29 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究1.2主要试剂TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNA＆RNAExtractionKitVer.5.0、GoldView、DNAMarkerDL1000/2000，均购自于大连宝生物工程有限公司；Vero、PK-15细胞由贵州大学动物科学学院动物生物技术实验中心保存；胎牛血清（FBS），均购自HyClone公司；琼脂糖，为Biowest公司产品；PCR上下游引物由上海英潍捷基有限公司合成；其他试剂均为进口或国产分析纯产品。1.3主要溶液的配制1.3.150×TAETris242g0.5MEDTA（PH=8.0）100mL冰醋酸57.1mL加双蒸水定容至1000mL。常温备用。1.3.21%琼脂糖凝胶电泳液1×TAE200mL琼脂糖2g均匀加热溶解，冷却至60℃左右。Goldview15μL晃动溶解均匀。1.3.30.15MPBS(PH7.4)KH2PO40.2gNa2HPO4•12H2O2.9gNaCl8.0gKCl0.28gddH2O800mL溶解后，加水定容至1L，分装高压备用。30 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究1.3.4CMF细胞洗涤液KH2PO40.2gNa2HPO4•12H2O2.25gNaCl8.0gKCl0.2gddH2O800mL溶解后，加水定容至1L，分装高压备用。1.3.52.5%戊二醛固定液25%戊二醛1.0mL0.2M磷酸盐缓冲溶液5.0mLddH2O4.0mL1.4主要实验仪器与耗材吸头（RNasefree），购自AXYGEN公司；细胞培养瓶，购自Corning公司；可调微量移液器，购自Gilson公司；梯度PCR扩增仪，购自美国BIO-RAD有限公司；ThermoForma-80℃超低温冰箱，购自美国BIO-RAD有限公司；GelDOCXR凝胶成像系统，购自美国BIO-RAD有限公司；电泳仪、制胶板、梳子和电泳槽等，购自北京市六一仪器厂；高速冷冻离心机，购自Heraens有限公司；800型离心沉淀器，购自上海手术器械十厂；精悬电子天平，购自西特传感技术（天津）有限公司；荧光倒置显微镜，购自Nikon公司；CO2培养箱，美购自国ThermoFisher有限公司；生物安全柜（BSC-1300Ⅱ型），购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；数显鼓风干燥箱，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂。31 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究2方法2.1引物设计与合成根据本实验室已建立的《规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病净化方案》中的鉴别CSF和PR野毒和疫苗毒多重PCR引物（FC1、RC1，FC2、RC2；FP1、RP1，FP2、RP2，FP3、RP3，）进行合成；再通过GenBank中已发表的PRV基因序列，设计1对引物，扩增PRVgE全基因序列（FP4、RP4），预计扩增片段为1753bp。根据在Genbank中我国已经发表的猪瘟病毒shimen株和C株序列，设计一对CSFV全基因特异性引物（FC3、RC3），预扩增片段长1137bp，PAGE级，OD值为2.0，由上海英潍捷基测序公司合成，见表3-1。表3-1：引物序列及片段大小Table3-1：Specificprimersusedtoamplifytargetgenes病毒引物序列（5'→3'）目的基因片段大小/bpVirusesPrimerSequence(5'→3')TargetgenesProductlengthFC1：5'-AGATTCCAGTGGTGAGAGGGGTA-3'野毒wild-type649RC1：5'-GCCGGCGCTAAATAAATAAAAAAT-3'FC2：5'-ACTCGGGGCCTGGACTAGACA-3'VaccineCSFV378RC2：5'-CGCCGAAAAAAGAAAAAAAAGAA-3'疫苗毒FC3：5'-CGGGATCCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC-3'E2（全）1137RC3：5'-CCCAAGCTTGACCAGCGGCGAGTTGTTCTGTTAG-3'FP1：5'-TGGCGTACTGGCGCACTCTGTT-3'TK282RP1：5'-TGATGTCCCCGACGATGAAGCG-3'FP2：5'-AGGCCATCGACGCCATCTACCA-3'gB549RP2：5'-TGGAGTTCTGCACGTACACGCC-3'PRVFP3：5'-GCGAGAACTTTACCGCCACGCT-3'gE829RP3：5'-TCGTCCTCGTCGCTGCTGAACT-3'FP4：5'-CGGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGC-3'gE（全）1753RP4：5'-CGGAATTCTTAAGCGGGGCGGGACATCA-3'注：斜体代表酶切位点Note:Italicizedsitesrepresentrestrictionsites32 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究2.2病毒核酸的提取将所采集的全血样本12000rpm离心5min取上清，扁桃体样本分别用匀浆器研磨后，尽量将最终匀浆液的量控制在300µL～500µL，收集于EP管中；反复冻融3次后12000rpm离心10min，取上清；按照TaKaRa公司核酸提取试剂盒说明书的操作步骤提取核酸，进行提取病毒的核酸，并于-80℃保存备用。2.3猪瘟病毒E2基因RT-PCR检测将所有样本核酸用鉴别CSF和PR野毒和疫苗毒引物进行mPCR扩增，体系如下，扩增条件为：94℃5min；94℃30s，58.3℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。将检测出的CSFV野毒阳性样品使用E2全基引物进行RT-PCR扩增，体系如下，反应程序：50℃40min；94℃5min；94℃30s，55.0℃30s，72℃30s，35个循环数；72℃10min。反应结束后取5µLPCR产物于1%的1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测（90V，35min），并拍照记录。鉴别猪瘟和猪伪狂犬病野毒和疫苗毒mPCR扩增体系：ddH2O8.0µL2×1stepBuffer25.0µLCSFV野毒、疫苗毒上下游引物各1.5µLPRVgE、gB、TK引物各1.0µL模板4.0µLOnestepenzymemix1.0µL总体积50.0µLCSFVE2（全）基因扩增体系：ddH2O7.5µL2×1stepBuffer12.5µL上下游引物各1.0µL模板2.0µLOnestepenzymemix1.0µL总体积25.0µL33 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究2.4猪伪狂犬病病毒gE基因PCR检测将本文第二章PRgE抗体检测阳性样品所对应的扁桃体和血液样本经处理后，按TaKaRa公司核酸提取试剂盒说明书提取核酸，用鉴别CSF和PR野毒和疫苗毒引物进行PCR扩增，体系如下，扩增程序为：94℃5min；94℃30s，58.3℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。再对mPCR检测PRV野毒阳性样品再进行PRVgE全基因的检测PCR体系如下，扩增程序为：94℃5min；94℃2min，55℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min。反应结束后，取5µLPCR产物于1%的1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测，并拍照记录。鉴别猪瘟和猪伪狂犬病野毒和疫苗毒mPCR扩增体系：ddH2O8.0µL2×1stepBuffer25.0µLCSFV野毒、疫苗毒上下游引物各1.5µLPRVgE、gB、TK引物各1.0µL模板4.0µLOnestepenzymemix1.0µL总体积50.0µLPRVgE（全）基因扩增体系：ddH2O5.25µL2×GCBufferⅠ/Ⅱ12.5µLdNTP4.0µL上下游引物各1.0µLDNA模板1.0µLLATaq酶0.25µL总体积25.0µL34 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究2.5CSFV的分离鉴定2.5.1细胞接毒分离培养将上述经RT-PCR检测CSFV阳性病料研磨冻融后用MEM培养液制成1：5悬液，离心取上清经0.22μm微孔膜过滤，取0.5mL接种于致密单层PK-15细胞，置37℃感作1h后加入含2%FBS的维持液4mL，置细胞培养箱中培养，于接毒后5d收毒，并提取每一代病毒液的核酸，进行CSFVE2基因的RT-PCR检测。在PK-15细胞培养瓶中均放入灭菌的盖玻片，培养48h后于超净工作台中小心取出飞片固定于洁净的载玻片上，对其进行固定、染色、封片观察。应用间接免疫荧光显微镜进行观察CSFV在PK-15细胞中的增殖情况。2.5.2病毒的形态结构观察取接毒后的PK-15细胞和对照细胞，拍打至细胞完全脱落后，离心弃上清，加入1mL2.5%戊二醛悬浮细胞并转入一新的EP管，再离心弃尽上清后加入1.5mL2.5%戊二醛，送往广西医科大学电镜室进行电镜观察。2.5.3兔体免疫交叉试验将6只生长状况一致的试验家兔随机分成试验组3只和对照组3只。间隔6h测进行体温检测，连续测量3d，直至体温正常。在实验开始后的第4d取第5代细胞病毒液反复冻融3次，12000rpm离心10min，吸取上清并用220nm细菌滤过器进行过滤，每只实验家兔1mL/只耳静脉注射；对照组家兔注射相同剂量的MEM细胞维持液。注射后间隔6h测量其体温的变化，连续测量3d。注射后的第4d对试验组和对照组兔耳静脉1mL/只注射1：20稀释的猪瘟弱毒疫苗，间隔6h进行体温检测，连续测3d，并记录结果。2.6PRV的分离鉴定2.6.1细胞接毒分离培养取病料来源中已经制备好的0.5mL组织过滤液接种致密单层的Vero传代细胞，随后放置37℃恒温培养箱中感作1h后加入含2%FBS的MEM维持液4mL，置于37℃CO2细胞培养箱中恒温培养，每天随时观察细胞病变（CPE），35 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究并拍照记录。未出现CPE现象的细胞则于接毒后5d收毒，再用所获得的病毒液经过反复冻融、离心并过滤后继续盲传直至出现CPE。当CPE达到80%左右时，收取病毒液，反复冻融3次后2000rpm室温离心15min，取上清按上述方法继续接种Vero细胞进行病毒传代。