猪IFITM通过与ABHD16A相互作用抑制乙型脑炎病毒研究

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托南雇必大ｆ学术硕士学位论文题目猪ＩＦＩＴＭ通过与ＡＢＨＤ１６Ａ相互作用抑制乙型脑炎病毒研究学位申请人姓名徐朝导师姓名许君副教授学科专业细胞生物学研究方向分子细胞生物学中国郑州２０１８年４月 分类号密级河南农业大学学术硕士学位论文论文题目：猪ＩＦ１ＴＭ通过与ＡＢＨＤ１６Ａ相互作用抑制乙型脑炎病毒研究英文题目：ＳｗｉｎｅＩＦＩＴＭｉｎｈｉｂｉｔｓＪａｐａｎｅｓｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓｖｉａｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈＡＢＨＤ１６Ａ学位申请人：徐朝导师：许君副教授专业：细胞生物学研宄方向：分子细胞生物学论文提交学位授予日期：日期： 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书学位论猪ＩＦＩＴＭ通过与ＡＢＨＤ１６Ａ相互作用学位｜文题｜目抑制乙型脑炎病毒研宄。理学硕士ｇ肖ｊ一￣徐朝细胞生物学许君，｜｜２１｜学位论文＾如需保密，解密时间年月曰独创性声明本人呈交论文是在导师指导下进行的研宄工作及取得研宄成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研宄成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用一过的材料。，指导教师对此进行了审定与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。特此声明。：导师签名研宄生签名：＾日期＆年月曰日期年６月Ｋ曰６＃学位论文使用授权及知识产权归属承诺本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不本人同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容＾完全了解《河南农业大学知识产权保护办法》的有关规定，在毕业离开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署河名单南位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归注农业大学所有，否则，承担相应的法律责任。：保密学位论文在解密后适用于本授权书。（＾１＾１研宄生签名导师签名学院领曰期：月咿曰曰期別賞年６月以日曰期如ｇ年〈月（６曰 目录摘要..................................................................................................................................................1第一章文献综述.............................................................................................................................31.1乙型脑炎简介............................................................................................................................31.1.1乙型脑炎及其危害..................................................................................................31.1.2乙型脑炎病毒简介..................................................................................................41.1.3乙型脑炎病毒入侵过程及其致病机理..................................................................51.2IFITM研究进展.........................................................................................................................61.2.1IFITM家族简介......................................................................................................61.2.2IFITM的抗病毒功能及可能的机制......................................................................71.3ABHD16A研究进展..................................................................................................................81.3.1ABHD家族概述......................................................................................................81.3.1.1ABHD的生理调节功能...............................................................................81.3.1.2ABHD作为潜在的药物靶点.......................................................................81.3.1.3ABHD具有多种酶活性...............................................................................91.3.1.4ABHD与肿瘤发生.......................................................................................91.3.2ABHD16A生物学功能.........................................................................................10第二章引言..................................................................................................................................112.1研究的目的与意义...........................................................................................................112.2主要研究内容...................................................................................................................112.3技术路线...........................................................................................................................12第三章猪IFITMs抗乙型脑炎病毒作用的研究........................................................................133.1材料与方法.......................................................................................................................133.1.1材料........................................................................................................................133.1.1.1实验材料.....................................................................................................133.1.1.2实验仪器.....................................................................................................133.1.1.3实验试剂与耗材........................................................................................................143.1.2方法........................................................................................................................153.1.2.1细胞培养.....................................................................................................15 