脑源性神经营养因子BDNF和TrkB在朊病毒病中的作用研究

《脑源性神经营养因子BDNF和TrkB在朊病毒病中的作用研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

学号：２０１２１１０２３０？中图分类号：Ｒ３９２．９学校代码１０１３２：ＩＮＮＥＲＭＯＮＧＯＬＩＡＭＥＤＩＣＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ硕士学位论文脑源性神经营养因子ＢＤＮＦ和ＴｒｋＢ在朊病毒病中的作用研究ｒｏｅｏｅｓｅａｒｃｈｒａｎ－ｒｖｅｄｅｕｒｏＴｈｅｌｆｒＢｉＤｅｉＮｔｒｏｐｈｉｃＦａｃｔｏｒａｎｄＴｒｋＢｉｎｒｉｏｎｄｉｓｅａｓｅｐ学科专业：免疫学研究生：王婷婷指导教师：新燕教授完成时间二〇＿五年五月： 内蒙古医科大学学位论文原创性声明郑重声明：本人所呈交的学位论文是在导师指导下，独立进行研究所取得的研究成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文内容不包含其他个人或集体已经公开发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人学位论文与资料若有不实，愿意承担一切相关的法律责任。论文作者签名年月日学位论文版权使用授权书本人完全了解学院有关保留、使用学位论文的规定，同意学院保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。学院享有发表、复制、查阅、借阅及申请专利等权利。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。同时本人保证：毕业后发表、使用学位论文以及结合学位论文研究课题再撰写的文章，作者署名单位一律为内蒙古医科大学。论文作者签名指导教师签名年月日年月日 目录中文摘要……………………………………………………………………………（1）英文摘要……………………………………………………………………………（3）论文题目……………………………………………………………………………（5）前言…………………………………………………………………………………（5）材料与设备…………………………………………………………………………（9）实验方法……………………………………………………………………………（12）实验内容…………………………………………………………………………（17）第一部分感染羊瘙痒因子263K的仓鼠脑组织中BDNF和TrkB表达水平变化1实验步骤及结果…………………………………………………………………（17）2讨论………………………………………………………………………………（22）Sc第二部分BDNF相关信号通路中蛋白表达量变化及BDNF和PrP沉积的关系研究1实验步骤及结果…………………………………………………………………（23）2讨论………………………………………………………………………………（29）第三部分BDNF及其相关蛋白与神经元定位及在朊病毒感染细胞系中的关系研究1实验步骤及结果…………………………………………………………………（30）2讨论………………………………………………………………………………（36）结论与展望…………………………………………………………………………（37）参考文献……………………………………………………………………………（40）文献综述……………………………………………………………………………（43）参考文献……………………………………………………………………………（53）缩略语表……………………………………………………………………………（59）攻读学位期间发表文章情况………………………………………………………（61）个人简历……………………………………………………………………………（61）致谢…………………………………………………………………………………（62） 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）1中文摘要目的朊病毒病（又称可传播性海绵状脑病，TSEs）是一种能够感染人和其他多种哺乳动物的中枢神经系统性疾病，它典型的神经病理学特征主要有脑组织中出现海绵状空泡样变性、淀粉样斑块沉积、神经元丢失和星形胶质细胞增生。BDNF是具有防止神经元死亡功能的特殊蛋白质，BDNF及其受体TrkB在中枢神经系统分布广泛，对神经元的成长、发育、分化和机体损伤修复都具有重要的作用。为了探讨BDNF和TrkB在朊病毒病中可能的变化，我们以朊病毒株—羊瘙痒因子263K颅内感染的仓鼠脑组织以及朊病毒稳定感染的细胞系作为研究对象，以观察BDNF和TrkB在朊病毒感染期间的表达变化，并深入探讨其可能发挥的作用。方法（1）颅内接种羊瘙痒因子263K感染的仓鼠终末期（80天）脑组织、接种后感染期第0天、20天、40天、60天和80天的仓鼠脑组织以及朊病毒感染的细胞系SMB-S15细胞中，采用WesternBlot方法和免疫组织化学方法检测BDNF和TrkB蛋白的表达水平变化。（2）进一步研究BDNF和TrkB与神经元及PrPSc在感染朊病毒的脑组织和细胞中是否存在作用关系，利用免疫荧光化学双重染色法检测BDNF和TrkB在仓鼠脑组织中的表达分布变化。（3）应用WesternBlot和免疫组织化学方法检测颅内接种羊瘙痒因子263K感染的仓鼠终末期（80天）脑组织、接种后感染期第0天、20天、40天、60天和80天的仓鼠脑组织、朊病毒感染的细胞系SMB-S15细胞中BDNF下游作用分子p-TrkB、GRB2和p75NTR的表达水平变化，探讨BDNF在朊病毒病中的相关作用机制，探索BDNF-TrkB信号通路的改变在朊病毒病中的作用。结果经WesternBlot方法检测显示结果，首次提出了在可传播性海绵状脑病终末期BDNF和TrkB以及下游的作用分子的表达量均显著降低，提示BDNF可能参与TSEs的发病。免疫荧光结果显示BDNF主要与神经元细胞共定位表达，与星形胶质细胞不表达。仓鼠接种感染期不同时间点脑组织样本中BDNF表达量随感染时间延长而逐渐下降，而相互作用的受体TrkB，尤其是磷酸化的TrkB（p-TrkB）随着时间的依赖性也均有递减的下降趋势，这样的下降趋势与神经元的丢失类似。相反，与在体内试验结果不同的是，BDNF和TrkB及其下游的作用分子在朊病毒感染的细胞系SMB-S15细胞及其治愈型 2内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）正常表达细胞系SMB-PS细胞中的表达量相比并无显著性差异。结论综上所述，我们通过WesternBlot，免疫组织化学，免疫组织荧光等一系列实验方法验证了在朊病毒感染的仓鼠脑组织中，BDNF及其相关受体TrkB的表达量均有显著的降低。实验数据表明BDNF的功能及其相关的信号通路的改变在感染朊病毒病动物的大脑中起着至关重要的作用，这可能与大量的神经元丢失有紧密联系，是值得我们进一步探讨和研究的。关键词：朊病毒病，羊瘙痒因子，BDNF，TrkB，GRB2，p75NTR 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）3TheroleofresearchBrain-DerivedNeurotrophicFactorandTrkBinpriondiseaseABSTRACTObjective：Priondiseases(alsocalledTransmissiblespongiformencephalopathies,TSEs)isakindofneurodegenerativediseases,whichcaninfecthumanandmanyotheranimal.Itsmainneuropathologicalfeatureisincludingspongiformvacuolardegeneration,amyloidplaques,neuronallossandastrogliosisappearedinbraintissue.BDNFisakindofproteinwhichcanpreventneuronaldisfunction.BDNFanditsreceptorTrkBiswidelydistributedinthecentralnervoussystem.Itplaysanimportantroleinpromotingcentralnervoussystemgrowth,development,differentiationandmaintenance.InordertoinvestigatethechangesofBDNFandTrkBwhichmaybehappenedinpriondiseases,wepreservedtheprionstrains,scrapiestrain263Kofbraintissueandintracranialinfectionhamsterprionstabilityinfectedcelllineastheresearchobject,inordertoobserveBDNFandTrkBexpressioninprioninfecteddiseases,andexploretheroleofitsfunctioninthesekindofdisease.Methods：(1)intracranialinoculationofscrapieinfectedhamster263Kend-stage(80days)braintissue,infectedwithperiodof0days,20days,40days,60daysand80daysofhamsterbraintissueandprioninfectioninSMB-S15cellline,detectingtheexpressionofBDNFandTrkBproteinchangeslevelbyWesternBlotandimmunohistochemicalmethod.(2)forfurtherstudytherelationshipbetweenBDNF,TrkB,NeuronsandPrPSc,whetherthereisrelationshipbetweenprioninfectioninbraintissueanditscells,weuseimmunofluorescencedoublestainingmethodtodetectBDNF,TrkBexpressionanddistributionhamsterbraintissue.(3)usingWesternblottingandimmunohistochemistrytodetecttheprotein’slevelinintracranialinoculationofscrapieinfectedhamster263Kend-stage(80days)braintissue,wetestedthisconditionbyinfectedwiththevirusinperiodof0days,20days,40days,60daysand80daysofhamsterbraintissue,andinthe 4内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）meantimewedetectedprioninfectioninSMB-S15celllineBDNFdownstreamofmolecularinteractionsp-TrkB,GRB2andp75NTRexpressionchanges.WeexploredtherelatedmechanismofBDNFinpriondiseaseandtheroleofBDNF-TrkBsignalingpathwaychangesinpriondiseases.Results：TheWesternBlotresultsshowedthesignificantlydecreasedexpressioninthetransmissiblespongiformencephalopathyofend-stageBDNFandTrkB,andthesameconditionhappenedinthedownstreammolecularinteractions,suggestedthatBDNFmightbeinvolvedinthepathogenesisofTSEs.ImmunofluorescenceshowedthatBDNFmainlyneuronsco-localizedexpression,noexpressionofastrocytes.ThelevelofBDNFwasdecreasedwithdifferentinfectiontimepointsinbraintissue,andtheinteractionofthereceptorofTrkB,especiallythephosphorylationofTrkB(p-TrkB)isdecreasingwiththedeclineofthetimedependentphenomenon.Thetrendisverysimilarwithneurons’losses.Contrarytotheinvivotestresults,theeffectofBDNF,TrkBanditsdownstreammoleculeslevelinSMB-S15cellsinfectedwithprionsandcuretypenormalexpressionlevelswerenosignificantdifference.Conclusion：Insummary,byusingWesternblot,immunohistochemistry,immunofluorescenceandaseriesofexperimentalmethods,weverifiedthattheexpressionlevelsofBDNFinthebraintissueofhamsterprioninfectionanditsrelatedreceptorsTrkBweresignificantlyreduced.TheexperimentaldatashowedthatthefunctionofBDNFanditsrelatedsignalpathwaychangingplayedacrucialroleinpriondisease,whichmightbecloselylinkedwithalargenumberofneuronallosses.Itisworthfurtherdiscussionandresearch.KEYWORDS：Prion;Scrapie;BDNF;TrkB;GRB2;p75NTR 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）5脑源性神经营养因子BDNF和TrkB在朊病毒病中的作用研究前言朊病毒病（Priondiseases），又称可传播性海绵状脑病（Transmissiblespongenformencephalopathies,TSEs）是存在于人和多种动物间的进程缓慢，具有退行性病变特征的致死性中枢神经系统疾病，其潜伏期长达数十年，致死率高达100%。朊病毒主要由只含蛋白质不含核酸的传染性蛋白质PrPSc组成，具有高度抵抗理化因素灭活的特性。朊病毒病包括人类的库鲁病（Kurudisease）、克-雅病（Creutzfelt-Jacobdisease，CJD）、吉斯特曼-施特劳斯综合征（Gerstmann-Straussler-Scheinkersyndrome，GSS）、致死性家族性失眠症（fatalfamilialinsomnia，FFI）以及羊瘙痒病（scrapie）、牛海绵状脑病（bovinespongiformencephalopathy，BSE），俗称疯牛病等多种疾病。自从1920年开始首次报道克雅氏病，近年来CJD患者的人群发病率有持续上升的趋势，临床上常出现共济失调、肌阵挛、姿势不稳、进行性痴呆、无动性缄默、行为异常等神经症状，病程发展缓慢，最后全部以死亡告终。该类疾病对人类的危害极大，现已成为医学研究的热点。朊病毒病也是一组蛋白质异常折叠的蛋白质构象病，与蛋白质因子（proteinaceousinfectiousparticle，Prion）相关，也称为朊蛋白（PrionProtein，PrP）。它的结构是由正常朊蛋白PrPc转化为具蛋白酶抗性的异常朊蛋白PrPSc并在中枢神经系统聚集引起。PrP通常划分为正常型和疾病型两个亚型。PrPc是正常细胞内的一种未知功能且高度保守的糖蛋白，主要分布于神经元表面和淋巴细胞胞浆内，在脑组织中表达最高。PrPSc是在羊瘙痒病（scrapie）中发现的蛋白，是PrPc异构体的改变，有很强的抵抗蛋白水解的能力，具有高度热稳定性，可以直接引起疾病。人类基因PrP也称为PRNP，主要定位于20号染色体短臂上，编码253个氨基酸，N端为无规则超螺旋结构，有5个8肽重复结构，106～126肽段具有神经细胞毒性，C端具有糖基化位点和磷脂酰肌醇锚固位点。小鼠PrP称为Pmp，它的基因定位于2号染色体的同源区域，编码254个氨基酸。Riek等[1]用核磁共振（NMR）的方法在重组的小鼠蛋白上确定的，然后证明了大鼠PrP和人类PrP与小鼠PrP有共同的构型。