2.6.2病毒蚀斑纯化将待测病毒液接种于已长满的单层致密Vero细胞的6孔板中，封闭放入细胞培养箱中，间隔15min轻轻晃动，摇匀后置37℃感作1h，使得病毒能够均匀的吸附于细胞上，而后吸弃病毒液，用CMF洗涤液轻柔清洗3次后，而后将提前准备好已降温至42℃的1.5%含中性红琼脂糖培养基缓慢铺于细胞上，随后置于37℃、5%CO2细胞培养箱中避光培养观察，当可以清楚的看到单个病毒空斑时挑选单个蚀斑，用吸头缓慢准确的吸取病毒液，冻融3次后接种于单层长满的Vero细胞上扩大培养，如此反复。经6轮蚀斑纯化后，将最后一次挑取的蚀斑接种于Vero细胞上扩大培养，经鉴定后作为第一代纯化病毒。2.6.3病毒的形态结构观察在制备电镜观察样品前，首先根据自己的实验需求培养数瓶单层长满致密的Vero细胞，接毒后24h和对照细胞的Vero细胞各2瓶，拍打至细胞瓶直至细胞完全脱落后，在超净工作台上吸取病毒液于15mL离心管中4℃3000rpm离心10min，弃上清，加入1mL2.5%戊二醛用吸头轻轻吹打离心管管底的细胞沉淀，吹散均匀后并转入一新的EP管，4℃3000rpm离心10min，弃尽上清后加入1mL2.5%戊二醛，用1mL注射器针头沿EP管壁插入底部后缓慢吹动沉淀块使其完全脱落底部，修块后送四川农业大学电镜室对样品进行固定，包埋，切片，染色，用日立H-600A型透射电镜观察。2.6.4易感动物接种试验在试验前尽可能的选取体重、大小及生长状况一致的家兔，将细胞病毒液经220nm的细菌滤过器过滤后，按1﹕100稀释后接种家兔，并且所攻毒的细胞病毒液为同一代病毒液，注射部位同样选取为家兔右侧前肢肩胛骨位置进行注射，实验组皮下注射1mL，对照组家兔皮下注射1mLMEM细胞维持液，切记注射器不可重复使用。36 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究2.6.5病毒效价的测定将经蚀斑纯化后的病毒液反复冻融后，经220nm的细菌滤过器过滤后，用MEM连续10-1～10-15倍稀释后，接种于已长满96孔板或6孔板中已培养至致密单层Vero细胞上，每天随时观察，在接种病毒液4d后即可按照Reed-Muench法测定所分离病毒的TCID50和PFU/mL。3结果3.1规模化猪场CSFV和PRV病原学检测结果3.1.1规模化猪场CSFV病原学检测结果在所检测的1430份样品中，RT-PCR检测结果显示猪瘟病原核酸阳性样本数为37份，阳性率为2.59%（37/1430）；其中种猪群中阳性样本数为13份，占种猪群中的2.80%（13/464）；后备猪群中阳性样本数为11份，占后备猪群中的2.33%（11/472）；保育猪群中阳性样本数为7份，占保育猪群中的3.07%（7/228）；保育猪群中阳性样本数为6份，占保育猪群中的2.26%（6/266），结果见图3-1。图3-1各猪群CSFV病原阳性率Fig.3-1CSFVantigenpositiverateofeachpig37 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究3.1.2规模化猪场PRV病原学检测结果在所检测的1430份样品中，对PRVgE抗体阳性样本进行PCR检测，检测结果显示猪伪狂犬病病原核酸阳性样本数为28份，阳性率为1.96%（28/1430）；其中种猪群中阳性样本数为7份，占种猪群中的1.51%（7/464）；后备猪群中阳性样本数为8份，占后备猪群中的1.69%（8/472）；保育猪群中阳性样本数为7份，占保育猪群中的3.07%（7/228）；保育猪群中阳性样本数为6份，占保育猪群中的2.26%（6/266），结果见图3-2。图3-2各猪群PRV病原阳性率Fig.3-2PRVantigenpositiverateofeachpig3.2CSFV分离鉴定结果3.2.1细胞接毒分离培养结果PK-15细胞在接种48h～72h后，细胞无明显变化。提取每一代病毒液的RNA进行CSFVE2基因RT-PCR的检测，结果显示在每一代病毒液中CSFVE2基因均呈阳性，结果见图3-3。切取目的片段胶块，使用胶回收试剂盒回收的PCR产物后，再pMD19-T载体连接、转化，提取重组质粒经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定的pMD19-gE阳性重组质粒，结果见图3-4，将鉴定阳性质粒送至上海英潍捷基公司测序结果显示，扩增片段大小与预期相符（其中E2基因1137bp），将扩增序列命名为GZA株E2全基因序列。间接免疫荧光检测可见特异性荧光，38 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究而未接种细胞则无特异荧光。随着细胞传代次数的增多，荧光的出现更为规律。其大小和亮度也随着增强，结果见图3-5。BM.DL2000Marker；1-3.F1-3代细胞病毒液M.DL2000DNAmarker；1.重组质粒酶切结果M.DL2000Marker;1-3.F1-3generationcellvirussolutionM.DL2000DNAmarker;1.Recombinantplasmiddigestionresults图3-3CSFVRT-PCR检测结果图3-4重组质粒双酶切鉴定Fig.3-3CSFVRT-PCRtestresultsFig.3-4IdentificationofrecombinantplasmidsbydoubledigestionA1.免疫荧光下CSFV试验组；A2.普通荧光下CSFV试验组；B1.间接免疫荧光下对照组；B2.普通荧光下对照组A1.CSFVtestgroupunderimmunofluorescence;A2.CSFVtestgroupundernormalfluorescence;B1.Controlgroupunderindirectimmunofluorescence;B2.Controlgroupundernormalfluorescence图3-5猪瘟病毒IFA试验Fig.3-5CSFVIFAtestresults39 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究3.2.2病毒的形态学观察结果在透射电镜下，可见细胞核内病毒粒子，呈圆形或椭圆形；对照细胞则未见明显病毒粒子，结果见图3-6。胞浆中可见释放至囊泡中的成熟病毒粒子，呈椭圆形，病毒粒子直径约为30～80nm。图3-6病毒粒子的形态学观察Fig.3-6Virionmorphologyobservation3.2.3兔体免疫交叉试验对进行实验的家兔在攻毒前对所有家兔体温进行检测，并连续监测3d，体温正常后才可以进行后期的实验；而后同等剂量的对试验组和对照组进行实验，注射后连续监测体温3d，各组若未发现体温异常，则进行下一步实验；在第7d对所有家兔接种同等剂量的猪瘟弱毒疫苗，继而继续对实验兔进行体温的监测，测量结果显示对照组家兔在第8d产生轻型的发热反应，而试验组攻毒家兔体温正常。3.3PRV分离鉴定结果3.3.1病毒核酸gE全基因序列扩增及酶切鉴定结果通过PCR扩增，电泳检测后了观察到与预期大小相一致的约1753bp的DNA片段，结果见图3-7。切取目的片段胶块，使用胶回收试剂盒回收的PCR产物后，再pMD19-T载体连接、转化，提取重组质粒经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定的pMD19-gE阳性重组质粒，结果见图3-8，将鉴定阳性质粒送至上海英潍捷基公司测序结果显示，扩增片段大小与预期相符（其中gE基因1734bp），将扩增序列命名为Guizhou-T1株gE全基因序列。40 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究M.DL2000DNAmarker；1.阳性对照；2.阴性对照；3.PCR产物M.DL2000DNAmarker;1.Positivecontrol;2.Negativecontrol;3.AmplificationproductbyPCR图3-7病毒核酸序列的PCR鉴定Fig.3-7PCRidentificationofviralnucleicacidsequenceM.DL2000DNAmarker；1.重组质粒酶切结果M.DL2000DNAmarker;1.Recombinantplasmiddigestionresults;图3-8重组质粒双酶切鉴定Fig.3-8Identificationofrecombinantplasmidsbydoubledigestion3.3.2细胞接毒分离培养结果病料接种Vero细胞后，盲传至第3代时，在接毒后24h以内产生明显CPE。传至第5代后可出现稳定的CPE，即接毒后12h可见细胞肿胀，失去光泽，少量细胞开始出现折光性增强，变圆变亮；接毒后24h，约50%的细胞出现明显的变圆变亮，部分细胞脱落，出现小的空斑；接毒后30h出现80%的CPE，大部分细胞脱落，结果见图3-9。41 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究A-1：试验组接毒0h的Vero细胞，A-2：试验组接毒12h的Vero细胞，A-3：试验组接毒24h的Vero细胞，A-4：试验组接毒30h的Vero细胞；B-1：对照组接毒0h的Vero细胞，B-2：对照组接毒12h的Vero细胞，B-3：对照组接毒24h的Vero细胞，B-4：对照组接毒30h的Vero细胞；A-1:Verocellsthatwereexposedtothevirusfor0hinthetestgroup,A-2:Verocellsthatwereexposedtothevirusfor12hinthetestgroup,A-3:Verocellsthatwereexposedtothevirusfor24hinthetestgroup,andA-4:thetestgroupwasexposedtothevirus30hofVerocells;42 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究B-1:Verocellsthatwereexposedtothevirusfor0hinthecontrolgroup,B-2:Verocellsthatwereexposedtothevirusfor12hinthecontrolgroup,B-3:Verocellsthatwereexposedtothevirusfor24hinthecontrolgroup,andB-4:thecontrolgroupwassterilized30hofVerocells;图3-9对照组和试验组接种病毒0、12、24、30hVero细胞的CPEFig.3-9ControlgroupandtestgroupwereinoculatedwithCPEofvirus0,12,24,30hVerocells3.3.3病毒的形态学观察结果在透射电镜下，可见细胞核内的病毒包涵体以及核外成熟的病毒粒子，呈圆形或椭圆形，对照组细胞未见明显病毒粒子，结果见图3-10。成熟核内包涵体由数目不等的实心和空心病毒粒子组成，呈晶格状排列，见图3-10-A，未成熟核内包涵体包括空心的病毒粒子构成，见图3-10-B。胞浆中可见释放至囊泡中的成熟病毒粒子，呈椭圆形，有囊膜，见图3-10-C。