3.1.2.2sIFITMs真核表达载体的构建..................................................................163.1.2.3sIFITMs过表达细胞系的构建..................................................................203.1.2.4sIFITMs敲除载体的构建..........................................................................223.1.2.5病毒感染.....................................................................................................233.1.2.6RT-PCR检测病毒......................................................................................243.1.2.7WesternBlot检测蛋白表达.......................................................................253.2结果与分析.......................................................................................................................263.2.1sIFITMs真核表达载体构建的结果.....................................................................263.2.2sIFITMs敲除载体构建的结果.............................................................................273.2.3sIFITMs过表达细胞系的构建与筛选.................................................................283.2.4过表达sIFITMs对JEV病毒复制的影响...........................................................283.2.5敲除sIFITMs对JEV病毒复制的影响...............................................................30第四章sIFITM1与sABHD16A相互作用的研究......................................................................314.1材料与方法.......................................................................................................................314.1.1材料........................................................................................................................314.1.1.1实验材料.....................................................................................................314.1.1.2实验仪器.....................................................................................................314.1.1.3实验试剂与耗材.........................................................................................314.1.2方法........................................................................................................................324.1.2.1sABHD16A生物信息学分析....................................................................324.1.2.2sABHD16A基因克隆与表达载体构建....................................................344.1.2.3sABHD16A功能初探................................................................................354.1.2.4酵母双杂交载体构建.................................................................................364.1.2.5sIFITMs与sABHD16A的酵母双杂交系统分析....................................364.1.2.6sIFITMs与sABHD16A的亚细胞定位....................................................384.2结果与分析.......................................................................................................................394.2.1ABHD16A的多序列比对结果.............................................................................394.2.2系统进化树构建结果............................................................................................394.2.3sABHD16A理化性质的预测...............................................................................404.2.4sabhd16a基因克隆和表达载体构建结果...........................................................41 4.2.5探究sABHD16A功能的结果.............................................................................444.2.6sIFITMs与sABHD16A酵母双杂交结果...........................................................444.2.7sIFITM1与sABHD16A的亚细胞定位结果.......................................................464.3讨论...................................................................................................................................48第五章sIFITM1抗病毒机制的初步探究...................................................................................505.1材料与方法.......................................................................................................................505.1.1材料........................................................................................................................505.1.1.1实验材料.....................................................................................................505.1.1.2实验仪器.....................................................................................................505.1.1.3实验试剂与耗材.........................................................................................505.1.2方法........................................................................................................................505.1.2.1sabhd16a敲除载体构建............................................................................505.1.2.2sabhd16a敲除载体的转染........................................................................505.1.2.3敲除sabhd16a基因细胞系的构建与筛选...............................................515.1.2.4敲除sabhd16a对JEV复制的影响...........................................................515.1.2.5过表达sABHD16A对JEV复制的影响..................................................525.1.2.6sIFITM1与