全国病媒生物监测实施方案抗药性

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附件8全国病媒生物监测实施方案抗药性ChinaOperationalGuidelinesforVectorsSurveillance—InsecticideResistance通过抗药性监测工作的开展，能够使我们了解病媒生物对常用杀虫剂的抗药性水平，掌握抗药性的发展变化趋势，合理选择、使用有效杀虫剂；通过抗药性治理措施的落实，可以保护杀虫剂的有效性，提高病媒生物的防控效果。1.监测病媒生物种类蚊虫（当地优势蚊种或重要媒介蚊种至少一种，一旦选定，就持续监测）、家蝇和德国小蠊。2.监测生境每个监测县（区），选择辖区内不同方位的城市居民区、公园、医院、城乡结合部、农村等生境采集蚊虫、家蝇和德国小蠊，移入实验室饲养，进行抗药性测定。不同年度间抗药性监测试虫采集点应相对固定。3.监测频率和时间每类病媒生物至少每两年开展一次抗药性监测。各类试虫应在其活动高峰期采集。4.待测杀虫剂选择当地防控蚊虫、家蝇和德国小蠊的常用杀虫剂不少于3种。监测必须使用中国疾病预防控制中心传染病预防控制所统一标定的杀虫剂原药。5.监测方法（1）蚊虫抗药性测定用WHO推荐使用的幼虫浸渍法和成蚊接触筒法（参考GB/T26347-2010）分别测定幼虫和成蚊的抗药性。幼虫测定3龄末至4龄初幼虫对常用杀虫剂的LC50。成蚊用诊断剂量测定其24ｈ死亡率。1）蚊虫的采集和饲养在当地有代表性的区域（如东、西、南、北、中不同方位，或者某一个特定区域），根据蚊虫的吸血活动、栖息和孳生环境采集蚊虫。按表8-1中列出的项目，记录采集时间、地点、经纬度、采集数量和虫态等信息。试虫采集后，根据蚊虫的孳生习性、成蚊或4龄幼虫形态学特征，鉴定种类，进行常规饲养。2）成蚊抗药性测定 把恢复筒与隔板连接，用吸蚊管取20～30只羽化后3～5天的健康雌蚊（中华按蚊用采自野外的健康雌蚊）放入恢复筒中，平行放置15min，剔除不健康蚊虫。在隔板另一面装上已衬贴药纸（可自制、购买，或由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供）的接触筒，使恢复筒在下面，竖直放置，轻轻拍打使蚊虫聚集于恢复筒底部，然后瞬间把隔板抽开，颠倒接触筒与恢复筒位置，将恢复筒内蚊虫轻吹入接触筒，迅速关上隔板。将筒平放，即开始计算接触时间。不同的杀虫剂接触时间参考表8-4。试虫死亡的判断标准：试虫完全不动，或仅躯体、足、翅或触角等震颤而无存活的可能性，视为死亡。若对照死亡率超过20％，试验视为无效，重新测定。测试结果记入表8-3。结果用死亡率表述：死亡率=（死亡虫数/试虫总数）×100%对照组死亡率小于5%无需校正，对照组死亡率在5%～20%之间，用Abbott公式进行校正。校正死亡率=（处理组死亡率-对照组死亡率）/(1-对照组死亡率)100%抗性水平判断标准：在诊断剂量下蚊虫的死亡率在98%～100%表明其为敏感种群；死亡率在80%～98%（不含）表明其为可能抗性种群；死亡率<80%表明其为抗性种群。3)幼虫浸渍法测定用丙酮配制杀虫剂的5～7个系列浓度；将烧杯中加入200mL脱氯水，用微量移液器取出100μL，首先在对照组烧杯加入100μL丙酮，再依次于试验组中加入100μL药液，用玻璃棒或磁力搅拌器，按照对照、低浓度、高浓度的次序搅拌均匀，每个浓度至少重复3次。用幼虫吸管，吸取3龄末至4龄初幼虫，用小漏勺将水滤掉，按照对照组、低浓度组到高浓度组依次分别加入20只幼虫。放入设定好的温度〔（25±1）℃〕和湿度〔（70±10）%〕的培养箱或房间中，24ｈ后查看蚊虫的死亡情况。测定信息和结果记录见表8-2，获得毒力回归线、致死中浓度、斜率值、卡方值等数据，计算抗性倍数（RR）。RR=待测种群LC50值/敏感种群LC50值可参考如下标准判断抗药性水平：RR＜3为敏感，3≤RR＜10为低抗，10≤RR＜40为中抗，RR≥40为高抗。（2）家蝇抗药性测定家蝇的抗药性测定采用WHO推荐的点滴法（参考GB/T26347-2010）。1）采集和饲养 用网捕或笼诱等方法，在代表性区域采集成蝇，也可以在养殖场挖取采集幼虫(蛆)。从采集到的蝇类中挑选家蝇，在室内按照常规方法饲养。2）杀虫剂配制：用丙酮将杀虫药剂母液稀释到一系列的浓度(通过预试验确定药剂的浓度范围,最低浓度时死亡率小于1O%,最高浓度时大于80%)。3）测定和恢复环境：温度:(25±1)℃,光周期:14L:10D,相对湿度:(60-70)%。4）测定方法将试虫用乙醚或C02等麻醉至昏迷。用点滴器将0.3μL左右杀虫药剂溶液点滴在雌性家蝇前胸背板上。每个处理组点滴30只羽化后3～5天的雌性家蝇,以相应溶剂点滴为空白对照,试验重复3次。将受药后的试虫转入清洁容器内,供给水和食物,正常饲养,24h后统计死亡情况，填入表8-2。凡腹部上翻、六足抽搐、用锐器触之不能翻身爬行者判为死亡。根据每一浓度对应的死亡率求出回归方程,根据回归方程求出LD50值。