在破碎的胞浆中，成熟的病毒粒子内有各式各样的核衣壳，核衣壳外为亮晕，亮晕外为囊膜，自囊膜向外有呈放射状排列的纤突，见图3-10-D。无囊膜的病毒粒子直径为120～150nm，有囊膜的完整病毒粒子直径为150～180nm。A：呈晶格状排列的核内包涵体，箭头示实心和空心两种病毒粒子；B：未成熟的核内包涵体（空心病毒粒子）；C：释放至囊泡中的成熟病毒粒子（有囊膜）；D：破碎的胞浆中成熟的病毒粒子（有囊膜及其表面呈放射状排列的纤突）；E、F：为对照组细胞43 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究A:Latticearrangementvirioninviralinclusionbodyofcellnucleus,andmostvirionwithdiaphanouscoredomainorcompactcoredomain（arrowshowing）;B:Immatureviralinclusionbody;C:Maturevirionwithenvelopeincytoplasmvesicles;D:Maturevirionwithenvelopeandspikeinbrokencytoplasm;E,F:thecontrolgroupcells图3-10病毒粒子的形态学观察Fig.3-10Virionmorphologyobservation3.3.3易感动物感染试验试验组家兔在接种病毒后36h出现明显的瘙痒症状，用嘴和爪子抓咬注射部位，注射部位被毛脱落，皮肤潮红出血，继而出现四肢麻痹，最终角弓反张死亡；对照组家兔注射MEM维持液后无明显异常表现，结果见图3-11。图3-11动物试验结果Fig3-11animaltestresults3.3.4病毒效价测定结果按Reed-Muench法计算PRVGuizhou-T1株的半数致死量（TCID50），其TCID-10.111050为10/100µL，结果见表3-2，PFU/mL为10。与本实验室之前分离到的Guizhou-DY株（TCID-9.7150为10/100µL）（郝飞等，2013）PRVGZ-Z1株（TCID50为10-7.26/100µL）（曾智勇等，2011）相比毒力有所改变。44 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究表3-2贵州分离株Guizhou-T1株TCID50测定结果Table3-2ResultsofTCID50determinationofGuizhou-T1strainofGuizhouisolate稀释度阳性数目阴性数目阳性总数阴性总数比率阳性数百分比10-18077077/77+0100%10-28069069/69+0100%10-38061061/61+0100%10-48053053/53+0100%10-58045045/45+0100%10-68037037/37+0100%10-77129129/29+196.67%10-87122222/22+291.67%10-96215415/15+478.95%10-1044989/9+852.94%10-11265145/5+1426.31%10-12263203/3+2013.04%10-13171271/1+273.57%10-14080350/0+350.00%10-15080430/0+430.00%4讨论在所检测的1430份样品中，RT-PCR检测结果显示该规模化猪场猪瘟病原核酸阳性率为2.59%（37/1430）；其中种猪群中阳性样本数为13份，占种猪群中的2.80%（13/464）；后备猪群中阳性样本数为11份，占后备猪群中的2.33%（11/472）；保育猪群中阳性样本数为7份，占保育猪群中的3.07%（7/228）；保育猪群中阳性样本数为6份，占保育猪群中的2.26%（6/266）。对PRVgE抗体阳性样本进行PCR检测，检测结果显示猪伪狂犬病病原核酸阳性率为1.96%（28/1430）；其中种猪群中阳性样本数为7份，占种猪群中的1.51%（7/464）；后备猪群中阳性样本数为8份，占后备猪群中的1.69%（8/472）；保育猪群中阳性样本数为7份，占保育猪群中的3.07%（7/228）；保育猪群中阳性样本数为6份，占保育猪群中的2.26%（6/266）。综上，可见该规模化猪场CSFV和PRV病原核酸阳性率同在保育猪群中检出率较高，因此加强妊娠母猪的免疫及45 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究保育猪群的免疫措施极为重要，与此同时，也不可忽视种猪群、后备猪群及育肥猪群的免疫控制。在对规模化猪场进行病原检测的同时，本试验还将PRVPCR检测阳性病料，经一系列处理后接种Vero细胞，盲传至第3代时接毒后20～36h产生明显细胞病变（CPE）。盲传至第5代出现稳定的CPE，接毒后12h可见细胞肿胀，失去光泽，部分细胞开始出现变圆变亮；接毒后24h，约50%的细胞出现明显的变圆变亮，部分细胞脱落，出现小的空斑；接毒后30h大部分细胞脱落。分离毒株具有疱疹病毒共有的一般形态特征，透射电镜下可见病毒粒子呈圆形或椭圆形，细胞核内呈晶格状排列的包涵体，无囊膜，直径为120～150nm，胞浆内带囊膜的成熟病毒粒子的直径为150～180nm。成熟的病毒粒子内有各式各样的核衣壳，核衣壳外为亮晕，亮晕外为囊膜，囊膜表面有数量不等且呈放射状排列的纤突。将经蚀斑纯化后的病毒液接种家兔，试验组2只家兔在接种病毒后48h出现明显的瘙痒症状，用嘴及爪子抓咬注射部位，注射部位被毛脱落，皮肤潮红出血，继而出现四肢麻痹，最终角弓反张死亡。将分离毒株命名为PRVGuizhou-T1分离株。通过将RT-PCR鉴定为CSFV阳性样本处理后进行细胞接种、间接免疫荧光试验、电镜观察及动物试验，成功分离鉴定出一株猪瘟病毒，并命名为GZA株；文献报道江西省部分地区猪场2012～2016年间收集保存的2015份病料的CSF、PRRS和PR的病原检测结果进行了综合分析。样品来自江西省九个地区，分别为南昌、宜春、九江、上饶、抚州、赣州、景德镇、吉安、新余。调查结果表明，CSF和PRRS在江西省普遍流行，CSFV和PRSV感染率分别为54.9%和56.5%。HP-PRRSV和PRV感染率分别为33.2%和32.5%（熊加明，2017）。由此可知CSF和PR在猪场的流行非常普遍，而贵州规模化猪场CSF和PR流行状况相关文献报道较少。因此，本试验对对贵州省某规模化猪场CSF和PR病原学进行调查研究，并对PRVGuizhou-T1株和CSFVGZA株进行了病毒的分离鉴定，为贵州省CSFV和PRV的病原学流行状况提供了一定的参考依据。在后续研究中，我们将从PRVgE基因遗传变异规律和作用机理方面进行研究，为进一步预防、控制和根除猪伪狂犬病的发生和流行提供一定的参考依据。46 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究5结论（1）完成了某规模化猪场CSF和PR病原学调查；调查结果显示猪瘟病原核酸阳性率为2.59%（37/1430），猪伪狂犬病病原核酸阳性率为1.96%（28/1430）。（2）本研究成功通过对某规模化猪场PRV流行病学调查PCR检测的阳性病料处理后，采用细胞接毒分离培养、病毒蚀斑纯化、病毒的形态结构观察、易感动物接种试验和病毒效价测定分离到一株伪狂犬病病毒，命名为PRVGuizhou-T1株。（3）本研究成功通过对某规模化猪场CSFV流行病学调查经RT-PCR检测为阳性的样本处理后，采用细胞接毒技术、病毒的形态结构观察和间接免疫荧光试验等分离鉴定了一株猪瘟病毒，命名为CSFVGZA株。47 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究第四章规模化猪场PRV和CSFV分子流行病学调查研究伪狂犬病自1902年Aujeskzy在匈牙利发现以来，在欧洲、非洲、美国美及东南亚广泛流行，目前仅芬兰、挪威、加拿大等少数国家无该病报道。赵东升等对我们国家二十多个省份1998-2007近十年的样品进行检测发现，野毒阳性率最低的为5.88%，野毒阳性率最高为39.59%；表明猪伪狂犬病在我国普遍流行（赵东升等，2008）。伪狂犬病病毒基因组序列由72个阅读框组成，可编码70种蛋白，目前已发现和命gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM、gN11种糖蛋白(MulderWA,1997)。gE是目前为止发现的11种糖蛋白中最能表达野毒株的一种，是猪伪狂犬病毒中重要的毒力基因，使病毒在细胞与细胞之间扩散，对神经系统受到病毒侵染起到至关重要的作用。猪瘟最早爆发的时间没有统一定论，多数学者认为是1833年首次报道于美国俄亥俄州，但也有少数学者认为首次爆发是更早的1810年田纳西州、1822年法国、1833年德国等地。王赛赛等对我国十几个省市猪瘟病毒检测结果显示，野毒阳性率为13.3%（王赛赛等，2012）。CSFV基因组5′端无帽子结构，且3′也无(PolyA)尾巴。包含一个很大的开放性阅读框(ORF)，其编码4个结构蛋白和7个非结构蛋白。E2蛋白是CSFV最主要的抗原蛋白，位于CSFV多聚蛋白的氨基酸残基的690～1060位，大小约为370个氨基酸。本试验通过对贵州省某规模化猪场实施净化方案前所采集的样品进行猪瘟和猪伪狂犬病的血清学和病原学检测，并对PCR/RT-PCR阳性样品的CSFVE2和PRVgE基因进行克隆、测序及分析，旨在了解和研究PRV和CSFV贵州流行株的分子流行状况及变异特征，为PRV和CSFV的深入防控和净化的提供参考。1材料1.1样本来源样本来源于病原学检测CSFV和PRV阳性样本，由于所检测样品均来源于规模化猪场，因此选取4个PRV阳性样品，2个CSFV阳性样品用于分子流行病学的调查研究。48 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究1.2主要试剂TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNA＆RNAExtractionKitVer.5.0，pMD-18T/19T，均购自大连宝生物工程有限公司；Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒、Sanprep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，购自OMEGA有限公司；琼脂糖，为Biowest公司产品；GoldView，为Hyclone公司产品；分子量标准物DNAMarkerDL1000/2000，购自大连宝生物公司；E.Z.N.A.TMGelExtractionKit(50)胶回收试剂盒购自于OMEGA公司；异丙醇、无水乙醇等其他相关试剂均来自为国产分析纯试剂。1.3主要溶液的配制1.3.1LB液体培养基胰蛋白胨10.0g酵母提取粉5.0gNaOH0.01～0.1g溶解后，加水定容至1L，分装高压备用。1.3.21%琼脂糖凝胶电泳液琼脂糖3g1×TAE300mL加热溶解，冷却至60℃左右。Goldview15μL搅动均匀，避免产生气泡。