sABHD16A共表达对JEV复制的探究...............................525.1.2.7sIFITM1S-棕榈酰化位点突变体构建......................................................525.1.2.8sIFITM1S-棕榈酰化位点突突变体对JEV复制的影响.........................535.2结果与分析.......................................................................................................................535.2.1sabhd16a基因敲除载体构建的结果...................................................................535.2.2sabhd16a敲除的结果...........................................................................................545.2.3基因敲除sabhd16a细胞系构建结果..................................................................545.2.4敲除sabhd16对JEV复制影响...........................................................................555.2.5过表达sABHD16A对JEV复制影响.................................................................555.2.6sIFITM1与sABHD16A共表达对JEV复制影响的结果..................................565.2.7sIFITM1S-棕榈酰化位点突变体构建的结果.....................................................575.2.8sIFITM1S-棕榈酰化位点突变体对JEV复制的影响........................................585.3讨论...................................................................................................................................59第六章sIFITMs与sABHD16A对炎症因子表达的影响..........................................................60 6.1材料与方法.......................................................................................................................606.1.1材料........................................................................................................................606.1.1.1实验材料.....................................................................................................606.1.1.2实验仪器.....................................................................................................606.1.1.3实验试剂与耗材.........................................................................................606.1.2方法........................................................................................................................606.1.2.1感染JEV病毒对sifitm1与sabhd16a表达的影响..................................606.1.2.2sIFITM1、sABHD16A在炎症因子表达中的影响..................................606.2结果与分析.......................................................................................................................616.2.1JEV感染对sifitm1与sabhd16a表达的影响......................................................616.2.2过表达sIFITM1、sABHD16A对炎症因子表达影响的结果............................626.3讨论...................................................................................................................................64第七章结论与展望.......................................................................................................................657.1结论..........................................................................................................................................657.2展望..........................................................................................................................................65ABSTRACT....................................................................................................................................76 摘要日本乙型脑炎（EpidemicencephalitisB）是由流行性乙型脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）感染而引发的人畜共患传染病。乙型脑炎病毒在全世界范围内危害严重。干扰素诱导的跨膜蛋白（Interferon-inducedtransmemberaneproteins，IFITMs）是受干扰素（Interferon，IFNs）诱导的小分子跨膜蛋白，研究显示IFITM家族蛋白具有广谱抗病毒的能力。实验室前期研究初步证明猪源干扰素诱导的跨膜蛋白（sIFITMs）具有抑制JEV作用，为进一步研究其作用机制和在乙型脑炎发生发展中的作用，开展了相关研究，研究结果如下：1、采用荧光定量PCR检测过量表达IFTIMs时JEV的复制。结果表明，在PK15、HEK293细胞中，过表达sIFITM1、sIFITM2、sIFITM3蛋白，在24h、48h、72h均显著抑制JEV病毒的复制，其中sIFITM1具有较强抑制病毒复制的能力。为进一步验证sIFITM1对病毒复制的影响，通过CRISPR/cas9技术在PK15细胞和ST细胞中敲除sIFITM1，结果显示，在24h，缺失sIFITM1能显著提高JEV病毒复制。2、为了探讨sIFITMs的抗JEV机制，筛选并研究其相互作用蛋白。采用酵母双杂交试验证实了sIFITM1、sIFITM2、sIFITM3与sABHD16A均存在相互作用关系。在PK15、HEK293细胞中，通过亚细胞共定位，发现sIFITM1与sABHD16A存在共定位膜性结构上，且在JEV感染细胞后，sIFITM1与sABHD16A的共定位区域随着病毒的感染发生转移。3、通过在BHK21、L02、HEK293细胞中过表达sABHD16A，24h、48h、72h检测细胞培养上清，结果表明sABHD16A显著抑制JEV病毒复制。构建CRISPR/cas9敲除载体pHMG-sgRNA-ssgRNA-abhd16a，在PK15、ST细胞中敲除sabhd16a，该细胞感染JEV24h后，与对照组相比具有差异性显著提高JEV复制。4、将pHMG-sgRNA-ssgRNA-abhd16a转染HEK293细胞，筛选并构建了单克隆稳定缺失sABHD16A-/-的细胞系，DNA测序结果显示，HEK293细胞中sABHD16A被成功敲除。5、为了探究sIFITM1和sABHD16A的相互作用对JEV感染的影响，sIFITM1和sABHD16A表达质粒共转染BHK-21细胞，结果显示共表达两种蛋白时的抗病毒作用明显强于单独表达IFITM1，说明sABHD16A具有协同sIFITM1抗JEV作用。6、为了研究sIFITM1抗JEV作用是否与sIFITM1的S-棕榈酰化有关，构建了S-棕榈酰化位点突变体表达质粒▲sIFITM1（sIFITM1-C50A-C51A-C84A），转染PK15细胞，与转染sIFITM1、sABHD16A、共转sIFITM1/sABHD16A相比，转染▲sIFITM1时，对JEV的抑制明显减弱，共转染▲sIFITM1/sIFITM1时的协同抗JEV活性也明显降低。该结果初步证明sIFITM1的抗JEV作用与其棕榈酰化有关，而该位点的棕榈酰化可能与sABHD16A有关。7、为明确sIFITM与sABHD16A是否参与调控JEV，通过荧光定量PCR检测过表达sIFITM1或sABHD16A的细胞中炎症相关因子的表达水平，结果显示IL-1β，IL-6，IL-10，1 TNF-α和COX2的mRNA水平均显著升高。