PrPc分子量为33～35kDa，含有一对二硫键和二个N型复合寡糖链，二硫键和糖基化的 6内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）残基都在PrP的C端。N端含有由22个氨基酸残基组成的信号肽序列，C端含有由23个氨基酸组成的糖基磷酸肌醇锚受体结合位点（GPI）[2]。而PrPSc本身具有非常强的抗蛋白水解酶特性，通过蛋白酶K（ProteinaseK，PK）处理后，消化掉正常的PrPc，PrPSc仅会被水解掉部分除去N端66个氨基酸形成的，分子量只有27～30kDa。前期大量研究证实，PrPc和PrPSc二者是异构体，不仅由同一基因PRNP编码，而且氨基酸序列也近似完全相同，本质区别在于它们蛋白质空间结构不同，PrPc的α螺旋为42%，β折叠仅为3%，而PrPsc的α螺旋为30%，β折叠反而高达43%。PrPSc是由于PrPc发生蛋白质空间构象折叠错误，α螺旋变为β折叠，三维构象发生变化，它的形成是翻译后的加工过程。PrPSc的增殖是一个指数式的增长过程[3]，1个PrPSc先与1个PrPc结合，形成杂合的二聚体，然后PrPSc以自身为模板，将PrPc转变成PrPSc，再不停重复释放，形成周而复始的循环过程。同时PrPSc的高度稳定性使其不能被紫外线或者离子辐射等一些常规方法灭活，而只能用胰蛋白酶处理，对作用于核酸的酶或者化学物质有很强的抵抗能力。PrPSc影响机体的正常功能，如破坏GABA系统，影响细胞内钙调节、运动系统、昼夜节律等；还会使PrPc减少导致神经细胞对自由基更敏感，并在小胶质细胞的联合作用下放出大量氧化自由基，通过这种破坏杀死神经细胞[4]。目前我们认为PrPc转变为PrPSc是朊病毒病发生的主要原因，但对PrPc的生物学功能的研究尚不清楚，部分研究结果提示PrPc可能在细胞粘附、识别、脂质摄取、金属离子转运和代谢，细胞抗氧化应激以及信号转导等过程中有着重要的生理功能[5,6]。朊病毒病随着朊病毒进入机体、不断复制，表现的主要病理变化为PrPSc的沉积、神经元的丢失、脑组织海绵状病变及星形胶质细胞增生。朊病毒病中神经元丢失是本病的一个重要特征，且朊病毒病脑组织没有出现炎性反应的病理变化，因此，凋亡可能是神经元丢失的重要原因，而神经元的凋亡涉及方方面面的因素及途径，机制较为复杂，所以对神经元凋亡的研究将有助于揭示朊病毒病的发病机制。脑源性神经营养因子（brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF）是德国神经生物学家Barde等在1982年首次从猪脑中发现的一种具有防止神经元死亡功能的碱性蛋白质，其编码基因定位于11p13上。BDNF广泛分布于大脑皮层、海马、基底前脑、纹状体、下丘脑和小脑，主要以海马和皮层区域表达含量最高，在中枢神经系统发育过程中起着至关重要的作用，同时也对胆碱能神经元、多巴胺能神经元、运动神经元等多种神经亚群具有重要的生物学功能。研究表明，BDNF对周围和中枢神经 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）7元有广泛的作用，对多种神经元有促进生存、有助分化和再生、增进代谢、增强功能表达及营养、支持、保护的作用[7]。BDNF通过靶细胞上的两种受体发挥特有的生物学功能，一种是高亲和力受体TrkB，另一种是低亲和力的p75神经营养素受体（p75NTR），后者为神经营养素家族成员共用的受体，其生物学意义还不是十分清楚，BDNF的神经营养和神经保护活性是由TrkB介导的[8]。TrkB是由酪氨酸激酶原癌基因编码的高亲和力受体，同时也是BDNF的特异性受体，BDNF与TrkB受体结合后，激活TrkB受体内在的酪氨酸激酶活性，发生快速自动磷酸化。在PI3K/AKT介导的信号通路中，磷酸化的TrkB与GRB2-SOS复合物结合，随之激活一些小G蛋白，包括Ras蛋白（ratsarcoma，Ras）和Raf-1等，相继激活该信号通路，通过下调GSK3β、Bad、Fasl等促凋亡蛋白而发挥抗凋亡作用，从而促进神经细胞存活。例如抑郁症、癫痫、阿尔茨海默病（AD）、亨廷顿氏病及帕金森氏病（PD）等疾病都会涉及BDNF表达的改变。近年来大量实验研究表明，BDNF在脑缺血过程中具有保护神经元、抵抗损伤及促进损伤神经元修复的作用。脑缺血损伤后，BDNF能保护缺血半影区神经元，并能抑制迟发性神经元死亡。同时也有文献报道，在阿尔茨海默病患者中，AD组与正常老年组相比，海马的BDNF、BDNFmRNA表达均减少[9]。BDNF作为神经营养家族的成员，及其受体TrkB表达在最丰富的脑区，与长时程增强效应及学习、记忆有关，BDNF的减少可能参与AD患者神经功能的退化，AD患者神经细胞的数量减少，龙其是胆碱能神经元丢失，会直接导致学习及记忆能力的改变，从而导致神经功能紊乱。尽管BDNF主要表达在脑组织，在中枢神经系统（CNS）发育过程中对神经细胞的生长、发育、分化和功能表达有一定促进作用，同时也能维持CNS神经元的正常功能，起着重要的作用，与脑缺血、癫痫、帕金森、AD等疾病也有了进一步的研究进展，但是在朊病毒感染过程中发挥的作用至今还不清楚，和朊病毒病的作用关系也缺乏进一步探讨。本室前期基因表达芯片研究结果显示，在一些人类遗传性朊病毒病脑组织中BDNF的转录水平有所降低。为了研究BDNF在可传播性海绵状脑病中变化，探讨BDNF在可传播性海绵状脑病发病过程中可能发挥的作用，本研究对BDNF和TrkB蛋白在朊病毒病感染脑组织中的表达水平进行了评价。我们发现，WesternBlot方法检测颅内接种羊瘙痒因子263K的仓鼠脑组织中BDNF和TrkB的表达水平在疾病感染终末期显著降低。共聚焦显微镜观察显示BDNF和TrkB的荧光信号与神经元标记蛋白NeuN染色细胞在大脑皮层和小脑几乎完全共定位，此结果 8内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）表明表达BDNF和TrkB蛋白的细胞是神经元细胞。收集感染期第0天、20天、40天、60天和80天不同时间点的仓鼠脑组织，进行动态分析BDNF和TrkB及其下游作用底物p-TrkB、GRB2和p75NTR蛋白分子的表达水平，显示其随着时间的积累呈逐渐降低趋势，这与神经元丢失的规律相吻合。而与BDNF相互作用的功能性受体TrkB在感染早期和中期表达量升高，在终末期仍然显著降低。另外，BDNF及其相互作用分子在体外朊病毒感染的细胞系SMB-S15细胞的朊病毒复制过程中表达水平几乎保持不变。以上结果可能说明PrPSc在脑组织中的沉积越来越严重，且累及范围越来越广泛，导致神经元丢失，细胞凋亡，出现认知功能障碍。 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）9一、材料与设备1.实验材料实验材料来源丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠（SDS）、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、北京康为试剂公司TEMED、过硫酸铵（APS）Cocktail蛋白酶抑制剂、蛋白酶K（ProteinaseK,PK）、美国Merck公司BCA蛋白浓度测定试剂盒细胞裂解液、抗荧光淬灭封片剂、上海碧云天生物试剂公司免疫染色固定液细胞培养瓶、96孔-24孔-6孔板美国Corning公司ECL显色试剂盒Perkin-Elmer公司TrisBase、Tween-20美国Amresco公司TritonX-100美国Sigma-Aldrich公司硝酸纤维素膜美国Schleicher＆Schuell公司脱脂奶粉美国BD公司优质牛血清白蛋白BSA美国Sigma公司2.主要仪器设备实验仪器来源-20℃常用低温冰箱荣事达BCD-278-80℃立式超低温冰箱日本SANYO公司恒压恒流电泳仪、SDS-PAGE垂直电泳系统、电转移装置、Uvpro凝胶成美国BIO-RAD公司像系统电子天平德国Sartorius公司倒置显微镜日本OLYMPUS公司超净工作台美国ThermoFisher公司普通台式离心机德国Eppendorf公司高速冷冻离心机日本HITACHI公司 10内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）新型实验室微波炉韩国LG公司恒温水浴箱北京长风仪器仪表公司托盘扭力天平上海第二天平仪器厂水平脱色摇床江苏海门市其林贝尔仪器公司进口涡旋振荡器美国ScientificIndustries公司激光共聚焦显微镜（FV1000）日本OLYMPUS公司3.抗体及菌株3.1抗体（表1）表1实验中所使用的抗体抗体名称来源稀释度用途Westernblot,IP,BDNF抗体Santacruze1:500IFATrkB抗体CST1:1000Westernblot,IPWesternblot,IP,p-TrkB抗体Abcam1:1000IFAGRB2抗体CST1:1000Westernblotp-75NTR抗体CST1:1000Westernblot,IFAPrP-3F4抗体Chemicon1:5000WesternblotHRP-conjugatedanti-mouseIgGSantacruze1:2000WesternblotHRP-conjugatedanti-rabbitIgGSantacruze1:2000WesternblotAlexaFluor®488goat-mouseInvitrogen1:200IFAIgG(H+L)AlexaFlour®568goat-rabbitInvitrogen1:200IFAIgG(H+L)NeuNmillipore1:100IFAGFAPCST1:300IFAβ-actinSantacruze1:1000Westernblot3.2细胞株及菌株羊瘙痒因子263K株中国疾控中心病毒病所朊病毒室保存SMB-PS细胞株自英国RoslinInstitute引进SMB-S15细胞株自英国RoslinInstitute引进 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）113.3溶液和缓冲液（表2）表2常用溶液及缓冲液配制溶液名称配制方法PBS缓冲液NaCl8g,KCl0.2g,Na2HPO41.44g,KH2PO40.24g,溶于1000ml双蒸水中，调pH至7.4TBS缓冲液NaCl8.8g，1MTris-HCl(pH8.0)20ml，溶于1000ml双蒸水中，调pH值至7.4TBST膜清洗液按照0.05%（v/v）的体积比在TBS中加入Tween-20配置而成Tris-甘氨酸SDS电泳缓冲液25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸（pH8.3），0.1%SDS5%浓缩胶2mlddH2O1.38ml；30%丙烯酰胺0.35ml；1.5MTris（pH6.8）0.25ml；10%SDS20μl；10%过硫酸胺20μl；TEMED2μl10%分离胶5mlddH2O0.94ml；30%丙烯酰胺2.02ml；1.5MTris（pH8.8）1ml；10%SDS40μl；10%过硫酸胺50μl；TEMED2μl15%分离胶4mlddH2O0.94ml；30%丙烯酰胺2.02ml；1.5MTris（pH8.8）1ml；10%SDS40μl；10%过硫酸胺40μl；TEMED1.6μl电转移缓冲液39mmol/L甘氨酸，48mmol/LTris-Cl，0.037%SDS封闭液5%脱脂奶，用TBST配制,100mlTBST溶液加入5g脱脂奶粉组织匀浆裂解液100mmol/LNaCl,10mmol/LEDTA,0.5%NonidetP-40,0.5%sodiumdeoxycholate,10mmol/LTris,pH7.5,含1%蛋白酶抑制剂Cocktail细胞裂解液20mMTris,150mMNaCl,1mMEDTA,1mMEGTA,1%TritonX-100,2.5mMsodiumpyrophosphate,1mMβ-Glycerolphosphate,1mMNa3VO4,1μg/mlLeupetin,1mMphenylmethylsulfonylfluoride(PMSF),pH7.50.3%Triton-X100通透液300μl100%Triton-X100加入到100mlTBS中抗体稀释液2%（w/v）BSA，0.3%（v/v）Triton-X100溶于TBS 12内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）二、实验方法1.脑组织匀浆样品的制备取新鲜的正常仓鼠脑组织和颅内接种感染羊瘙痒因子263K的黄金仓鼠终末期（80d）脑组织以及羊瘙痒因子263K感染后第0d，20d，40d，60d，80d的黄金仓鼠脑组织，称重，用TBS洗涤3次，使用裂解液制备成10%（w/v）脑组织匀浆，用2000r/min离心10min，去除脑组织碎片，提取上清液，分装后-80℃冷冻保存备用。2.WesternBlot检测蛋白含量1)加样前处理样品取10μl脑匀浆加入5×上样缓冲液，100℃煮沸10min进行变性处理。2)SDS-PAGE凝胶制备及电泳配制10%（或15%）的分离胶和5%的浓缩胶，在电泳装置中灌注分离胶，待分离胶凝结后，灌入5%的浓缩胶，插入梳子，待30min凝胶聚合后放置于电泳槽内，加入电泳缓冲液。将制备好的脑匀浆样品依次加样至玻璃板中，按电压调至浓缩胶80V，分离胶120V的电压条件下进行电泳。3)蛋白的电转移将电泳完成后的凝胶放入电转缓冲液中平衡5min，依凝胶大小，裁剪出相同大小的3M滤纸和硝酸纤维素膜（NC膜），置于电转缓冲液中平衡5min，按实验室所用型号半干电转仪的正极极板至负极极板方向，依次放置3层3M滤纸、NC膜、凝胶和3层3M滤纸，赶走各层间气泡，压上负极极板，以160mA稳流进行电转1.5h。4)封闭及抗体孵育将转移完毕后的NC膜置于含5%脱脂奶的TBST溶液中室温封闭1h，配置含有1：1000稀释的相对应的抗体（BDNF、TrkB、p-TrkB、GRB2和p75NTR抗体），5%脱脂奶的TBST溶液4℃摇床孵育过夜。取出NC膜，浸泡于TBST溶液洗3次，每次15min。将NC膜放入杂交袋中，加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG或辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG，37℃轻摇1.5h或室温孵育2h，取出NC膜，用TBST溶液再洗3次，每次10min。5)ECL显色将ECL显色液A和B按1:1比例混匀，滴加于NC膜上，相互作用1min后倒掉显色液，并把NC膜放置于透明自封袋中，暗室显影。 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）136)蛋白条带扫描将实验所得蛋白条带进行扫描成图，采用ImageJ软件对蛋白条带进行灰度定量分析。3.细胞的复苏、传代培养和冻存1）细胞复苏取出保存在液氮中装有SMB-PS和SMB-S15细胞的冻存管，迅速放入37℃水浴中融化。然后将细胞悬液吸取转移到离心管中，1000rpm离心5min后弃去上清，加入含有10%FBS的DMEM培养基，轻轻吹打细胞，移入25cm2培养瓶中，加入含10%FBS的DMEM培养基5ml，37℃、5%CO2孵箱中培养，24h后更换培养液。2）细胞传代培养当培养瓶中细胞生长旺盛时进行传代最佳，将旧培养基吸出弃去，用Versene溶液冲洗两次，加入1ml0.025%的胰蛋白酶，37℃消化3～5min。显微镜下观察，细胞皱缩成圆形，细胞间隙增大。此时加入含有10%FBS的DMEM培养基，用吸管轻轻吹打使细胞脱壁成为单细胞悬液。按1:2～1:4的比例分入新的培养瓶中，再加入加入5ml培养基，37℃、5%CO2孵箱中培养备用。3）细胞冻存冻存细胞时应缓慢冻存，冻存前一天晚上更换新鲜培养基，用0.025%胰酶消化收集细胞，加入配制含10%DMSO和10～20%FBS的冻存培养液，用吸管将细胞重悬后装入冻存管中，然后将冻存管置于4℃30min，-20℃2h，-80℃冻存过夜后转入液氮中保存并做好记录。4.细胞中蛋白的检测1）细胞蛋白提取将生长旺盛的细胞传代至培养板中，将旧的细胞培养液弃掉，用1×PBS洗细胞3次。按六孔板每孔加150μl细胞裂解液，12孔板每孔加100μl细胞裂解液均匀覆盖在细胞表面，放置于冰上40min后用细胞刮子刮取细胞，收集到1.5ml离心管中，4℃，12000rpm离心10min，吸取上清即为细胞裂解物，按需要分装保存于-80℃冰箱，部分用BCA方法进行蛋白浓度测定。2）蛋白浓度测定蛋白浓度测定采用BCA蛋白浓度检测方法，具体测定步骤如下：将BCA试剂 14内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）A和试剂B按50:1的比例混合配制成工作液，用PBS稀释蛋白标准品BSA至0.5mg/ml，将标准品BSA分别按0、1、2、4、8、12、16，20µl加入酶标板中，用BCA工作液将体积补足至100µl，用于建立标准曲线。加入适量体积样品至酶标板中，用BCA工作液补足到100µl，用于样品浓度的测定。将酶标板放置于37℃等待30min，用酶标仪测定A578nm时的OD值，根据标准曲线计算样品蛋白浓度。