1.4主要实验仪器梯度PCR扩增仪，购自美国BIO-RAD有限公司；ThermoForma-80℃超低温冰箱，购自美国BIO-RAD有限公司；GelDOCXR凝胶成像系统，购自美国BIO-RAD有限公司；49 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究可调微量移液器，Gilson公司产品；高速冷冻离心机，Heraens有限公司；生物安全柜(BSC-1300Ⅱ型)，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；旋涡震荡仪，购自北京金北德工贸有限公司；电泳仪、制胶板、梳子、电泳槽等，购自北京市六一仪器厂；全封闭精密电子数显天平，购自西特传感技术（天津）有限公司。2方法2.1引物设计与合成根据GenBank中已发表的PRV基因序列，设计1对特异性引物（P1、P2），扩增PRVgE全基因序列，预计扩增片段为1753bp，引物序列（斜体表示限制性内切酶酶切位点）为：P1：CGGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGC，P2：CGGAATTCTTAAGCGGGGCGGGACATCA。该引物由TaKaRa公司合成。根据GenBank中猪瘟病毒shimen株和C株序列，设计一对特异性引物，预扩增片段长1137bp，PAGE级，OD值为2.0，由上海英捷测序公司合成，其序列如下：PrimerP1：5′-CGGGATCCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC-3′，PrimerP2：5′-CCCAAGCTTGACCAGCGGCGAGTTGTTCTGTTAG-3′。其中包含上游引物含BamHI酶切位点，下游引物含HindIII酶切位点。2.2病毒核酸的提取将所采集的扁桃体样本分别用匀浆器研磨后，尽量将最终匀浆液的量控制在300µL～500µL之间，收集于EP管中；反复冻融3次后12000rpm离心10min，取上清按照TaKaRa公司核酸提取试剂盒说明书的相关操作步骤进行核酸的提取，进行提取病毒的核酸，并于-80℃保存备用。2.3猪伪狂犬病病毒gE基因PCR检测通过对mPCR检测PRV野毒感染阳性样品再进行PRVgE全基因的检测PCR体系如下，扩增程序为：94℃5min；94℃2min，55℃1min，72℃2min，50 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究35个循环；72℃10min。反应结束后，取5µLPCR产物于1%的1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测，用凝胶成像系统拍照记录PRVgE（全）基因扩增体系：ddH2O5.25µL2×GCBufferⅠ/Ⅱ12.5µLdNTP4.0µL上下游引物各1.0µLDNA模板1.0µLLATaq酶0.25µL总体积25.0µL2.4猪瘟病毒E2基因RT-PCR检测将所有处理好的扁桃体样本按照OneStepRT-PCRKit2.0使用说明，将检测出的CSFV野毒感染阳性样品使用E2基因特异性引物进行猪瘟病毒E2基因扩增。RT-PCR扩增反应体系如下，反应程序：50℃40min；94℃5min；94℃30s，55.0℃30s，72℃30s，35个循环数；72℃10min。反应结束后取5µLPCR产物于1%的1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测（90V，35min），凝胶成像系统拍照记录。CSFVE2（全）基因扩增体系：ddH2O7.5µL2×1stepBuffer12.5µL上下游引物各1.0µL模板2.0µLOnestepenzymemix1.0µL总体积25.0µL51 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究2.5目的基因克隆、测序与分析将PRVgE全基因PCR产物和CSFVE2全基因RT-PCR产物用胶回收试剂盒回收后连接于pMD19-T载体，转化入Top10感受态细胞，筛选阳性菌落，提取重组质粒进行酶切及质粒PCR鉴定，将鉴定为阳性的重组质粒送上海Invitrogen公司进行序列测定。利用软件DNAStar中MegAlign模块进行分子生物学分析，将PRV的gE基因序列和CSFVE2基因序列与参考GenBank中己发表的相关毒株的gE及E2基因序列进行分析。连接体系：pMD-19T0.5µL目的DNA4.5µLSoulationI5.0µL双酶切体系：ddH2O15.5µL质粒DNA5.0µL10xKBuffer2.5µLRestrictionenzyme11.0µLRestrictionenzyme21.0µL3结果3.1PRVgE基因PCR检测结果通过PCR扩增，电泳检测后了得到4株与预期大小相一致的约1753bp的DNA片段，结果见图4-1。切取目的片段胶块，使用胶回收试剂盒回收的PCR产物后，再pMD19-T载体连接、转化，提取重组质粒经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定，将鉴定阳性质粒送至上海英潍捷基公司测序结果显示，扩增片段大小与预期相符（其中gE基因1734bp），将扩增序列分别命名为Guizhou-T1株、Guizhou-T2株、Guizhou-T3株和Guizhou-T4株gE全基因序列。52 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究M.DL2000DNAmarker；1.Guizhou-T1株；2.Guizhou-T2株；3.Guizhou-T3株；4.Guizhou-T4株M.DL2000DNAmarker;1.Guizhou-T1strain;2.Guizhou-T2strain;3.Guizhou-T3strain;4.Guizhou-T4strain图4-1病毒核酸序列的PCR鉴定Fig.4-1PCRidentificationofviralnucleicacidsequence3.2PRVgE基因序列分析结果将测序得到的获得的4株猪伪狂犬病病毒的gE序列分别命名为Guizhou-T1、Guizhou-T2、Guizhou-T3及Guizhou-T4，并与参考毒株的gE基因序列进行核苷酸同源性分析，结果表明，本次检测毒株之间同源性最高为99.9%，最低为99.6%；T1、T2及T3株分别与参考毒株中的山东分离株（KU056477.1）、江苏分离株AH02LA（KR605322）、吉林分离株DL14_08（KU360259.1）、湖南分离株GA（KP259837）、黑龙江分离株HLJ8（KT824771.1）、河北分离株HB-HD（KC415027）、河北分离株HNB1（KM189914.3）、河南分离株HN1201（KP722022.1）、上海分离株JS-2012（KP257591.1）、湖北分离株HXN（KM189912.1）及江西分离株JX-2015（KY765508）同源性最高同为99.8%；而T4株则与参考毒株中的山东分离株（KU056477.1）、江苏分离株AH02LA（KR605322）、湖南分离株GA（KP259837）、河北分离株HNB1（KM189914.3）、河南分离株HN1201（KP722022.1）、上海分离株JS-2012（KP257591.1）及湖北分离株HXN（KM189912.1）同源性最高同为100.0%；本次检测毒株分别与NS374株（FJ605135）同源性最低依次为97.2%、97.1%、97.0%、97.1%。53 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究进一步对检测得到的序列进行氨基酸的比对，发现本次检测所得到的PRVgE基因序列在gE48位和gE496位分别有一个天冬氨酸的插入；且与之在核苷酸和氨基酸同源性最高的HB-HD株在相同位置也有相同氨基酸的插入，结果见图4-2。图4-24株PRV序列核苷酸比对结果Fig.4-2Nucleotidealignmentof4PRVsequences由于本次分离株间同源性较高，因此挑选Guizhou-T1株与贵州此前所分离的Guizhou-DY株和GZ-Z1株进行gE基因氨基酸序列对比分析，结果显见表4-1：Guizhou-T1株与Guizhou-DY株氨基酸同源性为98.3%，与GZ-Z1株氨基酸同源性为95.3%。贵州3株不同时期猪伪狂犬病毒分离株共存在31个氨基酸位点的变异，根据分离毒株时间先后顺序进行对比，其中Guizhou-DY株与GZ-Z1株之间存在28个氨基酸变异位点，Guizhou-T1株与Guizhou-DY株之间存在8个氨基酸位点的变异，Guizhou-T1株与GZ-Z1株之间存在26个氨基酸位点差异；贵州分离的3株猪伪狂犬病毒根据分离时间先后，其毒力不断增强，推测与变异氨基酸位点有关。54 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究表4-1贵州分离株变异位点对比表Table4-1ComparisonofmutationsinGuizhouisolates位点Guizhou-DYGuizhou-T1GZ-Z1gE19苯丙氨酸PheF亮氨酸LeuL亮氨酸LeuLgE48天冬氨酸AspDgE54天冬氨酸AspD天冬氨酸AspD甘氨酸GlyGgE59天冬酰胺AsnN天冬酰胺AsnN天冬氨酸AspDgE63天冬氨酸AspD天冬氨酸AspD天冬酰胺AsnNgE69丙氨酸GlaA丙氨酸GlaA苏氨酸ThrTgE106亮氨酸LeuL亮氨酸LeuL缬氨酸ValVgE122丝氨酸GerS丝氨酸GerS丙氨酸GlaAgE149甲硫氨酸MetM甲硫氨酸MetM精氨酸ArgRgE179丝氨酸GerS丝氨酸GerS苏氨酸ThrTgE181亮氨酸LeuL亮氨酸LeuL谷酰胺GlnQgE200谷酰胺GlnQ精氨酸ArgR精氨酸ArgRgE215丙氨酸GlaA丙氨酸GlaA亮氨酸LeuLgE216天冬氨酸AspD天冬氨酸AspD丙氨酸GlaAgE217亮氨酸LeuL脯氨酸ProP脯氨酸ProPgE300丙氨酸GlaA丙氨酸GlaA苏氨酸ThrTgE441甲硫氨酸MetM苏氨酸ThrT苏氨酸ThrTgE447丙氨酸GlaA丙氨酸GlaA甘氨酸GlyGgE448缬氨酸ValV异亮氨酸IleI缬氨酸ValVgE471精氨酸ArgR精氨酸ArgR甘氨酸GlyGgE473组氨酸HisH组氨酸HisH精氨酸ArgRgE488酪氨酸TyrY酪氨酸TyrYgE492甘氨酸GlyG天冬氨酸AspD天冬氨酸AspDgE496天冬氨酸AspDgE501缬氨酸ValV缬氨酸ValV天冬氨酸AspDgE502异亮氨酸IleI异亮氨酸IleI丙氨酸GlaAgE507丙氨酸GlaA丙氨酸GlaA丝氨酸GerSgE520丙氨酸GlaA丙氨酸GlaA缬氨酸ValVgE524脯氨酸ProP脯氨酸ProP丙氨酸GlaAgE539精氨酸ArgR精氨酸ArgR半胱氨酸CysCgE571天冬酰胺AsnN天冬酰胺AsnN丝氨酸GerS3.3PRVgE基因遗传进化树分析结果应用软件MEGA6.0对猪伪狂犬病病毒贵州分离株的gE基因序列进行遗传进化树分析，结果表明：本次检测的4株猪伪狂犬病病毒在遗传进化树上呈现相55 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究对较大的独立分支中（框A），且在框内所有毒株在gE48位和gE496位均有1个天冬氨酸的插入，结果见图4-3。