但共表达sIFITM1/sABHD16A时，除了COX2之外，这些细胞因子的mRNA表达水平显著降低。JEV感染过表达sABHD16A的细胞时，IL-1β，IL-6和TNF-α表达水平显著上升，而JEV感染共表达sIFITM1/sABHD16A的细胞时，与其对照组和其他感染细胞相比，炎症因子表达水平则有所下降，说明sIFITM1在调节炎症平衡方面可发挥重要作用。本研究所取得的结果，不仅为后续研究开展提供了一系列实验材料，也为乙型脑炎的预防和治疗提供了理论支持。关键词：乙型脑炎病毒，干扰素诱导的跨膜蛋白，α/β-水解酶结构域代谢丝氨酸水解酶5，抗病毒，相互作用蛋白，炎症因子2 第一章文献综述1.1乙型脑炎简介1.1.1乙型脑炎及其危害流行性乙型脑炎（EpidemicencephalitisB）又称日本脑炎（Japaneseencephalitis），是由流行性乙型脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）感染而引发的一种危害严重的人畜共患传染病。由JE感染而引起的日本脑炎是一种急性病毒性脑炎[1]，已经成为全世界关注的重要公共卫生问题。乙型脑炎在全世界范围内严重危害人类的健康。JE的分布地区广泛，主要包括亚洲（东亚、南亚、东南亚）[2,3]、澳大利亚[4]、西太平洋部分国家[5]，约30亿人遭受JE的侵害。由监测和报告统计每年至少有70000例病例，根据人口和年龄分布病死率范围从0.3%到60%不等[6]。我国作为乙型脑炎病毒的高发地区，在亚热带以及热带地区（除青海地区外）具有广泛的分布。目前虽然中国卫生部有计划在内的免疫接种，发病率有所降低，但仍占全世界乙型脑炎报道病例的80%以上[7]。人对于JEV具有较明显的隐性感染的易感性，并且发病人群以青少年和儿童居多，感染JE后有进一步引发病毒性脑膜炎的危险，目前没有特定而有效的治疗方法，导致死亡率极高。迫切需要对于乙型脑炎发病机制深入的研究。图1-1：日本脑炎的地理分布Figure1-1:GeographicdistributionofJapaneseencephalitis（Travelers'Health:YellowBook,Chapter4:PreventionofSpecificInfectiousDiseases,JapaneseEncephalitis,Map4-06GeographicdistributionofJapaneseencephalitis）3 近年来乙型脑炎在我国畜牧生产过程的危害愈加严重。我国素来有广阔的养猪地域，并且人与猪的接触关系紧密，在广泛分布的三带喙库蚊地区，乙型脑炎传播对畜牧生产造成极为严重的经济损失。乙型脑炎病毒表现为多种家畜动物易感性，猪作为JEV病毒在自然界主要的储存宿主和传播宿主，在性成熟时为主要的发病易感群体，主要引起对生殖系统的障碍，主要包括怀孕母猪繁殖障碍（流产），公猪睾丸炎，以及幼猪的脑炎，使养猪业造成巨大的经济损失[8]。针对性对乙型脑炎病毒入侵机制研究，有助于缓解畜牧养殖业经济受损。JE是一种不容忽视的人兽共患传染病，对世界公共卫生安全而言是一个严重威胁，深入研究JEV的感染和致病机理，对有效防控该病的流行及寻找新的抗病毒策略有深远意义。1.1.2乙型脑炎病毒简介乙型脑炎病毒属于虫媒病毒黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus），病毒基因组为单股正链RNA，全长约11kb，5′端含有一个免受核酸酶或者磷酸酶降解的Ⅰ型帽子结构（m7GpppNp），其后面的序列依次编码三个结构蛋白（核心蛋白C、膜蛋白M、包膜蛋白E）和7个非结构蛋白，分别是NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5[9]，病毒RNA在细胞浆内直接起mRNA作用，翻译出结构蛋白和非结构蛋白，在胞浆粗面内质网组装成熟病毒，出芽释放。图1-2：JEV基因组结构和基因表达A：基因组结构。正链基因组RNA在5'-3'方向含有帽子结构，5'NCR，长ORF和3'NCR。B：基因表达。(引自YunSI,LeeYM.Japaneseencephalitis:thevirusandvaccines[10])Figure1-2:JEVgenomestructureandgeneexpression.A:Genomestructure.PositivestrandgenomicRNAcontainsacapstructureinthe5'-3'direction,a5'NCR,alongORF,anda3'NCR.B:Geneexpression.(YunSI,LeeYM.Japaneseencephalitis:thevirusandvaccines)乙型脑炎病毒结构蛋白主要决定其生物化学性质，包括与细胞表面受体的结合、免疫反应的发生有关[11]。核衣壳蛋白C的C端疏水氨基酸将其固定在宿主细胞粗面内置网上，4 在内置网组装病毒核衣壳，逃逸宿主细胞核酸酶的降解。M蛋白的前体蛋白prM参与修饰E蛋白的折叠和病毒颗粒的装配，其参与病毒诱发保护性协同蛋白，可以调控产生轻度中和抗体[12]。E作为病毒的主要结构蛋白，病毒毒力的强弱与其有密切的联系。已有的研究发现E蛋白的C138谷氨酸突变成赖氨酸后，JEV的毒力会显著性降低。该蛋白在胞外域和跨膜区之间具有两个保守螺旋[9]，作为病毒包膜蛋白表面的主要抗原，与病毒侵染细胞过程中的黏附、融合、致病密切相关，它能识别细胞膜表面特异性受体，引导病毒的侵染过程，是病毒入侵阶段关键分子。因此解析E蛋白在JEV入侵过程中，E基因在宿主细胞中发挥的作用至关重要。非结构的蛋白参与JEV复制过程。NS1蛋白在JEV复制和释放中起到关键作用，该蛋白是保守性分泌型蛋白。NS1蛋白在E蛋白C端疏水信号序列的作用下进入内质网，与E蛋白共同滞留一段时问后，细胞信号肽酶分别作用于NS1蛋白与E蛋白和NS2A蛋白的连接位点，切割产生NS1蛋白并定位于细胞表面[13]。分泌到膜外后，诱导补体依赖性的溶细胞反应，诱发机体在非中和抗体存在的条件下产生保护性免疫[14]。NS2A是参与病毒RNA复制的小分子疏水膜蛋白，该蛋白在不同宿主中使用相同的切割位点顺势切割NS1-NS2A连接处，并参与JEV复制复合物的形成，同时在病毒的组装和释放上也起到至关重要的作用[15,16]。NS2A能通过抑制IFN信号通路和抑制宿主PKR途径，从而调节宿主的抗病毒反应[17]。Chambers等发现NS2B的保守结构域与形成NS2B-NS3复合物相关[18]，黄病毒非结构蛋白NS3是一种病毒蛋白酶，在其N端含有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域，NS3是负责产生NS2B、NS3的氨基末端的切割的病毒蛋白酶，并且推测可能是参与NS4A和NS5的末端切割[19,20]。1.1.3乙型脑炎病毒入侵过程及其致病机理JEV的入侵一般是通过受体介导的内吞。病毒首先与细胞膜表面的特定受体结合，是病毒入侵细胞的第一步，在细胞膜上引起膜融合过程，然后病毒穿越细胞膜，进入内吞囊泡，依赖宿主细胞的内吞作用来完成入侵。在酸性内体中，病毒包膜脱壳，并在细胞质中释放病毒RNA[21]。具体过程如下：感染性病毒体通过与质膜上的附着和进入受体分子结合而附着于靶细胞（步骤1）。这种相互作用触发细胞通过受体介导的内吞作用使病毒体内化（步骤2）。在内体中，低pH诱导病毒E糖蛋白的显著构象变化，引发病毒膜与宿主内体膜融合（步骤3）。融合后，病毒基因组RNA被释放到细胞质中，首先被翻译成与粗糙ER结合的多蛋白前体（步骤4）。加工多蛋白产生RNA复制和颗粒组装所需的成熟病毒蛋白。基因组RNA在病毒诱导的ER衍生囊泡内的复制复合物中复制（步骤5）。未成熟的子代病毒体通过将新合成的基因组RNA和C蛋白的复合物出芽到ER的内腔中而形成，其中它们在其膜上获得prM和E蛋白（步骤6）。未成熟的病毒粒子然后通过分泌途径被运送到高尔基体;在跨高尔基体网络中，将prM切割成M导致病毒颗粒的成熟（步骤7）。最后，成熟病毒体通5 过胞吐作用从细胞释放到细胞外环境中（步骤8）（图1-3）。图1-3：JEV复制周期[10]Figure1-3:JEVreplicationcycle自然状态下，携带JEV的传播媒介库蚊叮咬动物体后，病毒颗粒经血液进入宿主体内，经外周血流经全身并主要在网状内皮细胞和血管内皮细胞繁殖[22]。感染初期，存在短暂的病毒血症，JEV扩散转移至脉管组织，加剧病毒血症。感染后期，一旦病毒通过脊液或淋巴细胞等进入中枢系统（CNS），突破血脑屏障，在脑组织中大量增殖，选择性侵害神经元（脑干、丘脑、基底神经、脑皮质深层），导致神经性细胞坏死形成脑组织软化灶，进一步引起血管充血、淋巴细胞浸润、胶质细胞增生形成血管套，引发病毒性脑炎。目前JEV通过血脑屏障的机制尚不清楚。已有的研究表明一般宿主感染JEV后，无临床现象，在内脏和血液中病毒由机体引发的免疫炎症反应清除，感染过程终止。1.2IFITM研究进展1.2.1IFITM家族简介干扰素诱导的跨膜蛋白（interferon-inducedtransmemberaneproteins，IFITMs）是受干扰素（Interferon，IFNs）诱导的小跨膜蛋白，I型和II型干扰素能够诱导人类IFITM1，IFITM2和IFITM3的表达[22-24]，作为特定的病毒限制性分子阻止病毒穿过细胞的脂质双分子层进入细胞质。IFITM蛋白家族含有相同的拓扑结构，在胞内N末端和C末端具有反向平行的双跨膜区域和一段胞浆区[25,26]，在人类11号染色体上，以ifitm5、ifitm2、ifitm1、ifitm3、ifitm10的顺序依次排列。人类IFITM1，IFITM2和IFITM3广泛存在于各组织中表达，而IFITM5目前只发现在骨骼中表达[27,28]，IFITM10报道其功能较少[29]。其中IFITM1具有调节细胞增殖、细胞分化的功能，在抑制大肠癌、胃癌和乳腺癌等肿瘤形成过程有一定的抑制作用[30-34]。IFITM2可能与细胞增殖、迁移、侵袭和诱导细胞凋亡[35]，具有抑制VSV-G假型病毒、HIV-1等功能[36]。猪干扰素诱导的跨膜蛋白（swineIFITMs，sIFITMs）的家族成员包括sIFITM1、sIFITM2、6 sIFITM3和sIFITM5，干扰素能够刺激基因IFITMs表达水平明显提高[37]。猪的IFITMs位于猪2号染色体上，以IFITM3、IFITM1、IFITM2、IFITM5顺序依次排列[38]。1.2.2IFITM的抗病毒功能及可能的机制Alber等在1996年首次发现IFITM1能抑制水疱性口炎病毒（VSV）的复制，IFITM蛋白的抗病毒活性的首次被报道[39]。