5.PrPsc蛋白的检测取脑组织匀浆样品10µl或细胞裂解液20µl，平均分为两份，一份加入终浓度25μg/ml的PK进行消化，37℃孵育1h；另一份加入等量的蒸馏水作为未进行PK消化的对照组，同时设立阳性对照和阴性对照。所有样品在2×SDS上样缓冲液（100mmol/LTris-HCl，200mmol/LDTT，4%SDS，20%甘油，0.2%溴酚蓝）100℃加热变性10min后，完成处理的样品进行SDS-PAGE电泳分析，其余WesternBlot步骤同上。6.免疫组化染色法（Immunohistochemistry,IHC）1)固定将浸泡于10%福尔马林溶液中12h的仓鼠脑组织取出，再次浸泡在96%甲酸溶液中至少1～2h后，自来水冲洗约1～2h除去甲酸，然后再用10%福尔马林溶液浸泡12h，若是新鲜固定的组织则用自来水冲洗5～6h，若是陈旧的固定组织则用自来水冲洗12～24h，最后PBS浸泡并放置4℃过夜。2)脱水、透明、石蜡包埋PBS中取出浸泡的脑组织然后依次进行梯度酒精脱水：75%乙醇15～30min→85%乙醇1h→95%的乙醇（I）1h→95%的乙醇（Ⅱ）1h→100%乙醇（I）1h→100%乙醇（Ⅱ）1h→二甲苯（I）15min→二甲苯（Ⅱ）15min→石蜡（I）1h→石蜡（Ⅱ）1h→石蜡包埋→石蜡凝固。3)切片石蜡切片机5μm连续切片，放于37℃水面展开后，用载玻片捞取组织粘贴到载玻片上，自然晾干，56℃烤箱烘干48h。4)免疫酶组织染色准备试剂：PBS，双蒸水，3%H2O2，柠檬酸，山羊血清，一抗，二抗，DAB染色，苏木素，封片剂 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）15①石蜡切片浸泡于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5min；②100%酒精Ⅰ、100%酒精Ⅱ、90%酒精、80%酒精、70%酒精、60%酒精各3min；③0.1×PBS洗3min；④复合酶消化3min或者浸入柠檬酸溶液微波中高火修复30min（将切片浸没在0.1×PBS/ddH2O中），复温30～60min；⑤PBS洗5min×3次；⑥3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10min；⑦PBS洗5min×3次；⑧正常山羊血清封闭30min，室温；⑨稀释加一抗，每张片子150µl，4℃过夜12～16h；⑩37℃复温10min，然后PBS洗5min×3次；⑪滴加PV两步法的二抗复合物，37℃1h；⑫PBS洗5min×3次；⑬滴加DAB显色液，1000µl水中加A、B、C各一滴，避光室温放置3~10min（视背景程度而定）；⑭自来水冲洗，中止显色，放入蒸馏水中；⑮苏木素复染1min，自来水冲洗5min；⑯60%酒精、70%酒精、80%酒精、90%酒精、100%酒精Ⅱ、100%酒精Ⅰ，二甲苯Ⅱ、二甲苯透明各3min；最后封片剂封片，显微镜下观察拍照进行分析。7.免疫荧光染色法(Immunofluorescenceassay,IFA)①石蜡切片浸泡于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5min；②100%酒精Ⅰ、100%酒精Ⅱ、90%酒精、80%酒精、70%酒精、60%酒精各3min；③0.1×PBS洗3min；④复合酶消化3min或者浸入柠檬酸溶液微波中高火修复30min（将切片浸没在0.1×PBS/ddH2O中），复温30～60min；⑤PBS洗5min×3次；⑥0.3%Triton-X100通透处理20min；⑦PBS洗5min×3次； 16内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）⑧正常山羊血清封闭30min，室温；⑨稀释加一抗，每张片子150µl，4℃过夜12～16h；⑩37℃复温10min，然后PBS洗5min×3次；⑪滴加荧光二抗，37℃1h；⑫PBS洗5min×3次；⑬DAPI染色，避光室温放置30min；⑭PBS洗5min×3次；⑮防荧光淬灭封片剂封片；⑯荧光显微镜下观察拍照。8.统计学处理Westernblot检测且ECL显色后，对胶片所得的蛋白条带进行照相并转换为TIF格式，采用灰度分析软件对蛋白条带进行灰度扫描和定量分析，利用统计分析软件SPSS17.0对数据进行统计分析，所有数据用均数加减标准差表示，比较两组间的差异选用T检验方法，以P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异有显著性统计学意义。 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）17三、实验内容我们的实验内容主要以正常仓鼠脑组织、颅内接种羊瘙痒因子263K感染的仓鼠终末期（80天）脑组织、接种后感染期第0天、20天、40天、60天和80天的仓鼠脑组织以及朊病毒感染的细胞系SMB-S15细胞及其治愈型SMB-PS细胞为研究对象，利用WesternBlot，IHC，IFA等实验方法集中研究探讨BDNF和TrkB在朊病毒病中所发生的变化以及探索BDNF-TrkB信号通路的改变在朊病毒病中的作用。第一部分：感染羊瘙痒因子263K的仓鼠脑组织中BDNF和TrkB表达水平变化1实验步骤及结果1.1BDNF在颅内接种263K感染的仓鼠脑组织中表达量变化为了观察BDNF蛋白在朊病毒病病理状态下发生的变化，我们利用Westernblot方法检测羊瘙痒因子263K感染的仓鼠脑组织中BDNF的表达水平，选用3只正常仓鼠脑组织作为正常对照组，同时选用3只颅内接种感染羊瘙痒因子263K仓鼠终末期（80d）脑组织作为实验组，以β-actin蛋白作为内参。结果显示，在14kDa条带的位置正常仓鼠脑组织中出现BDNF条带，而羊瘙痒因子263K感染的仓鼠脑组织中BDNF蛋白条带非常弱几乎检测不到，表达量较正常仓鼠显著降低。我们进一步将Westernblot实验结果所得蛋白条带进行扫描，采用ImageJ软件对目的蛋白信号进行灰度定量分析，以β-actin为内参进行相对定量并进行统计学分析，结果表明感染263K的仓鼠终末期脑组织中BDNF蛋白表达量降低，具有统计学意义（P=0.038＜0.05）（图1A）。 18内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）A图1A感染263k的仓鼠终末期脑中BDNF蛋白表达量降低实验所需样品：正常组为三只正常仓鼠，263K组为三只羊瘙痒因子263K感染的终末期仓鼠，分别上样10μl进行Westernblot，实验结果进行灰度扫描，每个泳道的条带的灰度值与其对应的actin的灰度值相对比，得出两组的平均灰度相对值。与正常对照组相比，感染263K仓鼠终末期脑中BDNF蛋白表达量显著降低，统计分析P＜0.05，有统计学差异。1.2BDNF在颅内接种263K感染的仓鼠脑组织中表达分布情况我们利用正常仓鼠以及感染263K仓鼠终末期脑组织石蜡切片，进行免疫组织化学染色，进一步验证BDNF在感染263K的仓鼠脑组织中的表达以及分布情况。染色后观察脑组织，结果显示，正常仓鼠小脑皮层外颗粒层、梨状细胞层和内颗粒层BDNF都有表达，主要分布于浦肯野细胞周围，染色明显，大量的BDNF蛋白棕色阳性细胞颗粒清晰可见，分布较密呈不规则的单层排列，胞浆染色较深；而在263K感染的仓鼠脑组织中阳性棕染细胞明显减弱，胞体皱缩，轮廓模糊，染色变淡。实验表明BDNF蛋白阳性细胞颗粒数量以及表达量在仓鼠脑组织皮层和小脑区域相对正常组明显减少（图1B）。 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）19B图1B正常仓鼠和感染263k的仓鼠终末期脑中BDNF免疫组化染色用正常仓鼠和263K感染终末期的仓鼠脑组织石蜡切片进行免疫组化染色实验，如图放大40倍，可见263K感染的仓鼠脑组织中小脑和大脑皮层阳性颗粒细胞数量分布稀疏较正常仓鼠脑组织中阳性细胞数量明显减少，差异明显。1.3BDNF的下游作用分子TrkB和p-TrkB在263K感染的仓鼠终末期脑组织中表达量变化BDNF主要通过与其特异性受体TrkB结合发挥生物学作用，TrkB受体分布于皮质、海马、基底前脑、纹状体等脑区的胆碱能神经元及非胆碱能神经元中。为了进一步研究BDNF在朊病毒感染中发生的调节机制，我们又对BDNF下游作用分子TrkB 20内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）和p-TrkB的表达量进行检测，实验方法与之前BDNF的检测相同，分别选用3只正常仓鼠和感染羊瘙痒因子263K的仓鼠检测，如（图2A）所示，与正常仓鼠比较，263K感染仓鼠终末期脑组织中TrkB的表达量明显下降。我们将实验所得蛋白条带进行扫描成图，采用ImageJ软件对蛋白信号进行灰度定量，并以β-actin作为内参进行相对定量分析，然后将数据进行统计学分析并绘制统计图。结果表明，263K毒株感染仓鼠终末期的脑组织中BDNF下游作用分子TrkB和p-TrkB的蛋白表达量均显著降低，与正常对照组相比，有统计学差异（图2B）。A图2ABDNF下游作用分子TrkB在263k感染的仓鼠脑组织中的表达情况B图2BBDNF下游作用分子p-TrkB在263k感染的仓鼠脑组织中的表达情况实验样本来自6只年龄性别相同的仓鼠，3只正常对照组和3只进行263K感染的仓鼠，在疾病的终末期取脑组织，利用Westernblot检测TrkB和p-TrkB的表达量。在263K感染仓鼠的终末期两个蛋白分子的表达量均显著降低，与正常组对比有显著性差异（P＜0.05）。 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）211.4利用免疫组织化学染色方法分析TrkB和p-TrkB在263K感染的仓鼠终末期脑组织中表达量变化为了进一步证明下游作用底物和调控蛋白分子的变化，我们又对263K感染仓鼠和正常仓鼠脑组织石蜡切片进行了免疫组化染色，检测TrkB和p-TrkB在感染263K的仓鼠脑组织中的表达情况。结果显示，在正常仓鼠脑组织中，阳性的TrkB和p-TrkB蛋白呈棕色颗粒状，多为椭圆形或者梨形，集中分布于浦肯野细胞周围，轮廓依稀可见，着色较深。而263K感染的仓鼠脑组织中阳性细胞数量减少，染色相比浦肯野阳性细胞弱，所有细胞轮廓模糊，散在排列，染色较淡。实验表明在263K感染仓鼠的脑组织中，TrkB和p-TrkB蛋白阳性细胞数量明显减少，染色较淡，仅有少数阳性细胞散在分布，与正常组比较有显著性差异（图2C）。C图2C正常仓鼠和感染263k的仓鼠终末期脑中TrkB和p-TrkB免疫组化染色如图放大40倍所示，用正常仓鼠和263K感染的终末期仓鼠脑组织石蜡切片进行免疫组化染色实验，清晰可见263K感染的仓鼠脑组织中小脑和大脑皮层TrkB和p-TrkB阳性颗粒细胞数量散在分布，相比正常仓鼠脑组织中阳性细胞数量明显减少。 22内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）2讨论BDNF对神经元的生存、生长、分化和可塑性有极大的影响，不仅可诱导神经前体细胞定向分化，还具有广泛的神经营养和神经保护作用，对神经元的存活、正常生理功能的维持及损伤后修复有着积极的意义。神经营养因子假说理论[10]认为，处于发育中的神经元，其存活依赖于它所支配的靶细胞产生的特殊的营养因子。为确定BDNF和TrkB蛋白含量随着病程延长而发生下降受朊病毒病中哪种病理过程影响，或BDNF和TrkB蛋白对哪个病理过程发挥作用，我们设计了以下实验进行证实。我们的实验结果显示，BDNF、TrkB和p-TrkB蛋白含量在颅内接种感染羊瘙痒因子263K仓鼠脑组织终末期均显著降低，甚至几乎检测不到。除此之外，IHC结果显示263K感染的仓鼠脑组织中小脑和大脑皮层BDNF、TrkB和p-TrkB的阳性细胞数量较正常仓鼠脑组织中阳性细胞数量明显减少，染色变淡，细胞胞体形态呈不规则排列。BDNF及TrkB表达的变化规律表明了二者参与感染羊瘙痒因子263K仓鼠脑组织中小脑和皮层病变的过程。 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）23第二部分：BDNF相关信号通路中蛋白表达量变化及BDNF和PrPSc沉积的关系研究1实验步骤及结果1.1GRB2在263K感染的仓鼠脑组织中表达量变化BDNF和TrkB结合后可激活细胞内信号传导通路，包括丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（mitogenactivitedproteinkinase/extraccllularsignal-relatedkinase,MAPK/ERK）、磷脂酶Cr（phospholipase-Cgamma,PLCr）和磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K/AKT）3条通路。以上通路不仅参与促进神经元细胞发育、分化、再生，而且还对神经元的存活、突触可塑性及形态学改变起着重要作用。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K/AKT）通路参与BDNF的神经保护作用，同时对神经元的存活起至关重要的作用。我们本次实验主要研究BDNF激活的PI3K/AKT传导通路，BDNF和受体TrkB结合激活它的酪氨酸激酶活性，发生自身磷酸化和磷酸化生长因子受体接头蛋白（growthfactorreceptorboudprotein2,GRB2）和鸟苷酸释放因子（sonofsevenless,SOS）等。磷酸化的TrkB与GRB2-SOS复合物结合继续激活Ras蛋白，从而介导PI3K/AKT通路。GRB2作为此通路中的关键下游蛋白，为了研究它在朊病毒感染的脑组织病理状态下发生的变化，我们依然沿用之前检测BDNF蛋白的Westernblot方法，选用3只正常仓鼠脑组织和3只颅内接种感染羊瘙痒因子263K的仓鼠，分别作为正常对照组和实验组，以β-actin蛋白作为内参，检测GRB2蛋白的表达水平。结果显示在25kDa条带的位置羊瘙痒因子263K感染的仓鼠脑组织中GRB2蛋白条带非常微弱，对应的正常仓鼠脑组织中出现明显条带。将所得蛋白条带进行扫描成图并加以灰度定量分析，结果显示感染263K的仓鼠终末期脑组织中GRB2蛋白的表达水平明显低于正常组（P＜0.05）（图3A）。 24内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）A图3ABDNF/TrkB通路中GRB2蛋白在263k感染的仓鼠终末期脑中表达降低正常组为三只正常仓鼠，263K组为三只羊瘙痒因子263K感染的终末期仓鼠，每个泳道分别上样10μl进行Westernblot，实验结果进行灰度扫描，每个泳道的条带的灰度值与其对应的actin的灰度值相对比，两组的平均灰度相对值，经统计分析P＜0.05，有统计学差异。与正常对照组相比，感染263K仓鼠终末期脑中GRB2蛋白表达含量降低了2倍。1.2p75NTR在263K感染的仓鼠脑组织中表达量变化p75NTR介导细胞凋亡通路JNK-p53-Bax，去除NGF后p75NTR激活该途径诱导神经元凋亡。通路主要包括c-Jun的磷酸化[11]、p53、Bad和Bim的激活、Bax线粒体易位、细胞色素C的释放以及Caspase-3，6，9的激活[12]。本次实验首先我们分析了BDNF与高亲和力受体TrkB结合后的信号传导通路中，GRB2蛋白在感染朊病毒病的脑组织中表达量变化，其次我们也要探讨BDNF与低亲和力受体p75NTR介导的信号传导通路中，p75NTR蛋白在感染朊病毒病的脑组织中表达量变化。我们利用Westernblot检测方法，具体步骤同上，结果显示感染羊瘙痒因子263K的仓鼠与正常仓鼠比较，终末期脑组织中p75NTR的含量明显降低，在75kDa的位置p75NTR条带几乎检测不到，而在正常仓鼠脑组织中均有表达，P＜0.05，有统计学差异（图3B）。我们认为，BDNF通过激活p75NTR信号通路对中枢神经系统神经元发挥相应的作用，诱导神经元凋亡。 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）25B图3Bp75通路中p75NTR蛋白在263k感染的仓鼠终末期脑中表达降低实验样本为3只正常仓鼠和3只进行颅内感染263K的仓鼠，利用Westernblot检测p75NTR的表达含量。结果表明在263K感染仓鼠终末期的脑组织中p75NTR蛋白的表达含量明显较正常对照组降低，P＜0.05，有统计学差异。1.3PrPSc在263K感染的仓鼠脑组织中表达量变化我们利用263K接种后感染期第0天、20天、40天、60天和80天的仓鼠脑组织匀浆，进行Westernblot实验检测PrPSc的表达量变化，观察朊病毒感染的脑组织中PrPSc的沉积情况。选用5只颅内接种感染263K毒株不同时间点的黄金仓鼠，制备10%的脑匀浆，一组为正常对照组，可得到总的PrP（包括PrPc和PrPSc）蛋白条带，另一组使用PK消化1h，可得到抵抗PK消化的PrPSc蛋白条带，我们对Westernblot胶片上的蛋白条带进行扫描成图，采用ImageJ软件对目的蛋白条带进行灰度定量，并以β-actin作为内参进行相对定量分析，然后将数据进行统计学分析并绘制统计图。实验结果表明，263K接种后感染期第0天、20天、40天、60天和80天的仓鼠脑组织中总PrP蛋白含量是随着潜伏期时间延长依次增加的。