A图4-3Guizhou-T1～T4株gE基因核苷酸系统进化树Fig.4-3PhylogenetictreeofgEgeneinGuizhou-T1～T4strain3.4CSFVE2基因RT-PCR检测结果通过RT-PCR扩增，电泳检测后了得到4株与预期大小相一致的约1137bp的DNA片段，结果见图4-4。切取目的片段胶块，使用胶回收试剂盒回收的PCR产物后，再pMD19-T载体连接、转化，提取重组质粒经双酶切鉴定，将鉴定阳性质粒送至上海英潍捷基公司测序结果显示，扩增片段大小与预期相符（其中gE基因1137bp），将扩增序列分别命名为GZA株和GZB株E2全基因序列。56 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究M.DL5000DNAmarker；1.GZA株；2.GZB株M.DL5000DNAmarker;1.GZAstrain;2.GZBstrain图4-4病毒核酸序列的RT-PCR鉴定Fig.4-4RT-PCRidentificationofviralnucleicacidsequence3.5猪瘟病毒E2基因序列分析结果利用软件DNAStar中MegAlign模块将已获得的猪瘟病毒贵州分离株（GZA株和GZB株）E2基因序列与参考毒株的E2基因序列进行核苷酸同源性分析，结果见图4-5，贵州分离株CSFV-GZA株与中国标准强毒株Shimen-HVRI、法国标准强毒株Alfort187、日本标准强毒株ALD株和意大利标准强毒株Brescia株同源性分别为84.3%、84.0%、83.9%和84.0%；与德国疫苗毒株Reims株、中国猪瘟兔化弱毒疫苗株C-Strain株和非洲疫苗株RUCSFPLUM株同源性分别为83.0%、83.0%和83.4%；与我国分离株CF114株、C-ZJ-2008株和CSFV-GZ-2009株同源性为84.4%、82.8%和84.4%。贵州分离株CSFV-GZB株与中国标准强毒株Shimen-HVRI、法国标准强毒株Alfort187、日本标准强毒株ALD株和意大利标准强毒株Brescia株同源性分别为84.0%、84.1%、84.0%和84.5%；与德国疫苗毒株Reims株、中国猪瘟兔化弱毒疫苗株C-Strain株和非洲疫苗株RUCSFPLUM株同源性分别为82.9%、82.9%和83.8%；与我国分离株CF114株、C-ZJ-2008株和CSFV-GZ-2009株同源性为84.1%、82.7%和84.1%。57 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究GZAGZAGZBBrescia意大利AF091661CF114中国AF333000Reims株德国AY259122RUCSFPLUM非洲AY578688Shimen-HVRI中国AY775178ALD株日本D49532C-ZJ-2008中国HM175885CSFV-GZ-2009中国HQ380231Alfort187法国X87939C-strain中国Z46258图4-5GZA株和GZB株E2基因核苷酸比对图Fig.4-5PhylogenetictreeofE2geneinGZAandGZBstrain应用软件DNAStar中MegAlign模块将已获得的猪瘟病毒贵州分离株（CSFV-GZA株）E2基因序列与参考毒株的E2基因序列进行氨基酸同源性分析，结果表明，贵州分离株CSFV-GZA株与中国标准强毒株Shimen-HVRI、法国标准强毒株Alfort187、日本标准强毒株ALD株和意大利标准强毒株Brescia株同源性分别为90.6%、89.8%、89.5%和89.0%；与德国疫苗毒株Reims株、中国猪瘟兔化弱毒疫苗株C-Strain株和非洲疫苗株RUCSFPLUM株同源性分别为89.0%、89.0%和88.7%；与我国分离株CF114株、C-ZJ-2008株和CSFV-GZ-2009株同源性为90.1%、89.0%和90.6%。贵州分离株CSFV-GZB株与中国标准强毒株Shimen-HVRI、法国标准强毒株Alfort187、日本标准强毒株ALD株和意大利标准强毒株Brescia株同源性分别为90.3%、89.9%、89.6%和89.5%；与德国疫苗毒株Reims株、中国猪瘟兔化弱毒疫苗株C-Strain株和非洲疫苗株RUCSFPLUM株同源性分别为88.8%、88.7%和89.7%；与我国分离株CF114株、C-ZJ-2008株和CSFV-GZ-2009株同源性为90.0%、88.7%和90.1%。进一步对氨基酸变异位点进行分析显示，将GZA株E2基因序列与我国标准强毒株Shimen株、中国猪瘟兔化弱毒疫苗株C株和HCLV株之间一共存在46个氨基酸变异位点，其中Shimen株与C株和HCLV株均有26个氨基酸位点相同；GZA株与Shimen株有12个氨基酸位点相同，与C株和HCLV株均有5个58 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究氨基酸位点相同；疫苗株C株和HCLV株之间仅存在2个氨基酸位点的差异。在46个氨基酸变异位点中GZA株独立变异位点存在29个，结果见表4-2。表4-2GZA株氨基酸变异位点比对结果Table4-2GZAstrainaminoacidsitealignment氨基酸位点GZA株Shimen株C株HCLV株氨基酸位点GZA株Shimen株C株HCLV株701Lle，ILeu，LLle，ILle，I854Val，VMet，MMet，MMet，M705Asn，NAsn，NAsp，DAsp，D860Lle，IThr，TThr，TThr，T709Pro，PLeu，LLeu，LLeu，L863Lys，KAsn，NAsn，NAsn，N713Glu，EGly，GGly，GGly，G871Trp，WLeu，LLeu，LLeu，L720Arg，RGlu，ELys，KLys，K881Asn，NGlu，EGlu，EGlu，E723Ser，SSer，SAsn，NAsn，N884Thr，TVal，VVal，VVal，V725Gly，GAsp，DAsp，DAsp，D886Met，MThr，TThr，TThr，T729Asp，DAsn，NAsn，NAsn，N889Gln，QGln，QLeu，LVal，V734Arg，RLys，KLys，KLys，K894Lys，KLys，KArg，RArg，R736Thr，TThr，TSer，SSer，S901Lys，KAsn，NAsp，DAsp，D738Thr，TVal，VVal，VVal，V902Glu，EGlu，EGly，GGly，G745Lle，IThr，TThr，TThr，T924Val，VLle，ILle，ILle，I761Arg，RGly，GLys，KLys，K939Thr，TAla，AThr，TThr，T764Pro，PLeu，LPro，PPro，P942Glu，ESer，SSer，SSer，S777Ser，SAsn，NAsn，NAsn，N957Leu，LSer，SSer，SSer，S779Ala，ASer，SSer，SSer，S959Gly，GGlu，EGlu，EGlu，E780Lle，IThr，TThr，TThr，T979Arg，RArg，RLys，KMet，M788Gly，GGly，GArg，RArg，R988Thr，TAla，AThr，TThr，T789Phe，FPhe，FSer，SSer，S994Lys，KLys，KArg，RArg，R797Thr，TSer，SSer，SSer，S1020Ala，AVal，VAla，AAla，A845Lys，KArg，RArg，RArg，R1023His，HArg，RArg，RArg，R847Glu，EGlu，EAsp，DAsp，D1025Lle，ISer，SSer，SSer，S848Arg，RLys，KLys，KLys，K1053Lle，ILle，IVal，VVal，V59 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究3.6猪瘟病毒E2基因遗传进化树分析结果应用软件DNAStar中MegAlign模块对猪瘟病毒贵州分离株（CSFV-GZA株及GZB株）的E2基因核苷酸序列与参考毒株序列进行序列发生树分析，猪瘟病毒贵州分离株（CSFV-GZA株和GZB株）E2基因与国内外流行毒株关系较远，表明该病毒发生了某些位点变异，结果见图4-6。Reims株德国AY259122Reims株德国AY259122C-strain中国Z46258E-ZJ-2008中国HM175885ALD株日本D49532Alfort187法国X87939CF114中国AF333000Shimen-HVRI中国AY775178CSFV-GZ-2009中国HQ380231Brescia意大利AF091661RUCSFPLUM非洲AY578688图4-6GZA株和GZB株E2基因核苷酸系统进化树Fig.4-6PhylogenetictreeofE2geneinGZAandGZBstrain4讨论而本次检测得到的贵州规模化猪场PRV流行株Guizhou-T1株、Guizhou-T2株、Guizhou-T3株及Guizhou-T4株，株间核苷酸及氨基酸同源性都较高，与参考毒株同源性均在97.0%～99.8%；氨基酸比对结果显示均在gE48位和gE496位均有天冬氨酸（AspD）的插入，在gE488位缺失酪氨酸（TyrY），且与2012年以来国内不同省份分离的PRV变异株gE基因氨基酸序列在gE448位由V→I的变异位点一致。目前，PRV变异株已成为我国主要流行的病毒株，2013年彭金美等（2013）从5个省14个猪场的病料中扩增的gE基因高度同源，并与以往公布的相关序列进行比对，结果显示这些分离株均属于一个相对独立的分支。而赵鸿远等（2014）研究发现，变异株均在gE48和gE496位各存在1个天冬氨酸（AspD）的插入，该插入突变可以作为鉴定PRV变异株的分子特征。张青占（2013）对江苏某伪狂犬病疫苗免疫猪场中发病仔猪的脑组织样品进行检测，60 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究分离得到一株PRV，命名JS-2012，对其分析后发现，与经典毒株相比，在两个部位存在3个连续的碱基的插入，氨基酸序列增加了2个天冬氨酸。YuXiu-ling等（2014）也发现于北京、山东及河北分离的PRV株在这两个位点附近也各存在1个氨基酸的插入。钟承等（2014）研究发现北京BJ/YT株和HB/HD、HB/LF、HB/HS、HB/BD株在448位均出现了一致的突变，即V448→I。而此前贵州分离毒株GZ-Z1株和Guizhou-DY株的gE48和gE496位均没有天冬氨酸（AspD）的插入，由此可知，自2012年以后PRV变异毒株在gE48位插入天冬氨酸（AspD）相对较稳定，而在gE496位的插入呈现不稳定状态，且可在该位置前后进行游走。综上所述：说明目前贵州所流行的毒株为变异毒株。推测由于近年来贵州省养猪业的快速发展，跨区引种导致猪群流动性增加导致。本试验通过对猪场流行病学调查过程中经RT-PCR鉴定为CSFV阳性样本中分离出的毒株（命名为CSFVGZA株和GZB株）为研究对象，并选择了E2全基因作为猪瘟病毒贵州分离株序列分析与遗传变异的目的基因。