2009年Brass等人首次在影响IAV复制的宿主因子的RNAi筛选中鉴定IFITMs为先天抗病毒因子[40]。IFITM具有多种生物学功能，包括肿瘤发生[41,42]、细胞黏附[43]、免疫信号识别[44]、抗病毒作用等。抗病毒作用一直被持续研究和关注。IFITM介导的抗病毒作用病毒属于宿主细胞抵御病毒的第一道防线[45,46]。已有的研究报道IFITM1、IFITM2、IFITM3的过表达抑制了早期病毒复制，IFITM蛋白在流感病毒（InfluenzaAvirus）、人类免疫缺陷病毒-1（HumanImmunodeficiencyVirus-1，HIV-1）、水疱性口炎病毒（VSV）、甲型流感病毒、单纯疱疹病毒（Herpessimplexvirus，HSV）丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）SARS冠状病毒（SARS-CoV）和乙型脑炎病毒（JEV）等中均具有抑制作用[40,47,48]。虽然IFITM蛋白家族具有抗病毒作用，但明确的机制尚不完全清楚。已有的研究报道显示IFITM蛋白可通过干扰病毒膜与细胞膜融合来抵御病毒基因组释放入细胞质。IFITM蛋白通常在病毒通过外包被蛋白侵染细胞阶段具有抵御作用，一般RNA病毒逃逸IFITM的限制作用较为困难[25,40]。许多研究结果显示IFITMs是多种致病性病毒的内源性抑制剂，尤其是包膜病毒病原体[49]。病毒包膜及其受体经历构象变化导致半渗、外侧半膜片融合，内侧半膜片保持完整，然后通过扩大病毒孔包膜孔，导致与细胞膜融合。IFITMs通过介导改变细胞膜的物理结构、紧密连接复合体等阻碍病毒包膜融合侵入细胞，发挥抗病毒作用[50]。IFITMs抑制病毒和细胞膜融合的另一证据是在IFITMs存在下，携带病毒包膜的细胞与表达受体的细胞之间形成的合胞体减少[51]。IFITM1抑制病毒融合蛋白诱导的合胞体形成和细胞之间的融合，IFITM2和IFITM3也有相同的作用，效率在某种程度上取决于细胞类型[51]。另外研究发现病毒需要内体转运（如单孢疹病毒、HIV-1[52-54]）、酸化作用等，IFITM蛋白在阻断病毒通过细胞内体、溶酶体和细胞膜的融合，从而发挥限制病毒释放，抑制增殖的作用[40]。已有的研究报道人源IFITM3具有相对保守的赖氨酸残基，能够被泛素化连接酶泛素化，从而影响抗病毒活性下降[55]。IAV、HIV-1、HCV和HSV病毒在宿主细胞质膜、内质网膜复制过程中获得包膜，其富含跨膜通常为S-棕榈酰化的糖蛋白，在侵染宿主时与细胞质膜上的同源受体结合，触发病毒粒子的内吞作用，介导病毒与细胞膜的后续融合，从而允许病毒DNA/RNA基因组进入细胞质，并且也参与细胞中新形成的病毒颗粒的出芽。Jacob等证明IFITM3的S-棕榈酰化控制其在膜结构的聚集，能增加抗流感病毒活性[55]，并且IFITM3三个半胱氨酸被S-脂肪酰化残基、高度保守的半胱氨酸的位点特异性修饰后，对于IFN刺激的免疫的抗病毒活性降低7 [56]。小鼠IFITM3三个保守的半胱氨酸是抗A型流感病毒活性所必需的。小鼠IFITM1的棕榈酰化通过阻止蛋白酶体降解来调节蛋白质稳定性，并且修饰小鼠IFITM1C端非保守半胱氨酸支持具有机制影响的膜内拓扑结构[57]。综合已有的研究表明IFITMs的S-棕榈酰化修饰在不同种属、不同亚型中表现的功能具有差异性。1.3ABHD16A研究进展1.3.1ABHD家族概述ABHD蛋白家族目前已经预测至少包含19种蛋白质，该家族蛋白具有α/β-水解酶超家族典型结构域[58]，家族中含有蛋白酶、脂肪酶、酯酶、脱卤酶、过氧化物酶和环氧化物水解酶等[59]。在ABHD家族中，已经鉴定出底物的几个成员具有调节甘油磷脂代谢的能力，并且还可能在脂质和能量代谢中发挥作用[60]，因此该家族蛋白称为脂质代谢和信号转导的潜在调节剂，这些蛋白质共有的保守结构基序预示着脂质合成和降解中的协同作用，ABHD家族功能活性鉴定已有报道，同时鉴定底物并将其与人类改变脂质代谢的疾病相关联[61]。已有的预测表明ABHD蛋白同时具有水解酶和酰基转移酶活性。ABHD家族蛋白在生理调节、药物靶点筛选、肿瘤发生等方面具有重要作用。1.3.1.1ABHD的生理调节功能ABHD在机体中可能作为一种生理调节剂，发挥一定的生理调节功能。Stoelting等证明D5多巴胺受体缺陷型（D5-/-）小鼠具中α/β水解酶1（ABHD1）的mRNA水平显着上调，D5-/-小鼠中ABHD1的上调可能是增加氧化应激，ABHD1在高血压发病机制中潜在的氧化应激调节剂[62]。ABHD3作为有机磷剂抑制剂参与调节内源性大麻素[63]，同样在ABHD6敲低细胞中，降低2-AG水解的同时提高刺激CB2介导的细胞迁移的效力，参与调节内源性大麻素信号传导[64]。具有类似功能的ABHD12作为内源性大麻素信号转导调节剂，在中枢和周围神经系统和眼睛中都起着重要作用[65]。在皮质切片中，发现ABHD6选择性阻断促进CB1R依赖性长期突触抑制[66]。ABHD4敲低后诱导失巢凋亡与PARP的切割和半胱氨酸蛋白酶-3的活化有关，该蛋白可以作为失巢凋亡敏感性的新型遗传调节因子[67]。Zuhl等通过基于竞争活性的蛋白质谱分析（ABPP）更广泛地筛选ABLs来对抗细胞和组织蛋白质组[68]，导致发现ABHD10可以作为铅抑制剂。ABHD15是一种磷酸化底物蛋白激酶（Akt/PKB），具有至少三个胰岛素诱导的磷酸化位点，稳定PDE3B负调节cAMP水平，参与脂肪分解的调节，但具有相反的脂肪代谢促进和抑制作用[69,70]。1.3.1.2ABHD作为潜在的药物靶点已有的研究证明ABHD有望成为新的药物靶点。其中ABHD2预测到具有水解酶催化活性，与野生型小鼠相比，在纯合小鼠中ABHD2参与SMC迁移和内膜增厚血管平滑肌细胞[71][72]，使用ASODNs下调ABHD2在不影响宿主细胞生理学的情况下阻断了HBV复制8 和表达，数据表明该基因可以作为抗HBV药物开发的新靶点[73]。ABHD7被预测到负调节环氧化物脂质的活性效应[74]。环氧化物水解酶3（EH3）即ABHD9，在小鼠皮肤和上消化道具有较高的表达量，推测sEH抑制剂可能作为治疗高血压和II型糖尿病的价值[75]。1.3.1.3ABHD具有多种酶活性ABHD具有脂肪酶的功能。LONG等通过非靶向代谢组学和应用识别含蛋白质α/β-水解酶结构域的3（ABHD3）作为选择性切割中链和氧化截短的磷脂的脂肪酶[76]。溶血-N-酰基磷脂酰乙醇胺脂肪酶（ABHD4），通过其对NAPE进行顺序脱酰基化，随后切割甘油磷酸酯以产生甘油磷脂酰甘油基乙醇胺（Gp-AEA）[77]。ABHD4作为溶血磷脂酶磷脂酶B，其选择性地水解NAPE和溶血NAPE[78]。其中ABHD5特异性共激活脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)[79]，该基因在所有脊椎动物中表达的α/β-水解酶折叠酶，羧基末端包括用于酰基转移酶活性的高度保守的共有序列（HXXXXD），是一种辅酶A依赖性溶血磷脂酸酰基转移酶，可以将储存的三酰甘油水解释放出的脂肪酸输送到磷脂中[80]。ABHD11作为一种脂肪酶，对天然脂肪酶底物设计的荧光活性测定显示人ABHD11可以利用丁酸对硝基苯酯（pNPC4），表明可在抑制剂发现中利用的脂肪酶/酯酶活性[81]。ABHD具有水解酶的功能。Blankman等发现大约15%的大脑2-AG水解酶活性由MAGL发挥功能，主要由两种未表征的酶丝氨酸水解酶ABHD6、ABHD12催化[82]。ABHD7(环氧化物水解酶4，EH4）属于脑限制性环氧化物水解酶，该基因亲核体丝氨酸残基被天冬酰胺残基取代，预测到负调节环氧化物脂质的活性效应。ABHD10负责人肝中麦考酚酸酰基葡糖苷酸的水解，因酰基葡糖苷酸与毒性相关，所以ABHD10可能起到解毒酶的作用[83]。该蛋白还会影响免疫毒性代谢物AcMPAG的形成[84]，结果表明HDFP及其类似物HDFP-alk与丝氨酸水解酶的特定子集反应。BrentR等证明丝氨酸水解酶显示出对脂质底物的强烈偏好，并且进一步指定与这些探针反应的未注释的丝氨酸水解酶，推测ABHD10、ABHD13、ABHD16A、FAM108可能是脂肪酶[85]。ABHD12属于是c20orf22和2-花生四烯酰葡萄糖水解酶，优先选择底物花生四烯酸甘油酯的1（3）和2-异构体2-花生四烯酸甘油[86]。Chambers等发现ABHD12为血浆中与肝酶的浓度相关的候选基因[87]。CCG1相互作用因子B(CIB)即ABHD14B，以剂量依赖性方式对普通脂肪酶底物-对硝基苯基丁酸酯有活性，CIB不同于其他α/β-水解酶，因为其缺少结合位点偏移，其促进了其他α/β-水解酶的底物选择性[88]。1.3.1.4ABHD与肿瘤发生ABHD蛋白在肿瘤发生过程中有望成为潜在的指示性分子。Kate等通过染色体构象捕获鉴定了四种候选SNP与ABHD8之间的相互作用，证明19p13处的多个SNP调节ABHD8表达，可能与乳腺癌和卵巢癌风险有关[89]。Cottrell开发了ABHD9和Chr3-EST的实时聚合酶链式反应检测方法，ABHD9甲基化与前列腺癌预后显着相关[90,91]。ABHD11同样具有9 丝氨酸水解酶活性并且对人肺腺癌具有预测潜力[92]。ABHD12在小胶质细胞中高度表达，该基因突变与称为PHARC的神经退行性疾病有因果关系[66]。已有的研究发现ABHD14A是自闭症谱系障碍相关的候选基因[66]，可能在神经元前体的分化或增殖中起作用[93]。ABHD14B可用于在转移性神经内分泌肿瘤的转移产物中鉴定原发性神经内分泌肿瘤起源的位点[94]。ABHD5又称CGI-58（Comparativegeneidentification-58），在脂质代谢和信号转导中发挥作用[95]，另外ABHD5揭示了作为ABHD蛋白家族作为酰基转移酶的作用，在白色脂肪组织中存在交替的胞质磷脂酸生物合成途径[96]。1.3.2ABHD16A生物学功能ABHD16A是α/β-水解酶结构域（Abhydrolasedomaincontaining,ABHD）代谢丝氨酸水解酶家族的一员，又称为人白细胞抗原-B（Leukocyteantigen-B，HLA-B）相关转录物5（HLA-Bassociatedtranscript5,BAT5）。目前已经报道的人ABHD16A位于人6号染色体，具有21个外显子，四个转录本，已有的研究表明四个转录本中含有两个非编码长链RNA。BAT5属于人类主要组织相容性复合体（MHC）III类内的一组基因，表明ABHD16A可能参与免疫调节[97-100]。鼠ABHD16A被发现在睾丸，心脏，肌肉和脑中，是具有最高mRNA转录水平的完整膜蛋白[60]。