结果显示，在仓鼠感染的第0天、20天、40天都没有显现PrPSc，而在感染的第60天出现PrPSc蛋白条带，其PrPSc的表达量增加为第40天时的3.5倍，在第80天时为第40天时的6倍（图4A）。 26内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）A图4APrPSc在263K感染的仓鼠脑组织中表达量变化利用263K接种后感染期第0天、20天、40天、60天和80天的仓鼠脑组织匀浆，分为两组，实验组经过PK消化1h后，进行Westernblot实验检测PrPSc的表达量，结果显示在263K感染的第60天的仓鼠脑组织中出现PrPSc，较感染40天时显著增多，而在感染第80天（终末期）时PrPSc的蛋白含量达到整个感染及发病期的最高值。 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）271.4263K感染的仓鼠脑组织中BDNF及其相关分子表达水平的动态分析263K感染的仓鼠从接种到终末期发病死亡一般周期为80d左右，为了研究感染263K毒株后在潜伏期内仓鼠脑组织中蛋白表达的变化规律，我们选择颅内接种263K毒株后第0d，20d，40d，60d，80d的仓鼠，应用Westernblot方法分别检测脑组织中各种相关蛋白的含量以及从接种至终末期的整个感染过程中蛋白表达是从何时开始降低的变化情况。我们将实验所得蛋白条带进行扫描成图，采用ImageJ软件对蛋白条带进行灰度定量，并以β-actin为内参进行相对定量分析，然后将数据进行统计学分析并绘制统计图。实验结果显示，BDNF蛋白表达含量在263K感染仓鼠第80d终末期条带显示非常微弱几乎检测不到；TrkB蛋白表达含量在颅内接种263K毒株后的第40d、60d仓鼠脑组织样本中明显下调，在第80d仓鼠脑组织样本中几乎检测不到；p-TrkB蛋白表达含量从仓鼠感染第40d即出现轻度下降，在第60d、80d终末期逐渐下降，直至几乎为零；GRB2蛋白表达含量在早期263K感染仓鼠的脑组织中没有明显的变化，在第80d仓鼠脑组织终末期样本中几近消失；p75NTR蛋白表达含量在263K感染第20d的仓鼠脑组织中相对于正常仓鼠表达量明显下降，且在感染的终末期几乎检测不到。由此可知，BDNF及其作用的相关蛋白分子在朊病毒感染期间随着感染时间的增长，表达含量逐渐下降，呈时间的依赖关系。仓鼠感染各个时间点的检测结果显示，本次实验研究的BDNF介导的两条传导通路下游作用分子的表达含量在263K感染的仓鼠终末期的脑组织中均显著降低，下降量各不相同，可能表明BDNF含量的改变与朊病毒引起的神经元死亡和发病高度密切相关（图4B）。 28内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）B图4BBDNF及其相关蛋白分子在263K感染仓鼠不同时间点脑组织中表达情况利用263K感染仓鼠各个时间点的脑组织匀浆，进行Westernblot检测BDNF及其相关蛋白分子表达量变化，实验结果进行相对灰度扫描并加以统计学分析，可见随感染时间增加表达量逐渐下降，直至终末期表达含量降低几近为零。 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）292讨论BDNF水平与许多神经系统疾病包括抑郁、阿尔茨海默病、精神分裂症及脑损伤和脊髓损伤功能恢复有关[13]，共同的表现主要为蛋白质异常的聚集，蛋白质错误折叠所致的结构改变，神经元内部及外部淀粉状纤维蛋白的沉积。研究发现在这些疾病中，BDNF水平都有不同程度的减少。朊病毒病是蛋白构象病在中枢神经系统退行性疾病中的典型代表，经过实验研究，在羊瘙痒因子263K感染的终末期仓鼠脑组织中，伴随大量具有蛋白酶抗性PrPSc的沉积，实验证实了BDNF、TrkB、p-TrkB、GRB2和p75NTR的蛋白含量在颅内接种感染羊瘙痒因子263K仓鼠脑组织终末期均显著降低。虽然BDNF在朊病毒病中具体的作用机制尚不明确，但是它诱导的PI3K/AKT信号通路在朊病毒感染过程中具有重要的意义。对PI3K/AKT信号通路而言，BDNF、TrkB和p-TrkB的蛋白表达量降低，同时通路中的结合器蛋白GRB2的活性也降低，BDNF诱导的AKT的活性降低，而AKT是PI3K/AKT信号通路中发挥抗凋亡作用的重要蛋白，因此我们推断沿着整个信号传导通路，引发Ras途径失调，最终导致细胞发生凋亡，神经元丢失。另一方面，p75NTR是神经元生长、存活与凋亡的重要调节因子，在神经发育过程中调控神经细胞存活和死亡方面发挥关键作用。p75NTR缺乏酪氨酸激酶活性，BDNF与之结合相互影响，发挥多重生物学效应，启动JNK-p53-Bax信号通路，加速诱导细胞凋亡。除此之外，我们还对感染羊瘙痒因子263K第0d，20d，40d，60d，80d仓鼠脑组织检测，发现在感染仓鼠的终末期各蛋白的表达量均急剧下降，甚至几乎检测不到。朊病毒病中错误折叠蛋白PrPSc的沉积是朊病毒病的致病原因，说明各蛋白含量的减少与随着时间延长PrPSc的沉积密切相关。BDNF蛋白的表达调节和功能改变是影响细胞生物学行为的重要因素之一，对朊病毒病也是有重要影响的。为了进一步验证BDNF和TrkB与神经元在感染朊病毒的脑组织和细胞中是否存在作用关系，我们下面利用免疫荧光化学双重染色法再次进行检测。 30内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）第三部分：BDNF及其相关蛋白与神经元定位及在朊病毒感染细胞系中的关系研究1实验步骤及结果1.1BDNF及其相关蛋白在正常仓鼠脑组织中的分布情况神经元丢失和星形胶质细胞增生是朊病毒病其中两个比较典型的病理特征变化，为了进一步探讨BDNF及其相关蛋白表达与它的作用关系，我们利用正常仓鼠脑组织石蜡切片进行免疫荧光实验，分别利用神经元特异性抗体NeuN和胶质原纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidprotein,GFAP）的特异性抗体共染色来检测神经元细胞和星形胶质细胞的表达，以便观察BDNF及其相关蛋白在神经元和星形胶质细胞的表达情况。荧光染色后的切片在共聚焦显微镜下观察并拍照，显示的蓝色信号为DAPI复染细胞核，红色信号由上至下依次为BDNF、p-TrkB和p75NTR三种蛋白。结果表明，在正常仓鼠脑组织的皮层区域，BDNF、p-TrkB和p75NTR蛋白呈现圈状染色包围着蓝色的细胞核，与绿色的呈圆或椭圆形散在斑块状的NeuN荧光信号共定位引起黄色信号（图5A）。而随后检测的GFAP绿色信号染色显著增强，密集排列，是细胞形态具有分支星形结构的星形胶质细胞，同样检测BDNF、p-TrkB和p75NTR三种蛋白，其荧光信号为红色的椭圆或圆形圈状，而星形胶质细胞为分支较多的星状或多边型，经过放大观察，BDNF、p-TrkB和p75NTR在仓鼠脑组织的大脑皮层区域与星形胶质细胞无明显的共定位（图5B）。结果提示，BDNF、p-TrkB和p75NTR在正常仓鼠脑组织中神经元的表达主要分布在仓鼠的大脑皮层区域。 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）31A图5ABDNF、p-TrkB和p75NTR在正常仓鼠脑组织中与NeuN的定位情况B图5BBDNF、p-TrkB和p75NTR在正常仓鼠脑组织中与GFAP的定位情况 32内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）利用正常仓鼠脑组织石蜡切片将BDNF、p-TrkB和p75NTR与神经元标记物NeuN和星形胶质细胞标记物GFAP进行免疫荧光双重染色，BDNF、p-TrkB和p75NTR蛋白标记为红色，NeuN和GFAP标记为绿色。结果显示，观察到的BDNF、p-TrkB和p75NTR蛋白与NeuN的图像合并后出现黄色信号，方框内放大部分，可清晰观察到，即说明两者信号发生重叠，有共定位表达。而BDNF、p-TrkB和p75NTR蛋白与GFAP并无重叠信号显示，无明显的共定位表达。1.2利用IFA分析BDNF和p-TrkB在263K感染的仓鼠终末期脑组织中表达含量变化基于以上实验结果，我们又对正常仓鼠和263K感染仓鼠终末期脑组织的石蜡切片进行了免疫荧光染色，检测BDNF和p-TrkB在感染263K仓鼠脑组织中小脑和皮层区域的表达情况，为了进一步阐明朊病毒感染引起BDNF及其相关蛋白表达含量下降的分子机制。一组为正常对照组，另外一组为263K感染仓鼠终末期脑组织，DAPI标记为蓝色复染细胞核，BDNF和p-TrkB标记为红色检测蛋白。激光免疫共聚焦显微镜观察结果显示，在正常仓鼠的脑组织中，小脑和皮层区域BDNF和p-TrkB阳性细胞颗粒均有表达，尤其在皮层分布较为广泛，可见大小不一数量较多呈圆圈状的阳性细胞。而在263K感染仓鼠终末期脑组织中，小脑和皮层区域阳性细胞分布极少，在镜下几乎找寻不到（图5C，D）。它表明在颅内接种感染羊瘙痒因子263K的仓鼠脑组织中，BDNF及其相关蛋白含量的减少与神经元的丢失密切相关。 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）33C图5CBDNF在正常仓鼠和263K感染仓鼠终末期脑组织中的荧光定量分析D图5Dp-TrkB在正常仓鼠和263K感染仓鼠终末期脑组织中的荧光定量分析 34内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）利用正常仓鼠和263K感染仓鼠终末期脑组织石蜡切片将BDNF、p-TrkB进行免疫荧光染色，BDNF、p-TrkB蛋白标记为红色，DAPI标记为蓝色。结果显示，在正常仓鼠脑组织的小脑和大脑皮层区域，阳性细胞广泛分布有明显表达。而在263K感染仓鼠终末期脑组织中，小脑和大脑皮层区域的阳性细胞颗粒表达不显著。1.3BDNF及其相关蛋白表达含量在朊病毒感染细胞的增殖过程中无显著变化为了进一步探讨BDNF及其相关蛋白在朊病毒感染的细胞中蛋白表达的情况，我们以稳定感染朊病毒Chandler株的细胞系SMB-S15和其经过磷酸戊聚糖（pentosanphosphate,PS）治疗痊愈的细胞系SMB-PS作为研究对象，在利用含10%FBS的完全培养基分别培养两种细胞，待消化并提取细胞蛋白以及测定蛋白浓度后，进行Westernblot实验检测BDNF及其相关蛋白含量。将实验所得蛋白条带进行扫描成图，采用ImageJ软件对蛋白条带进行灰度定量，并以β-actin作为内参进行相对定量分析，然后将数据进行统计学分析并绘制统计图。结果显示，BDNF及其相关蛋白在SMB-PS和SMB-S15两种细胞中表达量并无显著性差异，P>0.05（图6A，B）。A图6ABDNF及其相关蛋白在SMB-PS和SMB-S15细胞中的表达变化 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）35B图6BBDNF及其相关蛋白在SMB-PS和SMB-S15细胞中的表达变化分别培养SMB-PS和SMB-S15细胞，提取细胞蛋白作为样本，检测BDNF、TrkB、p-TrkB、GRB2和p75NTR的蛋白表达含量变化。蛋白条带进行灰度扫描分析，结果显示BDNF及其相关蛋白分子在培养的SMB-PS和SMB-S15细胞中表达量并无统计学差异（P>0.05）。 36内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）2讨论BDNF对神经元的结构和功能有精细调节[14]。它可支持保护基底前脑胆碱能神经元存活和生长并刺激其分化，对神经元具有广泛的神经营养作用，同时可以增强多巴胺能神经元对多巴胺的摄取，也可以促进中脑多巴胺能神经元的分化，保护纹状体多巴胺能神经元。朊病毒感染后神经元必然会损伤，当神经元损伤时会引起BDNF蛋白含量的减少，甚至消失。如果损伤因素除去，BDNF蛋白含量可以正常表达。因此，BDNF蛋白含量的变化可能作为判定神经元功能状态的一个标志。我们通过免疫荧光化学双重染色实验验证了BDNF和p-TrkB与神经元在仓鼠脑组织中存在共定位表达，而与星形胶质细胞未发现有明显的共定位现象。除此之外，我们还利用免疫荧光染色方法定量分析了BDNF和TrkB蛋白在正常仓鼠和羊瘙痒因子263K感染的仓鼠脑组织的小脑以及大脑皮层区域的分布变化，进一步检测了阳性细胞的状态和数量情况。结果显示，正常仓鼠皮层区域的阳性细胞颗粒表达较为广泛，而在羊瘙痒因子263K感染的仓鼠脑组织中阳性细胞减少，几乎没有表达。以上提示了BDNF与神经元细胞的生长或存活有着密切的关系。而在神经细胞的存活中神经营养的供给也是一个至关重要的过程，这一过程也依赖于细胞微管骨架。BDNF作为重要的神经营养因子，可以上调一些抗氧化蛋白促进神经细胞中的抗氧化过程[15]。因此我们推断，BDNF可能是通过对细胞微管骨架的影响，进而影响神经元的生长及存活状态。正常生理状态下，BDNF可由胶质细胞、颗粒细胞等神经细胞分泌，可与TrkB受体结合，催化与受体相关的细胞内吞活动，促进细胞极性的形成[16]，同时也可以与p75受体结合，增强神经元的突触可塑性。相反，体内BDNF含量的减少，会导致运动、认知以及记忆等功能障碍[17]。 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）37四、结论与展望脑源性神经营养因子BDNF在神经系统的发育和功能中扮演着至关重要的角色。在神经系统发育过程中，BDNF可诱导神经前体细胞的定向分化，促使神经元增生，加快神经元迁移，促进神经系统的成熟和完善。在成体，BDNF则表现出广泛的神经营养和神经保护活性，可以促进神经元对葡萄糖等能量物质的利用，提高细胞酶的活性，对神经元的存活及正常生理功能的维持有着积极的意义[18-21]。BDNF对神经系统产生的生物学效应主要是通过绑定的两种跨膜受体，一种是高亲和力受体TrkB，另外一种是低亲和力受体p75NTR[22]。目前，有许多研究倾向于观察BDNF和TrkB的生理作用以及在阿尔茨海默病、帕金森病或神经损伤中的变化，也有关于脑发育过程中BDNFmRNA表达变化及其机体正常发育过程中BDNF和受体TrkB在小脑时空的分布情况，但未见有系统观察BDNF及其受体TrkB在神经退行性疾病朊病毒病中的作用研究。在本研究中，我们首先验证了在感染羊瘙痒因子263K的仓鼠终末期的脑组织中BDNF蛋白含量显著降低。同时，我们检测到与BDNF相互作用的受体TrkB和磷酸化的p-TrkB及其下游作用的效应物GRB2和p75NTR的表达量在朊病毒感染终末期的仓鼠脑组织中也显著降低。这些实验数据表明了BDNF的下调与朊病毒感染密切相关。相关研究显示，TrkB的细胞外配体结合区与BDNF结合后可使TrkB磷酸化，通过Ras/ERK信号传导通路将细胞外信号传至核内，继而发生一系列底物磷酸化反应，实现从细胞膜到细胞核的信息传递而引起细胞应答效应[23]。Sugimoto等[24]在研究表达TrkB的人成神经细胞瘤的实验中观察，BDNF、NT-4可诱导成神经细胞瘤TrkB磷酸化，激活Ras/ERK信号转导通路，促进细胞增殖。PI3K/AKT信号传导通路与生长因子、细胞因子诱导的细胞增殖、分化有关。而BDNF、TrkB、p-TrkB及其GRB2一系列的下调，对BDNF介导的PI3K/AKT信号传导通路产生抑制，从而引发Ras途径失调，最终发生细胞凋亡。许多细胞培养及动物模型表明，神经营养因子及其受体能防止或抑制各种损害因素引起的神经元细胞萎缩和凋亡，它们引起的分化反应可改变神经元的电生理性质和神经细胞的命运，因此这类因子的失常、不足或缺乏，很有可能导致神经精神疾病[25]。我们的免疫荧光实验结果显示，BDNF阳性细胞颗粒定位在神经元上，而在星形胶质细胞上没有发现共定位表达，强有力的证明了在脑组织中BDNF主要表达在神经元，而且广泛分布于大脑皮层和小脑区域的神经元。结合感染羊瘙痒因子 38内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）263K不同时间点的仓鼠脑组织中BDNF和TrkB蛋白含量在早期就出现下降，最后在终末期都急剧下降，甚至消失的情况，这与神经元的丢失变化趋势非常相似。这个现象不仅提示了BDNF蛋白含量在脑组织中的减少与神经元细胞的丢失相关，更表明BDNF对神经元细胞的功能状态具有一定的作用。有大量证据提示AD病人海马组织、颞叶皮质及其它可能皮质区域有BDNFmRNA及其蛋白降低[26]。也有学者认为AD过程中神经元的丢失，至少部分是由于一种或多种神经营养因子的缺乏，这些神经营养因子的受体TrkA、TrkB、TrkC在AD病人海马神经元中分别下调了69%、47%、49%[27]。有研究发现含TrkB活性的基底前脑神经元在AD病人中有明显下降，且在AD退行性疾病时表达BDNF或TrkB的神经元被破坏[28]。我们应用免疫组织化学方法检测发现朊病毒感染脑组织中小脑和大脑皮层区域BDNF阳性反应产物显著低于正常仓鼠对照组，提示BDNF表达水平及TrkB和p-TrkB蛋白表达水平的改变可能参与了朊病毒感染的早期病理过程。正如AD一样，神经元丢失是朊病毒疾病的标志之一。神经元细胞的广泛丢失通常又伴随着细胞凋亡，与此同时感染朊病毒的个体相应出现认知和记忆障碍。动物学习和记忆神经环路的重要组成部分是中枢胆碱能神经系统，BDNF通过基底前脑胆碱能神经元发出投射纤维，在海马和大脑皮层调节学习记忆。近些年的研究表明海马具有促进基底前脑胆碱能神经元中胆碱乙酰转移酶的活性，保护和延缓基底前脑胆碱能神经元发生退变和死亡的作用，维持老年的记忆能力。