5）抗药性水平判定标准：敏感品系和测定样本95%置信区间不重叠，且抗性倍数≥5为抗性种群。（3）德国小蠊抗药性测定采用药膜法，参见GB/T26352-2010。1）采集和饲养用诱捕器（内部放置诱饵）、捕蟑器或粘蟑板等在所选生境采集试虫，数量不少于50只，常规饲养。2）抗药性测定用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫剂原液逐级稀释到所需浓度，取2.5mL药液加入500mL锥形瓶中，不断转动锥形瓶，使药液均匀分布于瓶内壁，置于通风厨中过夜，使有机溶剂全部挥发。每瓶放入试虫10只，用纱网或纱布封口。试验重复10次，以相应溶剂处理作为对照组。24h后记录每次以及对照组的死亡数。试虫不能正常爬行或者完全不动视为死亡，可用器具碰触试虫查看其反应。测试结果记录见表8-3。3）结果计算死亡率=（死亡虫数/试虫总数）100%对照死亡率小于5%无需校正；对照死亡率在5%～20%之间，用Abbott公式校正。对照死亡率大于20%为无效测定，需重新进行测定。校正死亡率=（处理组死亡率-对照组死亡率）/(1-对照组死亡率)100% 4）抗药性水平判定标准：（校正）死亡率小于80%为抗性种群。表8-1____________（病媒名称）采集信息记录表__________省（自治区、直辖市）________市________县（区）数量（只或块）采集采集生境编号经度，纬度备注时间地点特点成蚊幼虫蛹卵块采集单位：_________________采集人：___________表8-2病媒生物抗药性测定记录表（毒力回归线）__________省（自治区、直辖市）________市________县（区） 试虫名称：___________________虫源地名：___________________________药剂名称：___________________经度：____________纬度：_____________测定人：___________________英文药名：___________________________虫态：______虫龄：___________处理日期：_______年___月__日至___月__日培育温度：___℃；相对湿度：___％测定室温：_______℃；相对湿度：_____％处理浓度/剂量重复1重复2重复3合计单位死虫数总虫数死虫数总虫数死虫数总虫数死/总对照///////2处理虫数：______________毒力回归线：______________X：_________________斜率b值（95％置信限）：______________________LC50/LD50：____________________95％置信限：__________________________LC95/LD95：____________________95％置信限：__________________________备注：蚊幼虫测定LC50（mg/L），家蝇成虫测定LD50(μg/雌)监测单位：_________________监测人：_________审核人：________ 表8-3病媒生物抗药性测定记录表（诊断剂量）__________省（自治区、直辖市）________市________县（区）试虫名称：____________________虫源地名：____________________________药剂名称：____________________经度：____________纬度：______________测定人：____________________英文药名：____________________________虫态：______虫龄：____________处理日期：_______年___月__日至___月__日培育温度：___℃；相对湿度：___％测定室温：_______℃；相对湿度：_____％A杀虫剂名称B杀虫剂名称对照重复浓度及单位/浓度及单位/接触时间及单位接触时间及单位死虫数总虫数死虫数总虫数死虫数总虫数ⅠⅡⅢⅣⅤⅥVIIVIIIIXX合计备注：本表格适用于通过诊断剂量测定成蚊及德国小蠊成虫的抗药性。监测单位：_________________监测人：_________审核人：__________表8-4WHO推荐的几种杀虫剂对成蚊的区分剂量杀虫剂类型杀虫剂区分剂量〔接触时间(h）〕* 致倦库蚊埃及伊蚊按蚊致倦库蚊有机氯DDT4%（4）4%(0.5)4%(1)-狄氏剂4%（1）0.4%(1)0.4%(1)-有机磷杀螟硫磷1%（2）-1%(2)-DDVP---0.77%(1)马拉硫磷5%（1）0.8%(1)5%(1)5%(1)氨基甲酸酯残杀威0.1%（2）0.1%(1)0.1%(1)0.33%(1)拟除虫菊酯高效氟氯氰菊酯0.025%(1)0.03%(1)-0.025%(1)氯菊酯0.25%(3)0.25%(1)0.25%(1)0.79%(1)溴氰菊酯0.025%(1)-0.025%(1)0.02%(1)注：*我国致倦库蚊区分剂量（汪中明等，2008）