ABHD16A具有酰基甘油脂肪酶、磷脂酰丝氨酸脂肪酶活性，被表征为一个PG-G水解酶[101]。人ABHD16A多态性分析显示与川崎病和冠状动脉瘤易感性有关[102]，猪ABHD16A中的单核苷酸多态性与背部脂肪厚度有关[102]，这些研究结果表明ABHD16A可能参与脂肪组织功能和脂质代谢。Cai等发现CoroMarker、lnc-BAT5、IL21R-AS1作为候选CAD生物标志物[103]。Kim揭示ABHD16A与ABHD12一起揭示了lyso-PS的体内调节，为调节神经炎症反应提供了潜在的酶促靶标[104]。ABHD16A可能作为PG-G水解酶，在嗜中性粒细胞中调节PG-G和PG平衡来调节免疫[101]。进一步挖掘ABHD16A功能，有望为人类免疫和疾病相关问题的解决提供理论支持。10 第二章引言2.1研究的目的与意义实验室前期的初步研究显示，在过量表达sIFITM的细胞中，JEV的复制明显受到影响，本研究为进一步研究sIFITM抗JEV作用和其抗病毒机制，并对sIFITM抑制JEV复制过程中炎症发生机理进行初步探究。对sIFITM相互作用蛋白的研究以及该相互作用在JEV感染所引起炎症反应中的调节，希望有助于人们对IFITM抗病毒机制的理解，并为乙型脑炎的防控提供了理论依据。2.2主要研究内容2.2.1sIFITM抑制JEV病毒研究（1）过表达sIFITM1、sIFITM2、sIFITM3蛋白，探究sIFITM对JEV复制的影响。（2）通过构建CRISPR/cas9敲除载体，探究敲除sIFITM对JEV复制影响。2.2.2sIFITM与sABHD16A蛋白的相互作用研究（1）sABHD16A蛋白生物信息学分析，多序列比对和构建系统进化树，解析sABHD16蛋白的进化，克隆猪sabhd16a基因，构建sabhd16a的真核表达载体。（2）通过构建酵母双杂交体系验证sIFITM与sABHD16A相互作用关系。（3）通过sIFITM1、sABHD16A亚细胞定位，探究JEV病毒侵染过程蛋白发挥的作用。2.2.3sIFITM1抗JEV病毒机制的研究（1）过表达sABHD16A，探究sABHD16A对JEV病毒复制的影响。（2）构建CRISPR/cas9敲除载体pHMG-sgRNA-ssgRNAabhd16a，探究sABHD16A敲除后对JEV复制的影响。（3）共过表达sIFITM1、sABHD16A感染病毒后，探究sABHD16A、sIFITM1在抑制JEV复制中的作用。（4）构建sIFITM1的S-棕榈酰化位点突变体，研究sIFITM1的S-棕榈酰化对抑制JEV复制的影响。2.2.4sIFITM和sABHD16A表达对细胞因子表达的影响（1）通过感染JEV(SA14-14-2)病毒感染后，检测sifitm1、sifitm2、sifitm3、sabhd16a基因表达量，进一步阐释基因在JEV中的作用。（2）过表达sIFITM1、过表达sIFITM1感染JEV、过表达sABHD16A、过表达后感染JEV，检测炎性细胞因子MCP-1、IL6、TNFα、IL1β、IL10、COX2表达，阐释sIFITM、sABHD16A、JEV在炎症发生过程中的作用。11 2.3技术路线图2-1：技术路线Fig2-1:Technologyroadmap.12 第三章猪IFITMs抗乙型脑炎病毒作用的研究3.1材料与方法3.1.1材料3.1.1.1实验材料pcDNA3.1(+)-HA、pEGFP-N1载体由本实验室构建与保存。人胚肾细胞HEK293、猪肾细胞PK15、乳仓鼠肾细胞BHK-21、猪睾丸细胞ST、人正常肝细胞L02、人肾上皮派生细胞HEK293T，均由本实验室保存。乙型脑炎病毒疫苗株（SA14-14-2）由河南省农科院馈赠。3.1.1.2实验仪器主要使用仪器见表3-1。表3-1试验所需主要仪器设备Table3-1Themainequipmentrequiredforthetest.仪器名称型号生产厂家普通PCR仪TProfessionalBiometra微量天平称EP214COhaus公司医用冷冻冰箱BCD-219河南新飞电器有限公司高压灭菌锅LX-C50L合肥华泰医疗设备有限公司pH调节器FE20MettlerToledo公司光学倒置显微镜EclipseE100Nikon公司干燥箱（鼓风型）DHG-9426A上海圣欣科学仪器有限公司电泳仪DYY-8C北京六一仪器厂微量分光光度计NanoDrop1000ThermoScientific公司低温冷冻离心机AllegraTMX-22RSigma公司凝胶成像系统GBOXSYDR4/1490Syngene公司台式高速离心机5415DEppendorf公司-80℃超低温医用冰箱DW-HL388中科美菱低温科技有限公司电热恒温水浴锅DK-8D上海精宏实验设备有限公司液氮罐YDS-10-80乐山市东亚机电工贸有限公司CO2恒温培养箱MCO175SANYOELECTRIC公司13 3.1.1.3实验试剂与耗材实验试剂：RNAisoplus购自Sigma公司；DMEM高糖培养基购自Hyclone公司；FCS购自杭州四季青生物有限公司；氨苄青霉素（Amp）和卡纳霉素(Kana)、胰蛋白酶、琼脂糖均购自北京索莱宝生物科技有限责任公司；HiScript®IIQRTSuperMixforqPCR购自Vazyme公司；焦磷酸二乙酯(DEPC)购自Sigma公司、2×Taqmix购于康为有限公司，POLOdeliverer3000购自于上海锐赛有限公司。10μL、200μL、1mL枪头、50mL高速离心管，2mL、1.5mLEP管，细胞冻存管2mL细胞冻存管均购自于Biosharp。电动移液器，12、24、6孔细胞培养板，5mL移液管，巴氏细胞吸管等。实验所有需要合成引物均由武汉金开瑞生物有限公司合成。主要试剂及其配制方法：SolutionI：25mMTris-HCl（pH8.0），10mMEDTA，50mMGlucose（配制量1L）；量取下列溶液进行配制：25mL1MTris-HCl（pH8.0）；20mL0.5MEDTA（pH8.0）；45mL20%Glucose（1.11M）；910mLddH2O；置于1L烧杯中，115℃，15min，高温高压灭菌后，4℃保存。SolutionII：250mMNaOH，1%（W/V）SDS，（配置量50mL）；量取下列溶液置于50mL烧杯中：5mL10%SDS；5mL2MNaOH；加灭菌水定容至50mL，充分混匀。SolutionIII：3MKAc，5MCH3COOH，PH=4.8，（配置量500mL）量取下列溶液置于500mL烧杯中：147gKAc；57.5mLCH3COOH；加入300mL去离子水后搅拌溶解。用CH3COOH调节PH至4.8；加去离子水将溶液定容至500mL。STE：0.1mmol/LNaCl；10mmol/LTris-HCl(pH8.0)；1mmol/LEDTA(pH8.0)；5%TritonX-100。TE：10mMTris-HCL（pH8.0）；1mMEDTA（pH8.0）配置方法：1MTris-HCL（pH8.0）：5mL；0.5MEDTA（pH8.0）：1mL；加超纯水至：500mL；121℃，20min，高温高压灭菌。40%PEG8000-MgCl2：0.4gPEG8000加入1.5mLEp管中，加入0.5mL30mM的MgCl2溶解。1MTris-HCL（pH8.0）：称取Tris(MW121.14)121.14g；（2）蒸馏水800mL；（3）溶解后，用浓盐酸调pH至8.0，加入蒸馏水定容至1000mL，室温下保存。0.5MEDTA（pH8.0）（配制体积1L）配制方法：（1）称取186.1gNa2EDTA·2H2O，置于1L烧杯中。（2）加入约800mL的去离子水，充分搅拌。（3）用NaOH调节pH值至8.0（约20gNaOH；注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解）。（4）加去离子水将溶液定容至1L。121℃，20min，高温高压灭菌，室温保存。电泳缓冲液(50×TAE)：Tris-base242g加入到700mL双蒸水中，再加入冰醋酸57.1mL；14 100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)；用双蒸水定容至1000mL。0.8%琼脂糖凝胶：取50×TAE10mL，加dH2O定容至500mL，取混合液(1×TAE)100mL加入琼脂糖0.8g，微波炉加热溶解。G418：将G418溶解于1×PBS中，储存浓度400μg/mL，保存于-20℃。嘌呤霉素：将嘌呤霉素溶解于1×PBS中，储存浓度4μg/mL，保存于-20℃。胰蛋白酶：称取0.25g胰蛋白酶溶解于10mL1×PBS中，分装保存于-20℃。SDS-PAGE电泳试剂以及溶液：10%(W/V)过硫酸铵：称取0.1gAPS，加入1mLddH2O，保存于4℃（两周内用完）。5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris15.1g；Gly94g；SDS5g，加入800mLddH2O，充分溶解后，定容至1L。PBS：Na2HP0410mM；NaCl20mM；KCl68mM；KH2P041.75mM(pH7.4)；4℃保存。10×lysisbuffer：1mMEDTA；Tris-HCI20mmol/L(pH7.5)；NaCl150mM；EGTA1mM；TritonX-1001%；Sodiumpyrophosphate2.5mM；β-Glycerrophosphate1mM；Leupeptin10mg/mL，-20℃保存。2×SDSbuffer：Tris-HCl(pH6.8)25mM；SDS4%；甘油20%；DTT100；溴酚蓝0.02%，室温保存。10×Loadingbuffer(pH8.8)100mL：Tris-base42.25g；10%SDS10mL，室温保存。4×Loadingbuffer(pH6.8)100mL：Tris-base6.06g；10%SDS4mL，室温保存。电泳缓冲液：Tris-base0.125M；甘氨酸0.96mM；10%SDS，甲醇0.5%，室温保存。电转缓冲液：Tris-base25mM；甘氨酸0.2mM；甲醇10%，室温保存。10×TBS(pH7.6)：Tris-base2.42%；NaCl8%，室温保存。TBST：1×TBS；0.1%Tween-20，室温保存。3.1.2方法3.1.2.1细胞培养试验所用细胞皆为单层贴壁细胞，培养方法如下：（1）从保存的液氮罐中取冻存细胞冻存管，置于37℃水浴锅中，轻轻晃动至完全融化。（2）在超净工作台中，将融化后细胞通过电动移液器转入无菌15mL离心管中，加入5mL事先预热37℃的培养基，1000r/min室温离心5min，收集细胞。