BDNF基因敲除小鼠可以观察到空间记忆缺损，记忆的获得与特殊脑区BDNFmRNA及其受体TrkB的活化作用有关。BDNF蛋白的下降可能是神经元萎缩及受体TrkB减少，最终成为胆碱能神经递质的丢失和学习记忆障碍的主要因素。以上种种现象与朊病毒病的病理特征极为相似。因此可以合理的推测，BDNF及其受体TrkB的减少在朊病毒感染中可能会涉及出现突触和认知缺陷。与BDNF蛋白含量在朊病毒感染脑组织期间减少情况不同的是，实验研究发现，在朊病毒感染的细胞系SMB-S15中，BDNF蛋白含量较正常细胞SMB-PS中无明显差异。而且BDNF相关的受体及其下游作用分子在体外细胞实验中也没有朊病毒感染后明显的表达含量变化。本实验表明PrPSc的累积不能显著影响BDNF在朊病毒传播体外细胞水平的表达含量和活性。然而和成熟神经元是终端分化不同的是，SMB-S15细胞是不断复制的。在我们的实验条件下，SMB-S15细胞与SMB-PS细 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）39胞几乎有着相同的增殖生长活性，在SMB-S15细胞中PrPSc稳定复制。但实验数据显示，PrPSc的复制并不影响BDNF和TrkB的表达，而BDNF和TrkB及其相关蛋白分子的表达也不影响PrPSc的复制。我们推测，在朊病毒感染的脑组织中BDNF和TrkB蛋白含量显著减少可能与神经元细胞丢失等某些病理特征的因素相关。BDNF作为脑内重要的神经营养因子，具有多种生物学功能，它能促进多种神经元的存活和生长发育，可提高神经元的生物活性，减少损伤后神经元的自然死亡，还能促进突触的可塑性，改变脑内神经元的形态，增加突触终末的密度和促进树突和轴突的生长[29]；此外BDNF还参与了长时程增强效应和学习的可塑性机制[30],可通过抑制兴奋性氨基酸的细胞毒性，抑制细胞凋亡等途径来保护神经细胞[31]。近几年的实验研究主要报道了BDNF的分布和作用，从我们目前的研究可知，BDNF与朊病毒病感染过程中神经元的丢失有着密切的关系，而对于朊病毒病的致病因子PrPSc的复制并不存在直接关联，BDNF在朊病毒病的发病机制和病理生理过程中到底扮演如何重要的角色，相信随着日后更深入的研究，可以更加明确。BDNF在朊病毒病中的作用机制以及自身所具有的多种生物学功能对朊病毒病是否有更大的影响是我们以后很好的探索方向之一。未来随着基因治疗的出现，是否可以将BDNF基因片段通过载体转染，导入朊病毒感染的动物体内，通过改善BDNF蛋白含量的表达得到有效的治疗，值得我们进一步关注与探索。 40内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）参考文献[1]RiekR,HornemannS,WiderG,etal.NMRstructureofthemouseprionproteindomainPrP(121-231)[J].Nature,1996,382:180-182.[2]StahlN,BaldwinMA,HeckerR,etal.Glycosylinositolphospholipidanchorsofthescrapieandcellularprionprotein.Biochemistry,1992,31:5043-5053.[3]BorcheltDR,ScottM,TaraboulosA,etal.Scrapieandcellularprionproteinsdifferintheirkineticsofsynthesisandtopologyinculturedcells[J].JCellBilo,1990,110(3):743-752.[4]韩一芃,陈广洁.朊病毒及其相关疾病的免疫学研究.生命的化学,2008,28(2):186-187.[5]GaggelliE,KozlowskiH,ValensinD,ValensinG(2006)Copperhomeostasisandneurodegenerativedisorders(Alzheimer's,prion,andParkinson'sdiseasesandamyotrophiclateralsclerosis).ChemRev106(6):1995-2044.[6]KozlowskiH,LuczkowskiM,RemelliM(2010)Prionproteinsandcopperions.Biologicalandchemicalcontroversies.DaltonTrans39(28):6371-6385.[7]McTigueDM,HornerPJ,StokesBT,etal.Neurotrophin-3andbrain-derivedneurotrophicfactorinduceoligodendrocyteproliferationandmyelinationofregeneratingaxonsinthecontusedadultratspinalcord.JNeurosci,1998,18:5354-5365.[8]MEAKINSO,SHOOTEREM.Thenervegrowthfactorfamilyofreceptors[J].TrendsNeurosci,1992,15:323-331.[9]ConnorB,YoungD,YanQ,etal.Brain-derivedneurotrophicfactorisreducedinAlzheimer’sdisease.BrainResMolBrainRes,1997,49:71-81.[10]YipK,JohnsonJEM.Developingdorsalrootganglionneuronsrequiretrophicsupportfromtheircentralprocesses:evidenceforaroleofretrogradelytransportednervegrowthfactorfromthecentralnervoussystemperiphery[J].ProcNatlAcadSciUSA,1984,81:6245.[11]OkunoS,SaitoA,HayashiT,etal.TheC-JunN-terminalproteinkinasesignalingpathwaymediatesbaxactivationandsubsequentneuronalapoptosisthroughinteraction 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）41withbimaftertranscientfocalcerebralischemia[J].JNeurosci,2004,24(36):7879-7887.[12]HenniganA,TrotterC,KellyAM.Lipopolysaccharideimpairslong-termpotentiationandrecognitionmemoryandincreasesp75NTRexpressionintheratdentategyrus[J].BrainRes,2007,1130(1):158-166.[13]ZoladzJA,PilcA.Theeffectofphysicalactivityonthebrainderivedneurotrophicfactor:fromanimaltohumanstudies[J].JournalofPhysiologyandPhamacology,2010,61(5):533-541.[14]TolwaniRJ,BuckmasterPS.VarmaS,etal.BDNFoverexpressionincreasesdendritecomplexityinhippocampaldentategyrus[J].Neuroscience,2002,114(3):795-805.[15]GardinerJ,BartonD,OverallR,MarcJ.2009.Neurotrophicsupportandoxidativestress:convergingeffectsinthenormalanddiseasednervoussystem.[16]StadelmannC,KerschensteinerM,MisgeldT,etal.BDNFandgp145trkBinmultiplesclerosisbrainlesions:neuroprotectiveinteractionsbetweenimmuneandneuronalcells?[J].Brain,2002,125(Pt1):75-85.[17]CanalsJM,PinedaJR,Torres-PerazaJF,etal.Brain-derivedneurotrophicfactorregulatestheonsetandseverityofmotordysfunctionassociatedwithenkephalinergicneuronaldegenerationinHuntington’sdisease[J].JNeurosci,2004,24(35):7727-7739.[18]GorskiJA,ZeilerSR,TamowskiS,etal.Brain-derivedneurotrophicfactorisrequiredforthemaintenanceofcorticaldendrites[J].Neurosci,2003,23(17):6856-6865.[19]GlassDJ,YancopoulosGD,Theneurotrophinsandtheirreceptors[J].TrendsCellBiol,1993,3:262-279.[20]BlanquetPR,LamourY.Brain-derivedneurotrophicfactorincreasesCa2+/Calmodulin-dependentproteinkinase2activityinHippocampus[J].BiolChem,1997,270:231-233.[21]CrollSD,NancyY,RonaldM,etal.ExpressionofBDNFandtrkBasafunctionofageandcognitiveperformance[J].BrainRes,1998,812(122):200-218. 42内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）[22]ReichardtLF.Neurotrophin-regulatedsignallingpathways.PhilosTransRSocLondBBiolSci2006;361:1545-1564.[23]AlmeidaRD,ManadsBJ,MeloCV,etal.NeuroprotectionbyBDNFagainstglutamateinducedapoptoticcelldeathismediatedbyERKandPI3-kinasepathways[J].CellDeathDiffa,2005,12(10):1329-1343.[24]SugimotoT,IkurodaH,HoriiY,etal.SignaltransductionpathwaysthroughTRK-AandTRK-Breceptorsinhumanneuroblastomacells[J].JCancerRes,2001,92(2):152-160.[25]中华医学会精神科分会，南京医科大学脑科医院.中国精神疾病分类方案与诊断标准.南京:东南大学出版社,1995:64-65.[26]GarzonD,YuG,FahnestockM.Anewbrain-derivedneurotrophicfactortranscriptanddecreaseinbrain-derivedneurotrophicfactortranscripts1,2and3inAlzheimer’sdiseaseparietalcortex[J].Neurochemistry,2002,82(5):1058-1064.[27]HockC,HeeseK,HuletteC,etal.Region-specificneurotrophinimbalancesinAlzheimer’sdisease:decreasedlevelsofbrain-derivedneurotrophicfactorandincreasedlevels[J].ArchNeurol,2000,57(6):846-851.[28]SoontornniyomkijV,WangG,PittmanCA,etal.Absenceofbrain-derivedneurotrophicfactorandtrkBreceptorimmunoreactivityingliaofAlzheimer’sdisease[J].ActaNeuropathologica,1999,98(4):345-348.[29]MertzK,KoscheckT,SchillingK.Brainderivedneurotrophicfactormodulatesdendriticmorphologyofcerebellarbasketandstellatecells:Aninvironstudy[J].Neurscience,2000,97(2):303-310.[30]FigurovA,PozzoMillerLD,OlafssonP,etal.RegulationofsynapticresponsestohighfrequencystimulationandLTPbyneurotrophinsinthehippocampus[J].Nature,1996,381(6584):706-709.[31]孙继虎,严晓晴,肖杭,等.脑源性神经营养因子对海马神经元NMDA受体功能下调的逆转作用[J].中国神经科学杂志,2000,16(4):349-351. 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）43文献综述脑源性神经营养因子与神经退行性疾病的关系研究进展摘要：脑源性神经营养因子(Brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)是一类广泛分布于成年哺乳动物脑内的神经营养因子类物质。它对维持周围和中枢神经元的存活、生长、分化及神经损伤后的修复与再生具有十分重要的意义[1]。阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease，AD)是一类多发生在老年的神经退行性疾病，临床特点是逐渐出现记忆力减退、认知功能障碍、行为异常和社交障碍，以老年斑(SP)、神经元纤维缠结(neurofibrillartangles，NFT)为主要病理改变。近年研究发现脑内脑源性神经营养因子BDNF及其受体TrkB水平的下降与阿尔茨海默病（AD）的发病密切相关，并取得了显著的进展，现综述如下。关键词：脑源性神经营养因子（BDNF）；阿尔茨海默病（AD）；TrkBAbstract:Brain-derivedneurotrophicfactor（BDNF）isakindofnevergrowthfactorwidelydistributedintheadultmammalianbrain.Itisveryimportanttomaintaintheperipheralandcentralneuronsofsurvival,growth,differentiationandtherepairandregenerationafternerveinjury[1].Alzheimer'sdisease(AD)isakindofmainlyoccuredintheelderly,theclinicalcharacteristicsisgraduallyappearmemoryloss,cognitivedysfunction,abnormalbehaviorandsocialdisorder,withsenileplaques(SP)andneurofibrillarytangles(NFT)asthemainpathologicalchanges.RecentstudieshavefoundthatbrainderivedneurotrophicfactorBDNFinthebrainanditsreceptorTrkBdeclinedandcloselyrelatedwiththeonsetofAlzheimer'sdisease,whichmadesignificantprogress,issummarizedasfollows.Keywords:BDNF;Alzheimer’sdisease(AD);TrkB神经系统变性疾病是一组由慢性进行性的中枢神经组织退行性变性而引起的疾病的总称，病理上以脑或脊髓发生神经元退行变性、死亡为特征。神经系统退行性 44内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）疾病严重威胁患者生命，目前尚无有效的治疗手段。有研究表明，许多中枢神经系统变性疾病，如阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）、帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）及亨廷顿病（Huntington’sdisease,HD）等都伴有免疫功能的异常。