通过CSFV-GZA株和GZB株的E2全基因与我国标准强毒株Shimen-HVRI、法国标准强毒株Alfort187、日本标准强毒株ALD株、意大利标准强毒株Brescia株、德国疫苗毒株Reims株、我国的猪瘟兔化弱毒疫苗株C-Strain株、非洲疫苗株RUCSFPLUM株、我国分离株CF114株、C-ZJ-2008株和CSFV-GZ-2009株等10株进行核苷酸同源性分析。核苷酸同源性分析表明，CSFV-GZA株与我国分离株CF114株和CSFV-GZ-2009株同源性最高同为84.4%，与三株疫苗株的同源性最低；CSFV-GZB株与意大利标准强毒株Brescia株同源性最高同为84.5%，与三株疫苗株的同源性最低；氨基酸同源性表明，CSFV-GZA株与我国标准强毒株Shimen-HVRI和我国分离株CSFV-GZ-2009同源性最高为90.6%，与三株疫苗株同源性最低平均为88.9%。研究通过分子生物技术获得猪瘟病毒贵州分离毒株E2基因，应用分子克隆技术和生物信息学技术分析了贵州省猪瘟病毒分离毒株与国内外毒株之间的关系。试验结果表明，猪瘟病毒贵州流行株与国内外毒株E2基因的核酸同源性差异较大。以上相关研究，对后期规模化猪场开展猪瘟和猪伪狂犬病的净化提供就很重要的本底调查数据。本研究对伪狂犬病病毒和猪瘟病毒贵州规模化猪场流行株进行了分子流行病学的调查研究，在后续研究中，我们将从PRV和CSFV基因遗61 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究传变异规律、作用机理方面及疫苗防控方面进行研究，为进一步预防、控制和根除猪伪狂犬病的发生和流行提供一定的参考依据。5结论（1）完成了某规模化猪场PRV流行株的分子流行情况调查，流行株株间核苷酸同源性在99.6%～99.9%，氨基酸同源性为99.1%～99.8%，遗传进化树分析得出检测毒株处于相对独立一支中。根据氨基酸分析结果结合遗传进化结果判定该流行株属变异毒株。（2）完成了某规模化猪场CSFV流行株分子流行情况调查，猪瘟流行株GZA株和GZB株E2基因与参考猪瘟病毒E2基因的核苷酸同源性为82.8%～83.4%，氨基酸同源性为88.7%～90.6%，经遗传进化树分析得出贵州流行株E2基因与参考毒株之间差异较大。62 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究第五章规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病净化效果研究猪瘟（Classicalswinefever，CSF）是由猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）引起的一种以高热、出血和高死亡率为主要特征的接触性传染病，是危害全球养猪业的重要传染病之一（MoenningVetal，2000）。CSFV为单股正链RNA病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）成员（CowanLetal，2015）。该病被世界动物卫生组织（OIE）列为须上报的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病（陈溥言，2006）。伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）引起的多种动物共患急性传染病，2周龄以内的哺乳仔猪发病后出现明显的神经症状；成年猪常表现为隐性感染；妊娠母猪感染后出现流产、产木乃伊胎、产死胎、弱仔及呼吸系统症状；公猪感染后主要表现为睾丸鞘膜炎，不能爬胯，种用性能降低或丧失（郝飞等，2013）。该病属于典型且极难防疫的动物疫病，且易与其他疫病混合感染给猪养殖业带来了巨大的危害，也被OIE列为必须上报的动物疫病，我国农业部门也将其规定为二类动物疫病。重要动物疫病的净化是保障规模化养殖场生物安全的重要措施之一，为了在2020年前实现《国家中长期动物疫病防治规划》（2012-2020）中提出的对全国规模化养殖场实现5种猪病毒病的净化目标。因此，如何让规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病净化工作按期实现净化目标，是兽医、科研人员和种猪场经营管理人员共同面临的艰巨任务。本文运用已建立的CSFVRT-PCR检测技术（(GB/T16551-2008)）、PRVgE/gB-ELISA检测方法（GB/T18641-2002）和本实验室已建立的鉴别猪瘟和猪伪狂犬病野毒和疫苗毒mPCR方法，对已建立的贵州省规模化猪场猪瘟与猪伪狂犬病净化方案的应用效果进行研究。1材料1.1样品来源样品来源于贵州省实施猪瘟和猪伪狂犬病净化方案的某规模化猪场，分463 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究个不同时间段免疫采集的共1776份全血和扁桃体样品。该规模化猪场总存栏量5000余头，种猪群和后备猪群全群采样，保育猪群和育肥猪群则5%比例进行抽样采集；养殖模式为自繁自养，生产饲养管理完全按照国家标准及养殖场标准进行。全血的采集方式：包括耳缘静脉和前腔静脉采血2种；扁桃体的采集：使用专用扁桃体采集器（购自四川成都德麟科技有限公司），首先使用开口器进行开口，将扁桃体采样器枪口轻放于扁桃体对应位置上，快速扣动扳机钩取一粒扁桃体于有生理盐水的离心管中，冷藏送检。1.2主要试剂GoldView，购自Hyclone公司产品；琼脂糖，购自Biowest公司产品；分子量标准物DNAMarkerDL1000/2000，购自于大连宝生物公司；TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNA＆RNAExtractionKitVer.5.0，购自于大连宝生物工程有限公司；猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒、猪伪狂犬病病毒gB/gE抗体ELISA检测试剂盒，购自武汉科前生物科技公司；PCR上、下游引物，由上海英潍捷基公司合成；异丙醇、无水乙醇等其他相关试剂均来自为国产分析纯试剂。1.3主要溶液的配制1.3.150×TAE冰醋酸57.1mLTris242g0.5MEDTA（PH=8.0）100mL加蒸馏水至1000mL，高压灭菌15min。1.3.21%琼脂糖凝胶电泳液琼脂糖3g1×TAE300mL64 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究加热溶解，冷却至60℃左右。Goldview15μL搅动均匀，避免产生气泡。1.4主要实验仪器梯度PCR扩增仪，购自美国BIO-RAD有限公司；IcyclerThermalcycler型PCR仪，购自美国BIO-RAD有限公司；GelDOCXR凝胶成像系统，购自美国BIO-RAD有限公司；HZS-H水浴振荡器，购自哈尔滨市东明医疗仪器厂；MVS-1旋涡混合器，购自北京金北德工贸有限公司；DYY-7C型电泳仪和电泳槽，购自北京市六一仪器厂；精密电子天平（ES-A型），购自西特传感技术（天津）有限公司；生物安全柜（BSC-1300Ⅱ型），购自上海博迅实业有限公司；数显鼓风干燥箱，购自上海博迅实业有限公司；恒温培养箱（HH·CP-01W），购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；酶标仪（GF-M3000），购自山东高密彩虹分析仪器有限公司。2方法2.1猪瘟和猪伪狂犬病的净化监测技术本次净化监测技术按照已建立的规模化猪场猪瘟和伪狂犬病的净化方案[7]中提出的检测→淘汰→分群→免疫→淘汰的循环式、多阶段、分层次的净化路线执行，猪瘟和猪伪狂犬病净化技术路线，见图5-1：65 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究种猪场生物安全体系的建立疫苗免疫21d后测CSFV和PRV抗体水平采集扁桃体EEBB-g-g-g-gVVVVVVFF严控监科RPRPRPRPSCSC格制测学处理样本的猪自的抗抗卫场繁管抗抗抗抗体体生内自理体体体体阳阴消带养制阳阴阳阴性性毒毒、度性性性性制生全度物进CSFVRT-PCR全出合格补免CSFVPRVmPCR野毒感染不合格PRV野毒感染淘汰图5-1规模化猪场猪瘟和伪狂犬病的净化技术路线Fig.5-1Large-scalepigfarmCSFandPReradicationtechnologyroute猪瘟的净化监测技术（李达等，2017）：在已建立的CSFVRT-PCR检测技术（(GB/T16551-2008)）本试验建立了鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的单一与二重RT-PCR检测方法的成功建立为猪瘟净化过程中的检测、筛选和淘汰提供了技术保障，也为早期淘汰野毒阳性感染猪群而建立阴性净化猪群提供技术支撑。猪伪狂犬病的净化监测技术：采用伪狂犬病gE/gB-ELISA方法监测（GB/T18641-2002）区别猪群PRV野毒和疫苗毒感染及评价疫苗免疫效果，其中gE抗体ELISA监测PR野毒感染，gB抗体ELISA监测疫苗免疫保护情况，根据gB-ELISA抗体检测为阴性说明不受保护，对初次免疫后gB为阴性的猪群进行补免，3周后进行gB抗体ELISA检测，仍为阴性的提示为免疫耐受，应直接淘汰。同时利用本实验室建立的多重PCR方法从流产死胎、发病猪组织样品、拭子样品和PRV-gEELISA检测为阳性品进行病原学检测以区分PR野毒与疫苗毒感染，该方法可以对病毒血症猪群进行辅助诊断开展净化工作。净化标准：无猪伪狂犬病和猪瘟发病临床病例，免疫抗体阳性率达95%以上，连续2年猪场猪伪狂犬病野毒抗体5%抽样检测和猪场95%自检没有病原核酸检66 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究出后，对种猪群全进行血清学和病原学检测，均没有检出猪的伪狂犬病野毒感染，视为达到净化标准。采用上述净化措施，通过从种猪场、生猪人工授精站源头抓起，利用实验室ELISA和PCR检测技术，淘汰带毒种猪，切断病原体流行的恶性循环锁链，如通过以基因缺失疫苗全面免疫并配合血清学检测淘汰野毒抗体阳性猪的方法，首先将生产公猪群、生产母猪群中检测为野毒抗体阳性的猪逐步淘汰，使其达到净化标准，在后备猪群混群时严格进行血检，逐步形成良性循环的更新淘汰机制，最终将生产种公母猪净化为阴性猪群。同时，利用安全、高效、优质的疫苗，提高群体免疫水平和确保免疫效果，逐步培育出健康的种猪群和后备种猪群。最后，加大改善生态环境及消毒管理力度，最终实现猪瘟和伪狂犬病的净化目标。2.2猪瘟及猪伪狂犬病的免疫程序及监测2.2.1监测步骤（1）本底调查阶段：首先对实施净化方案前规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病的流行、分布感染状况进行初步的了解；为后期净化方案的实施提供数据支撑。（2）免疫控制阶段：对规模化猪场中的净化猪群按净化方案中的免疫程序进行严格的免疫接种；并保证种猪群、后备猪群及育肥猪群等猪群免疫抗体合格率达到70%以上。（3）免疫净化阶段：通过免疫控制阶段监测淘汰后，必须保证种猪群、后备猪群及待售种猪群免疫抗体合格率达到90%以上，病原学阴性，且无临床病例。