（3）弃去离心后上清，将收集的细胞和5mL事先预热37℃含有10%FCS的DMEM完全培养基加入15mL离心管中，轻轻用移液管吹打细胞。（4）将重悬后的细胞悬液放置于T25细胞培养瓶中，5%CO2，37℃培养。（5）24h后观察细胞状态，观察是否复苏成功，之后每天观察记录细胞状态。定期更15 换至新鲜的培养基。（6）当细胞扩增生长至75%以上时进行传代，加入事先预热37℃的5mL1×PBS清洗细胞后，加入0.5mL0.025%胰蛋白酶，置于37℃，3-5min（根据培养细胞种类不同，胰蛋白酶消化时间不同），吸去胰蛋白酶，加入含有10%FCS的DMEM完全培养基进行吹打至细胞分散，每次传代根据细胞种类的不同，将1/3-1/4转移至新T25细胞培养瓶中，添加新鲜培养基至5mL，37℃，5%CO2条件下培养。细胞冻存：（1）将生长状态较好的细胞加入5mL1×PBS清洗细胞后，加入0.5mL0.025%胰蛋白酶，置于37℃，3-5min（根据培养细胞种类不同，胰蛋白酶消化时间不同），吸去胰蛋白酶。（2）加入含有10%FCS、10%DMSO的DMEM完全培养基进行吹打，吹打成单细胞悬浮液后，将含有细胞的冻存液转移至细胞冻存管中，每1.5mL细胞冻存管中加入1mL含有细胞的冻存液，转移细胞冻存管至程序性细胞冻存盒中，置于-80℃放置16-20h，然后转移细胞冻存管于液氮罐中，进行长期保存留种。3.1.2.2sIFITMs真核表达载体的构建1、细胞总RNA提取和cDNA第一条链的合成贴壁细胞RNA的提取：（1）将原有T25细胞培养瓶中培养基完全倒出，用10mL1×PBS清洗2次。（2）加入1mL的RNAisoPlus至T25细胞培养中，水平放置室温裂解10min，充分裂解细胞，使用移液枪吹打细胞使其脱落（对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞）。（3）将上述的裂解液转移至灭菌后1.5mLEP管中，混合裂解液，充分裂解。（4）室温，静置5min。（5）向裂解液中至氯仿200μL，剧烈振荡15s。使得溶液充分乳混合，室温放置10min。（6）12000g，4℃，离心15min。（7）将上清中液体转移至新的1.5mLEP管中。（8）向含有上清的1.5mLEP管加入等体积的异丙醇，混匀后，室温放置10min。（9）12000g，4℃，离心10min。（10）弃上清，加入75%的乙醇lmL，上下颠倒混匀，12000g，4℃，离心5min，后弃去乙醇。（11）室温干燥沉淀2-5min，加入适量的DEPC水溶解沉淀，溶解后于-80℃保存。2、cDNA第一条链的合成（1）基因组DNA去除。在RNasefree的离心管中配制如下混合液：4×gDNAwiper16 Mix2μL；模板RNATotalRNA1pg-500ng；加入RNasefreeddH2O至8μL；用移液器将以上液体混合轻轻吹打混匀。在恒温水浴锅中，42℃，反应2min。（2）配制逆转录反应体系。在上步反应管中加入5×HiScriptIIqRTSuperMixII5μL，用移液器轻轻吹打混匀。（3）进行逆转录反应。PCR中25°C：10min；50°C：30min；85°C：5min。（4）反应结束后产物，可立即用于PCR反应，或保存在-80°C。3、引物设计与合成根据连接的表达载体pcDNA3.1-HA、pEGFP-N1的不同，根据报道的sifitm1、sifitm2、sifitm3序列设计合成含有不同酶切位点的引物，根据融合表达的需要，引物设计时考虑终止密码子的保留与否，连接至pEGFP-N1采用EcoRⅠ（F），BamHⅠ(R)酶切位点。连接至pcDNA3.1-HA采用BamHⅠ(F)、EcoRⅠ（R），运用软件Oligo7设计特异性引物，并送引物合成公司合成，引物序列如表3-2。表3-2构建真核表达载体所用引物Table3-2Primersforconstructionofeukaryoticexpressionvectors引物名称序列（5’-3’）susscrofaifitm1E-FCGGAATTCATGATCAAGAGCCAGCACsusscrofaifitm1B-RCGGGATCCCGGTAGCCTCTGTTACTCTTTGsusscrofaifitm2E-FCGGAATTCATGAACTGCGCTTCCCAGCCsusscrofaifitm2B-RCGGGATCCCGGTAGCCTCTGTTACTCTTTGsusscrofaifitm3E-FCGGAATTCATGAACTGCGCTTCCCAGCCsusscrofaifitm3B-RCGGGATCCCGGTAGCCTCTGTAATCCTTTAsusscrofaifitm1B-FCGGGATCCATGATCAAGAGCCAGCACGAsusscrofaifitm1E-RCGGAATTCCTAGTAGCCTCTGTTACTCTsusscrofaifitm2B-FCGGGATCCATGAACTGCGCTTCCCAGCCsusscrofaifitm2E-RCGGAATTCCTAGTAGCCTCTGTTACTCTTTGsusscrofaifitm3B-FCGGGATCCATGAACTGCGCTTCCCAGCCsusscrofaifitm3E-RCGGAATTCCTAGTAGCCTCTGTAATCCTTTA4、目的基因的扩增与回收提取PK15细胞的RNA，反转录合成第一条链cDNA为模板，用以上设计引物进行特异性扩增目的片段。PCR反应体系如表3-3所示，PCR反应程序如表3-4所示。17 表3-3PCR反应体系Table3-3ThereactionsystemofPCR组分（Components）体积引物F（10μM）1μL引物R（10μM）1μLdNTPsmixture(2.5mMeach)4μL5×PrimeSTARBuffer4μLPrimeSTARPolymerase(2.5U/μL)1μLddH2O38.5μLcDNA模板0.5μL表3-4PCR反应程序Table3-4ThereactionprogramofPCRStepTemperatureTime198℃2min298℃10s3Tm*20s472℃30s(2to40cycle)572℃5min反应完成后，产物中加入10μL6×DNAloadingBuffer，轻轻混匀后，2%琼脂糖凝胶电泳(120V，25min)检测，UV凝胶成像系统照相保存。根据GeneMark公司PlusDNAClean/ExtractionKit试剂盒说明书对扩增目的条带进行回收目的DNA片段。5、酶切、酶连将回收后的DNA片段和目的载体pcDNA3.1-HA、pEGFP-N1分别进行双酶切反应，双酶切体系如表3-5。表3-5双酶切反应体系Table3-5Doubleenzymereactionsystem组分（Components）体积(Volume)10×NEBCutSmartBuffer5μL*EcoRⅠ1μL*BamHⅠ1μL载体/目的片段2μL（1μg）ddH2O41μL将上述反应液于离心管中混匀，置于水浴锅中，37℃，6h，取5μL酶切产物加入1μL6×DNALoadingBuffer将酶切产物通过2%琼脂糖凝胶电泳验证酶切是否完全。将验证正确的双酶切目的片段与载体通过GeneMark公司PlusDNAClean/Extraction18 Kit试剂盒进行回收。通过凝胶回收纯化的DNA片段，通过NanoDrop-1000测定回收DNA片段和载体浓度，根据摩尔比为1︰3分别加入连接载体和目的片段连接，反应体系见表3-6。将上述反应体系加入离心管进行中，于4℃过夜进行连接反应。表3-6目的片段与载体连接反应体系Table3-6Reactionsystemofthetargetfragmentandvector组分（Components）体积目的载体双酶切回收产物*1μLT4DNAligase1μL10×T4DNALigaseBuffer1μLddH2OUpto20μL40%PEG80003μL待插入片段**待插入片段体积根据琼脂糖凝胶回收浓度，计算与目的基因载体的摩尔比确定加入DNA量。6、DH5α感受态的制备（1）将-80℃保存的大肠杆菌DH5α划线在无抗性LB平板上，37℃培养16h活化。（2）挑取无抗性LB平板上经活化后的DH5α单菌落于5mLLB液体培养基，220r/min，37℃，16h培养。（3）取活化后的菌液，按照1︰1000接种于锥形瓶200mLLB培养基中，220r/min，37℃，至菌液OD600≈0.8，将扩摇后培养瓶放置于冰水混合中，至少放置30min。（4）将菌液重悬预冷后的50mL离心管，4℃，4000r/min，离心15min，收集菌体。（5）弃去LB，加入菌液1/10体积0.1MMgCl2溶液重悬菌体，冰浴至少20min。（6）4℃，4000r/min，15min，离心收集菌体，弃去上清。（7）加入1/50体积CaCl2重悬菌体，冰浴至少1h。（8）加入适量灭菌后50%甘油至其终浓度至10%-15%。（9）分装在1.5mLEP管中，迅速放入液氮，存放于液氮30min以上后，转存于-80℃。7、重组质粒的转化（1）将连接后产物加入至DH5α感受态中，冰上孵育25min。（2）42℃热激90s，热激后置于冰上2min，取出后加入不含有抗性的LB培养基，置于37℃，220r/min，复苏1h。（3）将复苏后的菌液于室温，4000r/min，离心2min，收集转化菌体，弃多余LB培养基，将菌体用100μLLB培养基重新悬浮。（4）涂布含有连接至pcDNA3.1-HA的重组质粒涂布100μg/mL(Amp)氨苄青霉素LB固体培养基，将含有连接至pEGFP-N1的重组质粒涂布50μg/mL(Kana)卡那霉素LB固体培养基，将转化后的菌液通过离心收集，4000r/min，室温离心2min收集菌体，弃上清，重悬于100μLLB后，均匀涂布于相应抗性平板中，在37℃生化培养箱中正置培养30min19 后，倒置培养过夜。6、重组质粒的验证挑取在相应抗性LB平板中的单菌落，将含有重组质粒的pcDNA3.1-HA-sifitm1、pcDNA3.1-HA-sifitm2、pcDNA3.1-HA-sifitm3单菌落分别接种于含有100μg/mL(Amp)氨苄青霉素LB液体培养基中，将含有pEGFP-N1-sifitm1、pEGFP-N1-sifitm2、pEGFP-N1-sifitm3单菌落分别接种于50μg/mL(Kana)卡那霉素LB液体培养基中，37℃，220r/min，12h，将菌液用于菌液PCR验证。菌液PCR验证PCR反应体系见表3-7，菌液PCR验证PCR反应程序见表3-8。