1、脑源性神经营养因子BDNF及其受体1.1BDNF的结构、功能及应用脑源性神经营养因子(Brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)是神经营养因子家族成员之一，在中枢神经系统发育过程中对神经元的生存、分化、生长起重要作用，并对机体正常生理功能的维持具有重要的意义。BDNF是1982年由德国神经生物学家Barde及其同事首次从猪脑中纯化并发现具有防止神经元死亡功能的一种碱性蛋白质。BDNF分子单体是由119个氨基酸残基组成的分泌型成熟多肽，前体蛋白含有274个氨基酸残基，成熟BDNF的活性形式为稳定的非共价键连接同源二聚体，分子量27ku[2]。1991年Ozceiik[3]等证实人BDNF基因位于11g13。BDNF在成年哺乳动物脑内广泛表达，免疫组织化学法还发现，中枢神经系统和周围神经系统的多种神经元及神经胶质细胞都有BDNFmRNA和蛋白质的表达，其免疫阳性神经元广泛分布于大脑皮层、海马、基底前脑、纹状体、隔区、下丘脑和小脑。另外，在外周的心脏、肺、骨骼肌和坐骨神经也检测到BDNFmRNA的存在。在神经系统发育过程中，BDNF可诱导神经前体细胞的定向分化，促使神经元增生，加快神经元迁移，促进神经系统的成熟和完善。在成体，BDNF则表现出广泛的神经营养和神经保护活性，可以促进神经元对葡萄糖等能量物质的利用，提高细胞酶的活性。对神经元的存活及正常生理功能的维持有着积极的意义[4-7]。近年来研究发现，BDNF有对缺血性脑病、阿尔茨海默病、帕金森病、精神分裂症及其他神经系统疾患所致的神经损伤具有治疗作用。并且与记忆学习、癫痫和抑郁的发生等有密切的关系。前脑胆碱能神经元的退变以及皮质和海马乙酰胆碱（Ach）的减少是老年性痴呆（AD）最为突出的特征，海马N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体功能低下与老年痴呆及老年性记忆功能减退等均密切相关[8]。基底前脑胆碱能神经元是学习记忆神经环路的重要组成部分，能与大脑皮质及海马神经元构成广泛的神经纤维投射联系。BDNF通过支持前脑胆碱能神经元来影响学习记忆功能。另外的研究表明，BDNF通过增强NMDA受体的磷酸化，能迅速增加神经元之间的突触传递和NMDA受体活性，能调节海马的突触传递，诱导长时程增强效应（LTP），突触后的NMDA受体酪氨酸 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）45磷酸化在调节海马的长时程增强效应及突触传递可塑性中起着关键作用。BDNF的含量在AD时减少，那么补充适当的BDNF能否改善或治疗AD所致的学习记忆障碍，目前尚未有来自临床的实验报道。因此，在神经系统疾病，尤其是神经退行性疾病及精神病中，BDNF具有重要作用，而它潜在的治疗作用也受到了广泛的重视。另一方面，病理状态下，尤其是神经变性疾病中，以T细胞、巨噬细胞为代表的免疫细胞成为除神经元外，产生BDNF的又一主要来源。已有研究在神经变性疾病伴发的炎性反应中，发现BDNF与疾病细胞生存、凋亡相关的病理生理过程密切相关，并受到众多关注。1.2BDNF的受体BDNF发挥其生物学作用有赖于与其特异性受体结合，BDNF受体可以分为低亲和力受体（p75NTR）和高亲和力受体（Trk）。其中p75NTR是分子量为75kD的跨膜糖蛋白，在结构上类似肿瘤坏死因子超家族。p75NTR作为神经营养因子的受体之一，主要在神经细胞的早期发育过程中丰富表达，通过不同的信号转导通路诱导以神经细胞为主的细胞增殖、迁移、分化、生存、凋亡、突触的建立和神经的形成，发挥多重生物学效应。p75NTR基因位于17q12-17q22，包括6个外显子，分子量为75kD，启动子序列在鼠和人有高度的相似性。p75NTR由1个信号肽、4个半胱氨酸富集的胞外域、疏水的跨膜区以及1个富含碱性氨基酸的胞内域组成，属于I型膜蛋白，缺乏酶活性。其胞外域由4个半胱氨酸富集重复序列区（CRDs）组成，每个含6个半胱氨酸，并经N-与O-糖基化的翻译后修饰，第2个重复序列是结合NTs所必需的。疏水的跨膜区由含22个氨基酸的单链组成，与p75NTR的磷酸化有关。p75NTR与肿瘤坏死因子I和II受体、人细胞表面抗原Fas（ApoI）、B细胞抗原CD40有顺序的同源性，可调控细胞的死亡。实验证明在无Trk受体存在时，p75NTR有促进细胞凋亡的作用，在Trk受体存在时，p75NTR参与高亲合位点的形成，并增强Trk受体在不同时间、不同组织表达的阶段特异性和组织特异性，在BDNF作用时不是必需的。Trk受体家族包括TrkA（主要结合NGF，NT3）、TrkB和TrkC（相对特异的结合NT3）。而其中TrkB作为BDNF的功能性受体，与BDNF和NT4/5特异性结合且是BDNF发挥其生物学作用所必需的。TrkB主要表达于大脑皮层、嗅球、海马、丘脑、黑质、下丘脑、齿状回、纹状体、隔膜、基底核、小脑、脑干、脊髓运动神经元、脑干感觉核这些部位。BDNF在海马和皮层表达含量很高，此外在视网膜、肾脏、前列腺中 46内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）也有表达。1.3BDNF参与的信号转导通路BDNF与TrkB结合形成的BDNF-TrkB通路牵涉更多的大脑功能：神经元存活、轴突生长、细胞迁徙、调节神经兴奋性与抑制性的平衡等[9]。近年来的研究表明，BDNF主要通过与TrkB受体结合后激活两条细胞内信号传导通路：细胞外信号激酶(extraeellularsignal-regulatedkinase1/2，ERKl/2)信号通路[10]和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K/AKT)信号通路[11-12]而发挥神经保护机制。ERK信号通路主要激活有丝分裂蛋白激活酶进一步作用于如Elk-l等转录因子而增加突触生长防止神经元凋亡，同时其还能激活CREB而引起一系列表达反应，产生一些抗凋亡蛋白如Bcl-2等，而发挥抗凋亡作用。PI3K/AKT信号通路中，BDNF与TrkB结合以后，导致受体分子的二聚体化，TrkB的胞内区域具有内在的酪氨酸激酶活性，两者结合后激活胞内区域，引起TrkB自身磷酸化作用增强，发生自身磷酸化和磷酸化生长因子受体接头蛋白（growthfactorreceptorboudprotein2，GRB2）和鸟苷酸释放因子（sonofsevenless，SOS）等。磷酸化的TrkB与GRB2-SOS复合物结合，随之激活一些小G蛋白，包括Ras蛋白（ratsarcoma，Ras）和Raf-1等，相继激活PI3K/AKT信号通路，通过下调GSK3β、Bad、Fasl等促凋亡蛋白而发挥抗凋亡作用，来促进神经细胞生存，增加突触可塑性。这些通路除了参与促进神经元细胞发育、分化、再生以外，对神经元的存活、突触可塑性及形态学改变起着很重要的作用。此外，BDNF在一些条件下还可与较低亲和力的p75受体结合后激活C-Jun氨基末端激酶(C-Jun-N-terminalkinase，JNK)信号通路[13]发挥诱导细胞凋亡的作用。同时有研究表明BDNF前体蛋白（brain-derivedneurotrophicfactorprecursor，pro-BDNF）可能也有重要的作用，DicouE[14]的研究表明BDNF前体蛋白与其它的神经营养因子一样能与p75受体及穿膜神经肽受体(sortilin)结合引起细胞凋亡，故认为是否由前体生成BDNF对细胞的存亡有重要作用。更多的研究表明，pro-BDNF在体内除用于合成成熟型脑源性神经营养因子（matureformofbrain-derivedneurotrophicfactor，mBDNF）外，其本身作为具有生物活性的独立蛋白分子，也在神经系统内发挥重要的生理功能[15]，参与了精神性疾病、老年退行性脑疾病的发生，并且是神经元突触可塑性、学习记忆形成过程中重要的蛋白质分子。TengHK等[16]的研究表明重组的BDNF前体蛋白能通过与p75受体结合发挥诱导培养的交感神经元细胞凋亡，BDNF前体蛋白也 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）47在逐渐受到人们的关注和重视。1.4BDNF与神经元突触功能突触作为神经元之间传递信息的结构，由突触前膜，突触间隙和突触后膜组成。神经元以突触形式形成复杂的神经元网络，在中枢神经系统生理和病理过程中发挥重要作用。突触的结构或者功能的异常常导致多种精神及神经功能障碍性疾病，如孤独症，成瘾症及阿尔茨海默病等。临床病理研究也显示智力缺陷患者的大脑突触形态发育明显障碍。突触的形成受多种因素调节，如Ephrins，integrin，星形胶质细胞，施旺细胞和神经生长因子等。脑源性神经营养因子（Brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF）作为神经生长因子家族中的重要成员，目前已经有大量的研究证实BDNF参与突触形成的调节，但机制存在多样性。LuikartB等人发现，BDNF短时间作用于神经元，通过TrkB/PI3K（Tyrosine-relatedkinaseB/Phosphatidylinositide3-kinase）通路增加突触的数目，而AlonsoM等人发现BDNF长时间作用于神经元（12-24h）则是通过TrkB/ERK1/2（extracellularregulatedproteinkinase）通路调节突触形成。此外，BDNF还可通过干扰cadherin-β-catenin的结合，促进突触形成；通过影响海马和皮层神经元的胆固醇生物合成，促进脂筏中的突触蛋白的合成等。突触可塑性主要表现形式是长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）现象。LTP是突触可塑性研究最多的一种，BDNF与LTP诱导和维持有关。TrkB和p75均与活性依赖突触可塑性有关，实验表明，BDNF是活性依赖性突触可塑性的重要调节因子。神经递质释放对突触可塑性起至关重要的作用，尤其是谷氨酸能神经元之间的突触。BDNF能增强去极化诱导的谷氨酸的释放，其中MAPK/ERK通路激活与BDNF依赖的谷氨酸释放有关系。Kumamaru等进一步验证了BDNF增加MAPK依赖的突触蛋白Ⅰ的磷酸化，并诱导谷氨酸释放，给予MAPK抑制剂很明显地减少了突触蛋白Ⅰ磷酸化和随后的谷氨酸释放。2、阿尔茨海默病概述2.1AD简介阿尔茨海默病（AD），又称老年性痴呆，是1907年由德国精神病学家和神经解剖学家Alzheimer描述并命名的，是一种以进行性认知功能障碍和记忆能力损害为主的中枢神经系统退行性疾病。随着社会人口趋向老龄化，其发病率呈逐年增长趋势，AD已成为一种严重危害人类健康的疾病，也越来越受到社会各界广泛的关注，但迄 48内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）今为止，人们尚未明确AD的病因和发病机制，更没有有效的治疗方法。AD病变之一为进行性大脑皮层及皮层下的神经元的退行性变，而大量的神经元丢失被认为是引起患者认知能力障碍的原因之一。国外调查研究显示，65岁以上老年人群中AD患病率为2%～4%，而在85岁以上的老年人群中，AD患病率可高达20%以上[17]。国内资料显示，55岁及其以上人群中AD患病率为0.07%～5.98%，65岁及其以上人群中AD患病率为0.33%～5.82%，75岁以上为3.94%[18]。AD在发达国家已经成为仅次于心血管病、肿瘤和脑卒中而位居第4位的致死原因。2.2AD的发病机制AD的典型病理特征包括脑神经细胞外的β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集的老年斑(SP)、神经元内的神经纤维缠结（NFT）、脑皮质神经元细胞的减少等。其发病机制主要是：Tau蛋白高度磷酸化并在缠结神经元处堆积；β-淀粉样蛋白产生的不可溶淀粉蛋白原纤维形成，早期沉积在淀粉样斑块处，淀粉样斑块在神经元内或者附近，大都是密集的不可溶的斑片状[19]。近几年科研人员进行了大量关于AD发病机制的研究，取得了显著的进展。AD的主要脑病理改变是NFT和SP，且前者与AD临床痴呆症状呈相关关系。NFT的主要成分是以成对双螺旋丝样结构（pairedhelicalfilament,PHF）形成聚集的异常磷酸化的tau蛋白。当tau蛋白发生高度磷酸化、异常糖基化、异常糖化以及泛素蛋白化时，tau蛋白失去对稳定微管的束缚，神经纤维退化，产生AD。实验证明，体内蛋白磷酸激酶-2A、蛋白磷酸激酶-2B和蛋白磷酸激酶-1可能参与tau蛋白异常磷酸化过程，保持这些磷酸酯酶的活性有可能抑制AD神经原纤维退化。神经元内存在的多种蛋白激酶在体外均可使重组tau蛋白发生磷酸化，其中cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）通过参与tau蛋白的磷酸化、细胞质中某些调节蛋白的磷酸化、及特定核转录因子的磷酸化等而参与AD的发病机制。磷酸酶可从结构和功能上直接抑制和逆转AD的神经元变性，而糖苷酶可促进磷酸酶对AD脑损伤的保护作用。更深入的研究发现可能tau蛋白的丝氨酸-262/356（Ser-262/356）位磷酸化与动物的学习记忆障碍相关。而另一项实验结果则指出tau蛋白Ser-235位的磷酸化不是决定其功能的关键位点，苏氨酸-231（Thr-231）的磷酸化可能与微管组装早期的成核聚集作用有关。此外，tau蛋白的沉积与Aβ40的数量和载脂蛋白E4（apoEA）等位基因的表达密切关联，而与Aβ42（43）的数量是没有关系的。Aβ的神经毒性作用已经被公认是AD形成和发展的关键因素，其具体机制包括破坏细胞内Ca2+稳态，促进自由基的 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）49生成，降低K+通道的功能，增加致炎细胞因子引起的炎症反应，激活补体系统，增加脑内兴奋性氨基酸（主要是谷氨酸）的含量等。有人总结说Aβ的神经毒性表现在两方面，一是放大各种伤害刺激如低血糖、兴奋毒素、自由基等的细胞损伤效应，二是直接的细胞毒性。此外小鼠脑中Aβ沉积与载体中的抗坏血酸有关，亦可能与五肽酰胺有关。另有研究指出，在AD病理过程中，Aβ含量增高可能与多肽生长因子有密切关系。但随着AD的进展和痴呆程度的加深，Aβ含量是呈降低趋势的。近年来研究表明，Aβ聚集能活化小胶质细胞（microglia,MG）和星形胶质细胞，引起炎症反应和神经毒性作用，是AD发病的核心机制。在AD的淀粉样斑块中发现反应性小胶质细胞，提示脑组织中有炎症反应。AD另一个病理特征是活化的小胶质细胞，是神经元死亡的初期形式。小胶质细胞与血液中的单核细胞、肝脏中的库普弗细胞、肺脏中的尘细胞等均属单核巨噬细胞系统，具有吞噬、分泌功能和免疫调节与监视功能在维护内环境稳态和许多疾病的发生、发展中发挥重要作用。2.3AD与Aβ的相互作用Aβ是AD病理的关键分子[20]，Aβ是淀粉样蛋白前体（amyloidprecursorprotein，APP）的蛋白水解产物。APP参与神经元的生长存活，以及神经元的损伤后再修复[21-22]。β-分泌酶裂解APP得到可溶性淀粉状蛋白前体蛋白β（solubleamyloidprecursorproteinβ，sAPPβ）和羧基端C99，γ-分泌酶裂解C99得到Aβ和AICD，此通路产生有毒性的Aβ[23]。同时APP能被α-分泌酶裂解产生可溶性淀粉状蛋白前体蛋白α（solubleamyloidprecursorproteinα，sAPPα）和C83，γ-分泌酶裂解C83产生P3和AICD，此通路无毒性物质产生[24]。Aβ由健康神经元和非神经元细胞产生，在正常的生理过程，LDL受体蛋白（LRPl）运输Aβ通过血脑屏障[25]。在AD患者脑内，该运输过程被干扰，导致Aβ大量沉积在脑内[26]。最近有研究表明淀粉状蛋白沉积物先于认知功能障碍出现[27-28]。APP的毒性蛋白裂解产物Aβ的沉积是AD发病机制的核心[29-31]，它导致突触动能障碍，神经元死亡，因此能影响APP代谢及突触功能的蛋白会很可能与AD的发病机制有关系。3、BDNF与AD的关系3.1BDNF在AD中的表达含量变化BDNF作为神经营养因子，在中枢神经系统发育过程中对神经元的生存、分化、生长及维持神经元正常的生理功能起关键作用。近年来的研究表明，在AD发病过程 50内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）中，BDNF表达含量的变化和功能与AD的发病密切相关。Michalski等[32]证明AD患者海马和大脑皮质中BDNFmRNA的表达降低。MufsonEJ等[33]发现在AD患者前期（Mildcognitiveimpairment，MCI）就有BDNFmR-NA的降低，同时发现在MCI和AD期时胆碱能神经元与（Nocognitiveimpairment，NCI)期相比明显受损并推测可能是BDNF等减少及功能的降低导致的。同时也有大量证据提示AD病人海马组织、颞叶皮质及其它可能皮质区域有BDNFmRNA及其蛋白降低[34]。Garzon等[35]的研究表明AD患者的BDNF的转录物I，II，IV与对照组相比明显下降。