（4）净化维持阶段：种猪群、后备猪群及待售种猪群免疫抗体合格率达到90%以上，病原学监测阴性，猪场连续无临床病例(可设哨兵动物)。2.2.2免疫程序猪瘟免疫选用优质猪瘟兔化弱毒疫苗（猪瘟脾淋苗和细胞苗），猪伪狂犬病免疫使用基因缺失疫苗包括：Bartha-K61株（gE/gI双基因缺失疫苗株）、SA215株（gE/gI/TK三基因缺失疫苗株）、HB-98株（gE-/gG-/TK-）或鄂A株（TK-/gE-/gI-），进行免疫及监测程序，见表2-1。67 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究表5-1猪瘟和猪伪狂犬病的免疫程序Table5-1ImmunizationproceduresforCSFandPR免疫监测监测方法猪种次数份量淘汰标准注意事项项目数量抗体抗原种公猪≥2次/年2～4头份种母猪≥2次/年2～4头份全群后备猪≥2次/年2～4头份CSFV猪瘟2次免疫后猪严哺乳前1次1头份RT-PCR猪瘟病毒瘟抗体仍阴重或实时（弱28日龄1次2头份ELISA性者淘汰；在免疫后猪污荧光毒苗）60日龄1次4头份抗体RT-PCR检测群整体抗体仔染5%检测PCR检合格率>阳性者淘汰。猪一抽样测90%视为免28日龄1次2头份般疫合格，不合污60日龄1次4头份格者可加强染免疫1次，28场种公猪3次/年2头份猪伪狂2次免疫后Pd后检测抗体猪伪RV-gB抗体仍不合格者犬病毒狂犬种母猪3次/年2头份仍阴性者淘淘汰。全群gB/gE-PRV多病（基汰；PRV-gE170日龄1次1头份重PCR因缺后备猪ELISA抗体阳性者失疫配种前1次2头份检测经多重PCR抗体检苗）5%检测野毒阳仔猪56日龄1次1头份测抽样性者淘汰。2.3病毒抗体ELISA检测同本文第二章方法。2.4病毒核酸的RT-PCR/PCR扩增将所有处理好的扁桃体样本按照OneStepRT-PCRKit2.0使用说明，用鉴别CSFV和PRV野毒和疫苗毒引物进行PCR扩增检测，mPCR体系如下，扩增程序为：94℃5min；94℃30s，58.3℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。反应结束后取5µLPCR产物于1%的1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测（90V，35min），凝胶成像系统拍照记录。鉴别猪瘟和猪伪狂犬病野毒和疫苗毒mPCR扩增体系：ddH2O8.0µL2×1stepBuffer25.0µLCSFV野毒、疫苗毒上下游引物各1.5µLPRVgE、gB、TK引物各1.0µL模板4.0µL68 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究Onestepenzymemix1.0µL总体积50.0µL3结果在对该猪场1776份不同阶段猪群样品进行监测中发现，利用已建立净化方案在该规模化猪场中取得了较好的效果，结果见表5-2：2016年3月所检测PRVgB抗体蛋白阳性率从83.98%（367/437）上升到2017年4月的98.17%（429/437）；2016年3月所检测PRVgE抗体阳性率从5.72%（25/437）下降到2017年4月的0.23%（1/437）；2016年3月所检测猪伪狂犬病病原阳性率从2.75%（12/437）下降到2017年4月的0%（0/437）；2016年3月所检测猪瘟抗体阳性率从85.81%（375/437）上升到2017年4月的98.63%（431/437）；2016年3月所检测猪瘟病原阳性率从2.06%（9/437）下降到2017年4月的0%（0/437）。其中2016年3月检测样本为未实施净化方案前本底调查结果。表5-2不同时期种猪场不同阶段猪种PR和CSF抗体和病原阳性率Table5-2ThepositiveratesofPRandCSFantibodiesandantigensinpigbreedsatdifferentstagesindifferentperiodsPR与CSF抗体检测PR与CSF病原阳性率样本猪种采样时间PRV-gB抗PRV-gE抗CSF抗体PR病原阳性CSF病原阳数量体合格率体阳性率合格率率性率2016.314785.71%5.44%89.80%2.04%2.72%2016.816091.25%3.12%92.50%0.62%1.25%种猪2016.1215793.12%1.91%96.82%0.00%0.64%2017.415598.70%0.00%98.06%0.00%0.00%2016.313083.08%5.38%84.62%2.31%1.27%后备2016.814891.89%3.38%93.24%0.68%0.68%猪2016.1215295.39%2.63%98.68%0.66%0.00%2017.414498.61%0.69%100.00%0.00%0.00%2016.36085.00%8.33%83.33%5.00%3.33%保育2016.88291.46%4.88%90.24%2.44%1.22%猪2016.126693.94%3.03%93.94%0.00%0.00%2017.47097.14%0.00%98.57%0.00%0.00%2016.310082.00%5.00%83.00%3.00%1.00%育肥2016.88491.67%3.57%91.67%1.19%0.00%猪2016.125394.34%1.89%96.23%0.00%0.00%2017.46897.06%0.00%97.06%0.00%0.00%69 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究根据表5-2的相关数据结合统计学分析，分析每一次猪瘟病毒抗体及抗原检测结果的差异，结果见图5-2。结果显示，猪瘟抗体阳性率呈上升趋势，说明免疫猪群对猪瘟的免疫保护逐渐增强，对猪瘟净化工作初见成效。CSF野毒阳性率呈下降趋势带毒率下降，说明对规模化种猪场猪瘟野毒感染得到了有效的控制。图图5-2种猪场猪瘟净化效果图Fig.5-2CSFeradicationinapigfarm根据表5-2的相关数据集合统计学分析，分析每一次猪伪狂犬病毒gB/gE抗图体及抗原检测结果差异，结果见图5-3。结果显示，PRVgB抗体阳性率呈上升趋势，而PRVgE抗体阳性率呈逐渐下降趋势，说明净化方案中的免疫程序使得猪群对PR的抵抗力逐渐增强。PR野毒阳性率呈下降趋势，野毒带毒率下降，说明该规模化种猪场PR野毒感染得到了有效的控制。70 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究图5-3种猪场猪伪狂犬病净化效果图Fig.5-3Pigpseudorabieseradicationinafarmpig4讨论本研究结果表明，建立的猪瘟及伪狂犬病净化方案在该规模化种猪场中取得了较好的应用效果。在本次净化方案实施过程中，该规模化种猪场经过4次不同阶段的监测、免疫和淘汰，最终该场PRVgB抗体阳性率达到98.17%（429/437）；PRVgE抗体阳性率下降到0.23%（1/437）；猪伪狂犬病病原阳性率降至0%（0/437）；猪瘟抗体阳性率达98.63%（431/437）；猪瘟病原阳性率降至0%（0/437）。猪瘟和猪伪狂犬病的防控和净化意义重大，全球已有很多国家根除了猪瘟或猪伪狂犬病，但中国目前因没有统一强制性净化的区域及科学的全国性净化方案，因此，动物疫病的防控与净化取决于各规模化猪场自身的努力，要最终实现在国内整体对猪瘟和猪伪狂犬的净化与根除还要进一步探索。在《猪病学》第九版中有介绍：CSFV主要通过口鼻传播，病毒复制在扁桃体，PRV通过口鼻感染后，最初在上呼吸道的上皮细胞内复制；接着，感染扁桃体和肺，造成病毒以自由扩散或通过感染白细胞的途径在体内扩散；另外，病毒也进入三叉神经和嗅神经末梢，侵入中枢神经系统（斯特劳，2008）。因此，在本试验初期采集扁桃体的同时同步采集了口鼻黏液进行检测CSFV，检测结果表明：扁桃体中CSFV的检出率高于口鼻黏液的检出率。且有研究对猪的全血、血清、扁桃体和精液4种不同样品用CSFV糖蛋白E-ELISA、RT-PCR、CSFV抗原ELISA、荧光抗体71 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究染色法4种方法进行检测比较，试验结果表明，扁桃体的检出率最高，其次是全血样品，血清样品最低（胡杰等，2013）。因此，本试验应用已建立的猪瘟及伪狂犬病的净化方案采用全血和扁桃体样本作为试验材料，虽然活体扁桃体采样对猪只应激较大，但采用扁桃体进行病原检测有着较为准确、实时的可信度。该净化方案已相继在贵州各地州市十多个种猪场开展或正在开展，并不定期对猪场养殖管理人员进行样品的采集、存放及运输等相关方面的培训。在不断完善猪场疫病净化技术的同时也为猪场带一定的经济效益。疫病的防控与净化不仅取决于各种监测技术的建立与应用，与净化方案中提出的猪瘟和伪狂犬病净化的生物安全体系的实施有着不可缺少的作用，包括：（1）建立严格的防疫体系。（2）开展实施全进全出制度和自繁自养。（3）要实施早期断奶技术，降低或控制其他病原的感染，建立健康猪群。（4）对于生猪实施部分清群，对弊病多且复杂的生猪开展清群或隔离饲养，对发病猪及早淘汰。对于上述清群后的猪舍进行清洗、消毒并预留一定的空舍期等处理。（5）禁止在种猪场或生猪人工授精站内饲养其它种类动物、并开展实施灭鼠措施。对猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒抗原检测阳性率为0.0%的猪场下一步将申报“无猪瘟和猪伪狂犬病示范场”，在申报过程中需必备各种疫病监测资料，为后期相关疫病净化成功猪场申报示范场提供一定的经验分享。5结论（1）成功将实施净化方案的某规模化猪场的PRVgB抗体阳性率从83.98%（367/437）上升到98.17%（429/437）；PRVgE抗体阳性率从5.72%（25/437）下降到0.23%（1/437）；猪伪狂犬病病原核酸阳性率从2.75%（12/437）下降到0%（0/437）。（2）成功将实施净化方案的某规模化猪场的猪瘟抗体阳性率从85.81%（375/437）上升到98.63%（431/437）；猪瘟病原核酸阳性率从2.06%（9/437）下降到0%（0/437）。