Durany等[36]却发现AD患者的海马及顶叶BDNF的表达是增加的，推测可能是AD神经元的变性及退化可能激发了代偿机制而使BDNF过度表达，但随着神经元功能的不断降低BDNF的表达最终将降低。Hock等[37]检测了AD患者和正常个体海马、额叶、顶叶和小脑中BDNF及其他一些NTF（NGF、NT-3、NT-4/5）的水平。结果发现AD患者海马和顶叶BDNF的蛋白水平明显降低。BDNF/NT-3比值（NT-3水平在各脑区都没有明显变化）在额叶和顶叶也出现明显的降低。Hock认为BDNF水平降低影响了神经元的营养供应，与特定脑区的神经元变性有关，其中包括基底前脑的胆碱能神经系统。3.2BDNF受体在AD中的表达含量变化Croll等[38]检测了低龄和高龄Sprague-Dawley大鼠脑力BDNF和TrkB受体的表达。结果发现，高龄鼠中脑BDNF蛋白含量下降，脑桥部BDNF的mRNA量下降，TrkB的mRNA量在多个脑区下降。高龄鼠TrkBmRNA低比BDNF的减低更为广泛，BDNF的减低更多地局限于一些尾侧脑区。针对AD中各个脑区BDNF含量的变化的研究表明，海马、颞叶、顶叶、内嗅皮层等多个部位的BDNFmRNA和蛋白水平出现下降[39-43]。实验者还通过Morris水迷宫检验实验动物的认知能力。结果表明，脑桥部较低的TrkBmRNA含量与高龄鼠的记忆减退关系最密切。因此在AD患者脑内BDNF受体变化的影响也是至关重要的。Ferrer等[44]检测了AD患者和对照个体额叶和海马内BDNF和全长、截断型TrkB受体的蛋白表达。结果Westernblot发现AD患者额叶BDNF和全长TrkB表达减低而截断TrkB表达升高。免疫组化也显示神经元内BDNF和全长TrkB免疫活性降低。BDNF水平降低同时发生于NFT和非缠结的神经元中。全长TrkB免疫活性在NFT中水平明显降低，而在颗粒空泡变性（GD）的神经元中只有轻微降低。老年斑周围存在营养障碍轴突中出现强BDNF免疫活性，而TrkB高表 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）51达出现于反应性神经胶质细胞。截断TrkB免疫活性在皮质和白质的单个神经元和反应性神经胶质细胞中发现。老年斑中截断TrkB受体呈高水平，这可能与AD发病过程中β-淀粉样蛋白(Aβ)的沉积有关[45]。3.3Aβ对BDNF的作用近年来的研究表明，Aβ（β-amyloidpeptide，Aβ)可能是BDNF的表达和功能降低的重要原因。DiegoJ等[46]通过免疫印迹法和RT-PCR发现低聚物状态的Aβ就可降低培养的人成神经母细胞瘤细胞的磷酸化cAMP效应元件结合蛋白（PhosphorylationcAMPresponseelement-bindingprotein，pCREB）的含量，而pCREB可上调BDNF的表达。同时也减少了BDNFmRNA的总量，特别是BDNF转录物IV、V的水平。LiqiTong等[47]通过PCR和免疫印迹法的研究表明较低剂量的Aβ就能降低BDNF的功能。在AD的发生过程中，由于神经元的丢失及产生的Aβ可能降低BDNF的功能及其表达，而加重AD患者的神经元凋亡、神经元丢失受损、降低突触的可塑性、影响LTP、加重认知记忆障碍。这些结果加重了AD的病理改变及临床症状。4、BDNF与其它神经系统疾病4.1BDNF和精神疾病有报道显示，在一些患有精神疾病患者中，如精神分裂症、双相情感障碍和产生抑郁，BDNF水平减少，这些病人除了神经元萎缩，多伴有脑容量体积减少[48]。BDNF与精神分裂症发病的病理生理学基础有关，TanYL[49]等研究发现，接受非典型或典型安定药物治疗的慢性精神分裂症患者，其血清BDNF样免疫反应性显著降低，但其远期效应还有待进一步研究。近来，国内外研究发现BDNF可能参与抑郁症的发病和治疗过程，抑郁症的症状是散失几乎所有的兴趣与爱好，而且长期处在一种焦虑、内疚的情绪之中[50]，而严重的抑郁症甚至导致患者的致残率及致死率增加。LangUE等研究显示，BDNF的等位基因VaI66Met多态性与精神病中的燥狂和抑郁个性特点有关[51]。Campbell等[52]观察到严重抑郁患者，其海马和杏仁核体积显著减少，逐渐给予抗抑郁药物治疗可以增加脑内BDNFnRNA水平。4.2BDNF和脑缺血脑血管疾病是危害人类生命和健康的主要疾病之一，缺血性脑血管病约占全部脑血管患者的70%-80%。脑缺血后神经干细胞的分化与脑内微环境密切相关。脑缺血可诱导产生许多神经营养因子，它们可以与神经干细胞上的相应受体结合激活细 52内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）胞内的信号系统，从而促进其分化，部分地替代和修复受损的神经元，从而在一定程度上改善神经功能缺损。脑缺血损伤时，BDNF及其受体TrkB表达均增加，BDNF与TrkB相结合，产生相应的效应分子而对缺血神经元起保护作用[53-55]。Kokaia等[56]利用阻塞大鼠一侧大脑中动脉的模型，采用原位杂交方法检测缺血后BDNF基因表达变化，发现阻塞大脑中动脉15min可诱导BDNFmRNA阻塞侧缺血外围区的扣带回表达增加。VD（血管性痴呆）是一种以脑血管缺血性损害为主要原因的疾病，导致中老年患者学习、认知和记忆障碍。BDNF广泛分布于大脑中，可促进神经元生长、分化，保护神经元对抗缺血、缺氧等病理损害。实验证明，慢性脑灌注不足可导致各脑区BDNF表达减少，与实验性大鼠的学习、记忆能为相关，并认为与认知功能关系密切的大脑组织结构如海马及额、颞叶皮层等区域BDNF表达的减少可能在VD的形成中起重要作用。4.3BDNF和帕金森病帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）是一种常见于中老年人的中枢神经系统变性疾病，其病理基础是中脑黑质多巴胺（dopamine，DA）能神经元慢性进行性退变、坏死，临床主要表现为静止性震颤及运动减退。BDNF是DA神经元的营养因子，因此在PD的发病中起一定作用。有学者认为含BDNF多态性基因Val（66）Met的人群相对容易罹患PD，但该观点并未得到广泛认可。BDNF在PD治疗中的作用受到广泛重视，对于早期或潜在的PD患者，给予BDNF可延长DA神经元的存活时闻，促进其功能的修复和维持，使病情得到缓解或逆转。对于中晚期PD患者，可挽救残存的DA神经元，促进其再生，并发挥功能代偿作用，在一定程度上起到缓解病情、减轻症状的作用。目前，临床上治疗的难点是不能阻止DA能神经元的进行性丢失，无法控制疾病的进行性发展。BDNF、TrkB的研究为PD的治疗开辟了新思路。BDNF已经被证明在体外或活体都可以促进中脑多巴胺神经元的生存和分化。研究发现，PD患者黑质纹状体DA能神经元分布区BDNF的浓度明显低于正常对照组，可见BDNF浓度的改变与PD的发病即DA能神经元的退行性变有着某种关联。vonBohlen等[57]研究表明，当TrkB受损时，或者数量减低时，小鼠大脑中变质退化的黑质体多巴胺神经元会增加。这说明TrkB浓度或数量的改变与PD的发病即DA能神经元的退行性变也有着某种关联。4.4BDNF和脑卒中 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）53脑卒中是目前全球性健康问题，也是导致成年人残疾的一项重要原因。近年来，BDNF越来越多的在缺血性脑卒中动物模型中展开研究，并研究显示卒中后BDNF水平升高，提示BDNF可能参与了卒中之后的修复。BDNF是神经营养因子家族中的主要成员，可以通过与其高亲和力受体TrkB结合发挥一系列生物学效应来改善神经元的可塑性，延缓神经细胞的死亡，诱导神经再生，刺激神经的存活。但是否能以BDNF血清水平诊断缺血性脑卒中成为了近期争论的焦点，Béjot等通过动物实验发现，在缺血性脑卒中的动物模型中，脑组织BDNF水平的改变与血清或血浆中BDNF水平的改变无明显的平行关系，卒中后脑组织的BDNF水平升高，而血液中的BDNF水平无显著改变，且并未发现卒中动物模型循环血BDNF水平与脑组织BDNF水平具有相关性，但其指出在急性期，血清BDNF水平与脑卒中的严重情况呈正相关。5、总结与展望综上所述，BDNF是一种作用广泛而有效的神经营养因子，对多种神经退行性疾病具有重要的意义。AD患者脑内BDNF和TrkB表达含量都降低，BDNF能减轻Aβ对神经元毒性作用，但是究竟是BDNF水平降低引发AD，还是AD发生后继发BDNF的水平降低目前尚不能确定。可能增加AD患者脑内BDNF是治疗AD的一种方法，抑制Aβ对BDNF功能及表达的影响可能是一种新的药物治疗途径。随着基因治疗的出现与发展，借助于基因工程手段，将表达BDNF的基因片段通过载体转染导入表达细胞，种植于AD患者脑内的特定部位，在局部源源不断地提供营养因子，免去给药的诸多不便。随着BDNF的深入研究，我们也将会越来越多地发现BDNF对其他疾病发生、发展与治疗的重要意义，势必将为我们提供广阔的研究前景。参考文献[1]Tapia-ArancibiaL,AliagaE,SilholM,eta1.NewinsightsintobrainBDNFfunctioninnormalagingandAlzheimerdisease[J].BrainRes,2008,59:201-220.[2]MariniAM,JiangX,WuX,etal.Roleofbrian-de-rivedneurotrophicfactorandNF-kappaBinneuronplasticityandsurvival;Fromgenestophenotype[J].RestorNeurol 54内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）Neurosci,2004,22(2):121-130.[3]OzceIikT,RosenthalA,FoanckeU,etaI.ChromosomalmappingofBrainderivedneurotrophicfactorandneurotrophin-3geneinmanandmouse[J].Genomics,1991,10(3)：569.[4]GorskiJA,ZeilerSR,TamowskiS,etal.Brain-de-rivedneurotrophicfactorisrequiredforthemaintenanceofcorticaldendrites[J].Neurosci,2003,23(17):6856-6865.[5]GlassDJ,YancopoulosGD.Theneurotrophinsandtheirreceptors[J].TrendsCellBiol,1993,3:262-279.[6]BlanquetPR,LamourY.Brain-derivedneurotrophicfactorincreasesCa2+/Calm-odulin-dependentproteinkinase2activityinHippocampus[J].BiolChem,1997,270:241-233.[7]CrollSD,NancyY,RonaldM,etal.ExpressionofBDNFandtrkBasafunctionofageandcognitiveperformance[J].BrainRes,1998,812(122):200-218.[8]FurukawaK.SecretedamyIoidprecursorproteinαselectiveIysuppressN-methyl-D-aspartatecurrentsinhippocampalneurons:involvementofcyclicGMP[J].Neuro-science,1998,83:429-438.[9]YoshiiA,Constantine-PatonM.PostsynapticBDNF-TrkBsignalinginsynapsematu-ration,plasticity,anddisease.DevNeurobiol,2010,70:304-322.[10]SzatmariE,KalitaKB,KharebavaG,eta1.Roleofkinasesup-pressorofRas-1inneuronalsurvivalsignalingbyextracellu-larsignal-regulatedkinase1/2[J].Neur-osci,2007,27(42):11389-1l400.[11]RosslerOG,GiehlKM,ThielG.Neuroprotectionofimmortalizedhippocampalneuronesbybrain-derivedneurotrophicfactorandRaf-1proteinkinase:roleofextracellularsignal-regulatedproteinkinaseandphosphatidylinositol3-kinase[J].Neurochem,2004,88(5):1240-1252.[12]BahariaM,RenataB,IsabelleB,eta1.Glialcellline-derivedneurotrophicfactor-stimulatedphosphatidylinositol3-kinaseandAktactivitiesexertopposingeffectsontheERKpathway[J].BiologicalChem,2001,276(48):45307-45319.[13]VolosinM,SongW,AlmeidaRD,eta1.Interactionofsurvivalanddeathsignalingin 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）55basalforebrainneurons:rolesofneurotrophinsandproneurotrophins[J].Neur-osci,2006,26(29):7756-7766.[14]DicouE.Peptidesotherthantheneurotrophinsthatcanbecleavedfromproneurotrophins:Aneglectedstory[J].ArchPhysiolBiochem,2007Oct3;l-6[Epubaheadofprint].[15]YangJM,siaoCJ,NagappanG,eta1.Neuronalreleaseofpro-BDNF[J].NatNeurosci,2009,12(2):113-115.[16]TengHK,TengKK,LeeR,eta1.ProBDNFinducesneuronalapoptosisviaactivationofareceptorcomplexofp75NTRandsortilin[J].Neurosci,2005,25(22):5455-5463.[17]Leys,D.Cerebrovasculardisease,cognitiveimpairment,anddementia[J].JournalofNeurosurgery&Psychiatry,2005,76(2):300.[18]解恒革.阿尔茨海默病的流行病学[J].中国全科医学,2001,12(4):933-934.[19]TiraboschiP,HansenLA,ThalLJ,eta1.TheimportanceofneuriticplaquesandtanglestothedevelopmentandevolutionofAD[J].Neurology,2004,62(11):1984-1989.[20]SchindowskiK,BelarbiK,BueL.NeurotrophicfactorsinAlzheimer’sdisease:roleofaxonaltransport[J].GenesBrainBehav,2008,7(1):43-56.[21]TurnerPR,O’ConnorK,TateWP,eta1.Rolesofamyloidprecursorproteinanditsfragmentsinregulatingneuralactivity,plasticityandmemory[J].ProgNeurobiol,2003,70(1):l-32.[22]PrillerC,BauerT,MittereggerG,eta1.Synapseformationandfunctionismodulatedbytheamyloidprecursorprotein[J].JNeurosci,2006,26(27):7212-7221.[23]NunanJ,SmallDH.RegulationofAPPcleavagebyalpha-,betaandgamma-secre-tases[J],FEBSLett,2000,483(1):6-10.[24]MaQH,BagnardD,XiaoZC,eta1.ATAGontheneurogenicfunctionsofAPP[J].CellAdhMigr,2008,2(1):1-7.[25]TillementL,LecanuL,PapadopoulosV.Alzheimer’sdisease:Effectsofβ-amyl-oidonmitochondria[J].Mitochondrion,2011,11(1):13-21.