72 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究参考文献1.AllanGM,McNultyMS,McCrackenRM.RapiddiagnosisofAujeszky′sdiseaseinpigbyimmunofluorescence[J].ResVetSci,1984,36（2）:235-239.2.Allepuz,A,M.Saez.TheroleofspatialfactorsinthesuccessofanAujeszky′sdiseaseeradicationprogrammeinahighpigdensityarea(NortheastSpain,,2003-2007[J].PreventiveVeterinaryMedicine,2009,91,153-160.3.AujeszkyA.UebereineneueInfektions-krankheitbeiHaustieren,Zentralbl.Bakteriol.Parasitenkd.Infektionskr.Hyg.Abt.1,Orig.32,353-357.4.Afshar,A.andG.C.Dulac.Immunoperoxidaseplaquestainingforthedetectionofpseudorabiesvirus.CanJVetRes,1986,50（1）:118-189.5.BOELEARTF,DELUYKERH,MAESD.Prevalenceofherdswithyoungsowsseropositivetopseudorabies（Aujeszkypsdisease）innorthernBelgium[J].PrevVetMed,1999,41（4）:239-255.6.BruschkeCJ,HustMM,MoormannRJ,vanRijnPA,vanOirschotJT.GlycoproteinERNSofpestivirusinducesapoptosisinlymphocytesofseveralspecies[J].J.Virol,1997,71:6692-6696.7.BrittleEE,eynoldsAE,EnquistLW.Twomodesofpseudorabiesvirusneuroinvasionandlethalityinmice[J].JVirol,2004,78:12951-12963.8.Bellau-PujolS,VabretA,LegrandL,DinaaJ,GouarinaS,Petitjean-LecherbonnieraJ,PozzettobB,GinevrabC,FreymuthaF.DevelopmentofthreemultiplexRT-PCRassaysforthedetectionof12respiratoryRNAviruses[J].JVirolMethods,2005,126:53-63.9.BrownTM,OsorioFA,RockDL.DetectionoflatentPRVinswineinsitu-hybridization[J].Vetamaicrobiol,1990,（24）:272-280.10.BrianM,MeNeillyF,ToddD.CharacterzationofnovelcircovirusDNAsassociatewithwastingsyndromesinpigs.JGenVirol,1998,79:217l-2179.11.Carrere-KremerS,Montpellier-PalaC,CocquerelL,WychowskiC,PeninF,DubuissonJ.SubcellularlocalizationandtopologyoftheP7polypeptideofhehepatitisCvirus[J].JVirol.2002,76（8）:3720-3730.12.ChaberlainJS,GibbsRA,RanierJE,NguyenPN,CaskeyCT.DeletionscreeningoftheDuchennemusculardystrophylocusviamultiplexDNAamplification[J].NucleicAcidsRes,73 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规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究境牧羊犬军犬关节痹症[J].黑龙江畜牧兽医,2017(12):201+205.（核心期刊）[12]胡玲玲,汤德元,曾智勇,黄涛,李达,韦冠东,龙冬梅.贵州某动物园羊驼坏死梭杆菌感染的诊治[J].中国兽医杂志,2017,53(05):49-50+121.（核心期刊）[13]胡玲玲,汤德元,曾智勇,王彬,黄涛,李达,韦冠东,龙冬梅.贵州某动物园白虎皮肤真菌感染的诊治[J].黑龙江畜牧兽医,2017(10):190+291.（核心期刊）[14]胡玲玲,汤德元,曾智勇,黄涛,李达,韦冠东,龙冬梅.贵州某动物园黑叶猴感染溶血性巴氏杆菌的诊治[J].黑龙江畜牧兽医,2017(08):192-193+293.（核心期刊）[15]胡玲玲,汤德元,曾智勇,黄涛,李达,韦冠东,龙冬梅.贵州省某规模化猪场猪圆环病毒2型感染的诊治[J].黑龙江畜牧兽医,2017(06):115-116+283.（核心期刊）[16]胡玲玲,汤德元,曾智勇,黄涛,李达,韦冠东,龙冬梅.猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型及链球菌混合感染的诊断[J].猪业科学,2016,33(10):74-76（.普通期刊）[17]胡玲玲,韦冠东,汤德元,马萍,刘霞,曾智勇,黄涛,李达,龙冬梅.PRV、PRRSV和链球菌混合感染的诊断[J].黑龙江畜牧兽医,2016(16):122-124+291.（核心期刊）[18]胡玲玲,汤德元,曾智勇,黄涛,李达,韦冠东,龙冬梅.贵州省某规模化猪场猪圆环病毒2型感染的诊断[A].中国畜牧兽医学会.第七届中国畜牧科技论坛论文集[C].中国畜牧兽医学会:,2016:1.[19]胡玲玲,汤德元,曾智勇,黄涛,王彬,龙冬梅,石远菊,杨伟,叶丽.规模化猪场猪瘟和伪狂犬病净化技术的研究及应用[A].中国畜牧兽医学会动物传染病学分会、解放军军事科学院军事医学研究院.中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第九次全国会员代表大会暨第十七次全国学术研讨会论文集[C].中国畜牧兽医学会动物传染病学分会、解放军军事科学院军事医学研究院:,2017:1.84 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究获得专利：[1]胡玲玲,汤德元,曾智勇,黄涛,王彬.一种吸附式移液枪支架[P].贵州：CN206622137U,2017-11-10.[2]胡玲玲,汤德元,曾智勇,黄涛,李达,韦冠东,龙冬梅.一种可装卸防断盖脱盖装置的离心机保护盖[P].贵州：CN205146468U,2016-04-13.[3]胡玲玲,汤德元,曾智勇,黄涛,王彬.一种细胞液氮冻存套管[P].贵州：CN206622137U,2017-11-10.85 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究附录二本文用到的部分英文缩写及含义说明英文缩略词表英文简称英文全称中文名称PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应mPCRMultiplePCR多重聚合酶链式反应DNADeoxyribonucleteicAcid脱氧核糖核酸RNARibonucleicAcid核糖核酸dNTPDeoxynucleosideTriphosphate三磷酸脱氧核苷E.coliEscherichiacoli大肠杆菌EDTAEthylendiaminaetraaceticacid乙二胺四乙酸二钠IPTGIspropylthio-β-D-Galactoside异丙基硫代-β-D-半乳糖苷5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactX-gal5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷osidekbKilobasepair千碱基对bpBasepair碱基对DEPCDiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯ReversetranscriptionpolymerasechainRT-PCR反转录聚合酶链式反应reactionRNARibonucleteicAcid核糖核酸RNaseARibonucleaseA核糖核酸酶AAmpAmpicillin氨苄青霉素SIVSwinefluvirus猪流感病毒CSFVSwinefevervirus猪瘟病毒PPVPorcineparvovirus猪细小病毒PRVSyndromevirus猪伪狂犬病病毒PRRSVPorcinereproductiveandrespiratory猪繁殖与呼吸综合征病毒PCVPPorcinecricovirus猪圆环病毒ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定86 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究Vero细胞非洲绿猴肾细胞CPECytopathiceffect细胞病变效应ORFOpenReadingFrame开放阅读框OIEOfficeInternationalDesEpizooties世界动物卫生组织FBSfetalbovineserum胎牛血清PK-15细胞猪肾细胞87 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究致谢本文是在导师汤德元教授的悉心指导和亲切关怀下完成的，研究生期间，导师从对我课题的设计到实验的探索给予了细致的规划和精细指导，同时花费了大量精力指导我完成论文的撰写；在三年研究生学习期间不仅传授给我丰富的科学文化知识，增长了科学素养，而且教会了我许多为人处事的道理，树立了珍惜时光，勤奋学习，修身立德，立志成才的人生观。导师渊博的才识、严谨的治学态度、宽容的人生品格都使我获益匪浅，借此机会向汤老师表示崇高的敬意和衷心的感谢！感谢曾智勇老师和王彬老师在实验过程以及论文撰写方面给予我帮助，使我更轻松的解决遇到的问题，得以更快的提高自己！学习期间，得到了周碧君老师、嵇辛勤老师、王开功老师、文明老师、温贵兰老师、鲜思美老师、程振涛老师、黄涛老师等大力支持和帮助，在此向各位老师表示深深的感谢！同时对在百忙之中抽出时间评阅本论文的专家表示诚挚的谢意！感谢李春燕老师在我学习生活中给予了大力的支持和无私的关心；同时感谢李达师兄、刘钊师兄、韦冠东师兄、代振江师兄、徐国、叶百川等的大力帮助，感谢本实验室叶丽、石远菊、杨伟、张爱琼、何小莉、咸文、郭倩妤、廖少山、陈娟、吴好叶、刘巧玲等师弟师妹对我提供的帮助，使我顺利的完成实验内容，充实了我的研究生生涯，在此向你们表示诚挚的谢意！衷心感谢我的父母和家人。他们给予我的经济以及精神上的支持和鼓励，使我在学习期间无后顾之忧，他们对我无私的爱与照顾是我不断前进的动力，感谢他们！衷心感谢所有关心、支持、帮助我的领导、老师、同学和朋友！胡玲玲2018年6月于贵州大学88 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属贵州大学。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：日期：年月日89 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究关于学位论文使用授权的声明本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本学位论文属于：保密（），在年解密后适用授权。不保密（）（请在以上相应方框内打“√”）论文作者签名：导师签名：日期：2018年月日90
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