[26]ShibataM,YamadaS,KumarSR,eta1.ClearanceofAlzheimer’samyloidβ(1-40)-peptidefrombrainbyLDLreceptor-relatedprotein-1attheblood-brainbarrier[J].JClin 56内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）Invest,2000,106(12):1489-1499.[27]MorrisJC,RoeCM,GrantEA,eta1.PittsburghcompoundBimagingandpredictionofprogressionfromcognitivenormalitytosymptomaticAlzheimerdisease[J].ArchNeurol,2009,66(12):1469-1475.[28]MintunMA,VlassenkoA,ShelineYI,eta1.LongitudinalPIBPETimagingoftheappearanceandaccumulationofbeta-amyloidincognitivelynormalmiddleandlatelifeadults[J].AlzheimersDement,2010,6(4):S2.[29]SelkoeDJ.Solubleoligomersoftheamyloidβ-proteinimpairsynapticplasti-cityandbehavior[J].BehavBrainRes,2008,192(1):106-113.[30]KimD,TsaiLH.BridgingphysiologyandpathologyinAD[J].Cell,2009,137(6):997-1000.[31]MarcelloE,EpisR,DiLucaM.Amyloidflirtingwithsynapticfailure:towardsacomprehensiveviewofAlzheimer’sdiseasepathogenesis[J].EurJPharmacol,2008,585(1):109-118.[32]MichalskiB,FahnestockM.Pro-brain-deprivedneurotrophicfactorisdecreasedinparietalcortexinAlzheimer’sdisease[J].BrainResMolBrainRes,2003,111(1/2):148-154.[33]MufsonEJ,CountsSE,FahnestoekM,eta1.Cholinotrophicmolecularsubstratesofmildcognitiveimpairmentintheelderly[J].CurrAlzheimerRes,2007,4(4):340-350.[34]GarzonD,YuG,FahnestockM.Anewbrain-derivedneurotrophicfactortranscriptanddecreaseinbrain-derivedneurotrophicfactortranscripts1,2and3inAlzhe-imer’sdiseaseparietalcortex[J].Neurochemistry,2002,82(5):1058-1064.[35]GarzonD,YuG,FahnestockM.Anewbrain-derivedneurotrOphicfactortranscriptanddecreaseinbrain-derivedneurotrophicfactortranscriptsl,2and3inAlzhe-imer’sdiseaseparietalcortex[J].Neurochem,2002,82(5):1058-1064.[36]DuranyN,MichelT,KurtJ,eta1.Brain-derivedneurotrophicfactorandneuro-trophin-3levelsinAlzheimer’sdiseasebrains[J].IntJDevNeurosci,2000,18(8):807-813.[37]HockC,HeeseK,HuletteC,etal.Region-specificneurotrophinimbalancesin 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）57Alzheimerdisease:decreasedlevelsofbrain-derivedneurotrophicfactorandincreasedlevelsofnervegrowthfactorinhippocampusandcorticalareas.ArchNeurol,2000,57(6):846-851.[38]CrollSD,IpNY,LindsayRM,etal.ExpressionofBDNFandTrkBasafunctionofageandcognitiveperformance.BrainRes,1998,812(1-2):200-208.[39]PhillipsHS,HainsJM,ArmaniniM,etal.BDNFmRNAisdecreasedinthehippocampusofindiviualswithAlzheimer’disease.Neuron,1991,7(5):695-702.[40]MurrayKD,GallCM,JonesEG,etal.Differentialregulationofbrain-derivedneurotrophicfactorandtypeⅡcalcium/calmodulin-dependentproteinkinasemessengerRNAexpressioninAlzheimer’sdisease.Neuroscience,1994,60(1):37-48.[41]ConnorB,YoungD,YanQ,etal.Brain-derivedneurotrophicfactorisreducedinAlzheimer’sdisease.BrainResMolBrainRes,1997,49(1-2):71-81.[42]HolsingerRM,SchnarrJ,HenryP,etal.QuantitationofBDNFmRNAinhumanpar-ietalcortexbycompetitivereversetranscription-polymerasechainreaction:decreasedlevelsinAlzheimer’sdisease.BrainResMolBrainRes,2000,76(2):347-354.[43]Narisawa-SaitoM,WakabayashiK,TsujiS,etal.Regionalspecificityofalterat-ionsinNGF,BDNFandNT-3levelsinAlzheimer’sdisease.Neuroreport,1996,7(18):2925-2928.[44]FerrerI,MarinC,ReyMJ,etal.BDNFandfull-lengthandtruncatedTrkBexpre-ssioninAlzheimerdisease.Implicationsintherapeuticstrategies.JNeuropatholExpNeurol,1999,58(7):729-739.[45]ConnorB,YoungD,LawlorP,etal.TrkreceptoralterationsinAlzheimer’sdis-ease.BrainResMolBrainRes,1996,42(1):1-17.[46]DuranyN,MichelT,KurtJ,eta1.Brain-derivedneurotrophicfactorandneurotro-phin-3levelsinAlzheimer’sdiseasebrains[J].IntJDevNeurosci,2000,18(8):807-813.[47]TongL,BalazsR,ThorntonPL,eta1.Beta-amyloidpeptideatsublethalconcen-trationsdownregulatesbrain-derivedneurotrophicfactorfunctionsinculturedcor-ticalneurons[J].Neurosci,2004,24(30):6799-6809.[48]KnableM,BarciB,WebsterMJ,etal.Molecularabnormalitiesofthehippocampusin 58内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）severepsychiatricillness:postmortemfindingsfromthestanleyneuropathologyconsortium.Molecularpsychiatry,2004,9:609-620.[49]TanYL.BDNFinserumofpatientswithchronicschizophreniaonlong～termtreatmentwithantipsychotics[J].NeurosciLett,2005,382(1-2):27-32.[50]NestlerEJ,BarrotM,DiLeoneRJ,etal.Neurobiologyofdepression.Neuron,2002,34:13-25.[51]LangUE,HellwegR.AssociationofafunctionalBDNFpolymorphismandanxiety～relatedpersonalitytraits[J].Pdychopharmacology(Berl),2005,180:95-99.[52]CastrenE,VoikarV,RantamkiT.Roleofneurotrophicfactorsindepressin.CurrOpiPharmacol,2007,7:18-21.[53]KimMW,BangMS,HanTR,etal.ExerciseincreasedBDNFandtrkBinthecon-tralateralhemisphereoftheischemicratbrain[J].BrainRes,2005,1052(1):16-21.[54]LangEM,AsanE,PlesnilaN,eta1.MotoneuronsurvivalafterC7nerverootavu-lsionandreplantationintheadultrabbit:Effectsoflocalciliaryneurotrophicfactorandbrain-derivedneurotrophicfactorapplication[J].PlastReconstrSurg,2005,115(7):2042-2050.[55]KimMW,BangMS,HanTR,eta1.ExerciseincreasedBDNFandtrkBinthecon-tralateralhemisphereoftheischemicratbrain[J].BrainRes,2005,1052(1):16-21.[56]KokaiaZ,ZhaoQ,KokaiaM,etal.Regulationofbrain-derivedneorotrophicfactorgeneexpressionaftertransientmiddlecerebralarteryocclusionwithandwithoutbraindamage[J].ExpNeurol,1995,136(1):73-88.[57]vonBohlenundHalbachO,MinichielloL,UnsickerK.HaploinsufficiencyforTrkBandtrkCreceptorsinducescelllossandaccumulationofalpha-synucleininthesubstantianigra[J].FASEBJ,2005,19(12):1740-1742. 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）59缩略语表英文缩写英文全称中文BDNFBrain-DerivedNeurotrophicFactor脑源性神经营养因子TrkBTropomyosinreceptorkinaseB酪氨酸蛋白激酶受体BTSEsTransmissiblespongiformencephalopathies可传播性海绵状脑病CJDCreutzfelt-Jacobdisease克雅氏病GSSGerstmann-Straussler-Scheinkersyndrome吉斯特曼-施特劳斯综合征FFIfatalfamilialinsomnia致死性家族性失眠症BSEbovinespongiformencephalopathy牛海绵状脑病ADAlzheimer'sdiseases阿尔茨海默病PrPPrionProtein朊蛋白PrPcCellularPrionProtein细胞型朊蛋白PrPScScrapiePrionProtein羊瘙痒病朊蛋白RasratsarcomaRas蛋白CNSCentrolnervoussystem中枢神经系统PKProteinaseK蛋白酶KIHCImmunohistochemistry免疫组织化学IFAimmunofluorescentassay免疫组织荧光分析NeuNNeuronenucleus神经元核 60内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）GFAPglialfibrillaryacidprotein神经胶质原纤维酸性蛋白DAPI4',6-diamidino-2-phenylindole4',6-二脒基-2-苯基吲哚MAPKmitogenactivitedproteinkinase丝裂原激活蛋白激酶ERKextraccllularsignal-relatedkinase细胞外信号调节激酶PLCrphospholipase-Cgamma磷脂酶CrPI3Kphosphatidylinositol-3-kinase磷脂酰肌醇3激酶GRB2growthfactorreceptorboudprotein2生长因子受体接头蛋白SOSsonofsevenless鸟苷酸释放因子 内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）61攻读学位期间发表文章情况发表的年被索引序作者（全体作者，发表或投稿刊题目月、卷期、收录情号按顺序排列）物名称、级别起止页码况脑源性神经营养因子与神经世界最新1王婷婷，新燕已见刊退行性疾病的关系研究进展医学信息文摘王婷婷，田婵，孙SignificantReductionsof静，王荟，张宝云，Brain-DerivedNeurotrophic陈操，王晶，肖康，FactoranditsreceptorMolecular2待发表陈利娜，吕燕，高tropomyosin-relatedkinaseBNeurobiology晨，石琦，新燕，intheBrainTissuesof董小平ScrapieExperimentalAnimals个人简历姓名：王婷婷性别：女，民族：蒙古族出生年月：1985.09.30籍贯：内蒙古呼和浩特市专业：免疫学学习经历：2005.09-2010.07就读于第四军医大学临床医学专业本科2012.09-至今就读于内蒙古医科大学免疫学专业研究生 62内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2015）致谢在各位老师和同学的帮助下，本论文的实验研究已经顺利完成。在此，我要特别感谢导师新燕教授和中国疾病预防控制中心病毒病所董小平研究员的精心指导和无私帮助。首先非常感谢新燕老师把我送到中国疾病预防控制中心病毒病所，给我提供了实验研究的最高平台，并且孜孜不倦的教诲我做实验需要有正确的科研思维和认真细致的耐心。研究生的三年时光，我学习到了新老师和董老师科研上的细致、知识上的渊博、思维上的缜密、作风上的严谨和对科研事业积极投入的奉献精神，使我受益匪浅。实验结束后的论文撰写部分我又得到了两位老师的精心指导和反复修正，再次向两位老师致以崇高的敬意和最诚挚的感谢！同时，也特别感谢指导老师田婵副研究员。在攻读硕士期间，田老师在课题遴选、实验设计以及具体的实验操作过程中都给予了精心的指导和悉心的帮助。在开题报告之前，督促我多读文献，帮助我寻找思路，并与我展开讨论，对我的开题报告进行了多次修改，最终得以顺利完成。衷心感谢她对我实验课题的支持和指导，感谢她给予我生活及学习上的精神鼓励。田老师敏锐的科研思维，积极进取的工作态度，一丝不苟的工作作风，乐观开朗、善解人意的性格品质都给我留下了深刻的印象，是我学习的榜样。本课题系内蒙古医科大学与中国疾病预防控制中心病毒病所朊病毒室合作完成，感谢朊病毒室所有老师和同学对本课题给予的帮助和付出的努力。衷心感谢各位老师对我实验上的关心、帮助、支持、鼓励、指点。衷心感谢各位同学给予我热情的帮助、支持、沟通和建议。衷心感谢所有在实验上给予我指导和帮助并且一直不断鼓励我的人。衷心感谢实验室的各位学长、学姐、同学，是你们营造的和谐团结的科研学习氛围，才使我得以顺利完成实验。最后我还要感谢长久以来陪伴我的家人和朋友对我莫大的支持和鼓励！谢谢！