表3-7重组质粒菌液PCR验证体系Table3-7PCRvalidationsystemforrecombinantplasmids组分（Components）Volume2×Taqpolymerasemix5μLPrimer-F(10μM)0.3μLPrimer-R(10μM)0.3μL菌液1μLddH2O3.6μL表3-8重组质粒菌液PCR验证程序Table3-8RecombinantplasmidbacteriaPCRverificationprocedureStepTemperatureTime195℃2min295℃30s3Tm*30s472℃30s(2to431cycle)572℃10min*Tm：sifitm1、sifitm2、sifitm3退火温度分别为：57℃、50℃、56℃。将反应结束后的PCR反应液，取5μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测阳性重组质粒。将PCR验证正确的阳性质粒送于北京华大基因有限公司测序。3.1.2.3sIFITMs过表达细胞系的构建1、质粒的提取及纯化将公司测序验证正确的阳性重组质粒进行扩增并提取纯化，步骤如下。（1）从-20℃保存的甘油重组质粒菌液吸取50µL菌液，接种5mL的相应抗性液体培养基LB中，37℃振荡培养至OD600大于1.6~1.8，220r/min，14h。（2）取上步2mL的菌液于200mLLB液体培养基中，37℃，220r/min培养至OD600大于2.0以上，约16h。（3）取上步菌液，50mL离心管，4℃，4000r/min，离心15min，收集菌体，200mL平均收集到两个50mL离心管中。20 （4）弃上清，敞开管口，倒置，让上清全部流尽。（5）用预冷的40mLSTE充分悬浮菌体沉淀。（6）4℃，6000r/min，离心10min。（7）弃上清，敞开管口，倒置，让上清全部流尽。（8）用预冷的6mLSolutionI充分悬浮菌体沉淀。（9）加入新鲜配制的12mLSolutionII，上下颠倒数次，置于冰上10min。（10）加入预冷的溶液Ⅲ7mL，迅速上下颠倒充分混匀后，冰上放置10min。（11）4℃，8000r/min，离心15min。（12）收集上清，加等体积的异丙醇，室温放置30min。（13）4℃，8000r/min，离心10min，如果有沉淀，取上清再次离心。（14）弃上清，用30mL70%乙醇洗涤沉淀两次，室温放置20min，沉淀溶于3mLTE中。（15）加入3mL预冷的5moL/L的LiCl，混匀后，4℃，8000r/min,离心10min。（16）取上清至新的50mL离心管中，加入等体积异丙醇，室温15min，8000r/min，离心15min。（17）在离心管中加入70%乙醇20mL，洗涤沉淀2次，室温晾干。（18）每个50mL离心管中，加入1mLTE，转移至2mL离心管中，加入浓度20mg/mLRNaseA10µL，室温放置30min。（19）加入等体积的酚：氯仿：异戊醇=25：24：1，混匀，4℃，12000r/min，离心10min。（20）取上清转移至新的2mLEP管，加入等体积氯仿，混匀，4℃，12000r/min，离心10min。（21）取上清，加入两倍体积的无水乙醇，加入上清1/10体积4MLiCl，-20℃放置60min。（22）4℃，12000r/min，离心10min。（23）沉淀用1mL70%乙醇洗涤2次，室温晾干20min。（24）加入1mLddH2O溶解。（25）每个1.5mL离心管中加入0.5mL新配制的40%PEG8000-MgCl2溶液，混匀，室温放置30min。（26）室温，12000r/min，离心20min。（27）加入1mL70%乙醇，4℃，12000r/min，离心5min。重复此步。（28）沉淀室温晾干20min。（29）加入TritonX-114使得在TE溶液中终浓度的为1%，冰浴10min，然后42℃，10min，室温，12000r/min，离心5min，吸取上清加入预冷的1.5mL离心管中。（30）加入2倍体积的无水乙醇，加入上清1/10体积4MLiCl，-20℃下沉淀60min。（31）4℃，12000r/min，离心10min，弃上清，70%乙醇洗沉淀3次，室温晾干，加入400µLddH2O溶解。将纯化后的质粒通过NanoDrop-1000测定浓度，用1%琼脂糖凝胶电泳，21 120v，30min，检测质粒纯度。2、PK15细胞培养及质粒转染（1）于转染前一天，接种2×105个PK15细胞至6孔板中，每孔2mL完全培养基（无双抗），置于细胞培养箱，使转染前细胞密度约60-70%。（2）按照每孔4μgDNA和8μLPOLOdeliverer3000分别稀释于50μLDMEM培养基中，混匀后室温放置5min。（3）将上述POLOdeliverer3000稀释后溶液滴加到稀释后DNA溶液中，轻轻混匀，室温静置15min。（4）将上述混合物均匀滴加到6孔板细胞中，轻轻摇匀。（5）将转染的细胞在37℃，5%CO2条件下培养48-72h，在转染12h后换液。转染完成后48h，倒置绿色荧光显微镜观察绿色融合蛋白表达情况。3、过表达细胞系的筛选（1）转染48h后，移去含10%FCS的DMEM完全培养基，加入1×PBS清洗3遍。（2）加入0.025%胰蛋白酶，室温，5min，消化细胞。（3）将6孔板细胞传代于24孔板，每孔加入0.5mL完全培养基，37℃，5%CO2培养。（4）培养24h后，加入G418，使其终浓度为800ng/mL。（5）之后每48h更换一次含有G418终浓度为800ng/mL的完全培养基。（6）连续培养至转染组细胞无继续死亡的细胞为止，消化至单个细胞传代于96孔板中，37℃，5%CO2培养继续培养至出现单细胞团。（7）荧光显微镜下观察单细胞团，选择绿色荧光表达较强的细胞团传代扩大培养。3.1.2.4sIFITMs敲除载体的构建1、根据NCBI已经提交的数据库，通过在线设计网站（crispr.mit.edu/），遵循CRISPR/Cas9的sgRNA设计原则，由于sifitm2未找到合适靶点，只设计并合成了sifitm1和sifitm3的Oligos。序列见附表。2、构建方法（1）将合成的Oligos按照溶解说明，将Oligos溶解为终浓度100μM，用于下游实验。（2）Oligos退火程序：退火程序见表3-9。表3-9引物退火程序Table3-9Primerannealingprocedure所需试剂体积OligoF（100μM）1μLOligoR（100μM）1μL1×退火缓冲液8μL将以上溶液混合于PCR管内，在PCR仪中以每分钟1.5℃逐渐从95℃降至22℃。（3）程序反应结束后，将退火后的引物置于冰上，按照表3-10的配制反应体系，将反应液22 混合后，4℃连接过夜。表3-10连接反应体系Table3-10Theconnectionreactionsystem所需试剂体积pHMG-SgRNA线性化质粒1.0μLT4DNAligase1.0μL5×T4DNALigaseBuffer2.0μLddH2O5.5μL退火产物0.5μL（4）将以上连接后产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素（Amp）的培养基，37℃培养12-16h。（5）挑取抗性单克隆菌落，置于5mL液体培养基试管中，加入氨苄青霉素（Amp），37℃，220r/min震荡培养15h。（6）吸取菌液进行PCR验证，PCR反应体系见表3-11。表3-11转化子验证体系Table3-11Transformervalidationsystem所需试剂体积菌液0.5μLpHMG-SgRNA-F测序引物0.5μLOligoR0.5μL2×Taqmix5.0μLddH2O3.5μL表3-12转化子验证PCR程序Table3-12TransformerValidationPCRProgramStepTemperatureTime195℃2min295℃30s357℃30s472℃30s(2to43cycle)572℃10min将PCR验证为阳性结果的质粒送至华大基因有限公司北京测序部测序，通过DNAMAN序列比对合成Oligos序列。3.1.2.5病毒感染（1）于转染前一天将6×104个细胞铺板于24孔板中，（2）将携带有目的片段的阳性质粒转染细胞，转染24h后，将完全培养基移去，加入1×PBS，清洗细胞表面3次。（3）按1MOI（感染复数）加入JEV（SA14-14-2）病毒稀释液，37℃二氧化碳培养箱中吸附2h，期间每隔30min，轻轻晃动一次。23 （4）移去吸附后的病毒液，每24孔板中加入0.5mL含有10%FCS的DMEM完全培养基，37℃、5%CO2培养。（5）分别取感染后24h、48h、72h培养上清，按照以下病毒RNA提取方法提取病毒RNA：a、在1.5mL的Ep管中加入培养上清500μL，再加入RNAisoplus500μL，充分混匀，室温放置10min。b、加入200μL的氯仿，用力震荡离心管，室温放置10min。c、4℃，12000r/min，离心15min，取上层液相移入新的1.5mLEP管中。d、加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min。e、4℃，12000r/min，离心15min，用枪小心吸去所有上清。f、1mL75%乙醇洗一遍，4℃，8000r/min离心10min，用枪小心吸去所有上清，在超净台中干燥10min。g、加入适量DEPC水，冻存于-80℃保存。（6）按试剂盒的操作要求反转录合成cDNA第一条链，用于RT-PCR定量检测。3.1.2.6RT-PCR检测病毒将病毒RNA合成cDNA第一条链，用于RT-PCR检测病毒拷贝数，根据NCBI数据库SA14-14-2中E基因序列，设计合成用于RT-PCR检测引物见表3-13，RT-PCR反应体系和反应程序分别见表3-14和表3-15。表3-13RT-PCR引物序列Table3-13PrimerssequencesforRT-PCRdetection引物名称序列（5’-3’）JEV-E-FACTGACATCTCGACGGTGGCJEV-E-RCTCCCAATCGCTTTACTGGT根据AceQQpcrSYBRGreenMaster试剂盒说明书，将RT-PCR反应程序设计如表3-14。表3-14RT-PCR反应体系Table3-14RT-PCRreactionsystem组分（Components）体积JEV-E-F（10μM）0.3μLJEV-E-R（10μM）0.3μLAceQQpcrSYBRGreenMasterMix5μLddH2O3.6μL24 表3-15RT-PCR反应程序Table3-15RT-PCRReactionProceduresStage195℃5minStage295℃10s（40cycle）58℃30sStage395℃15s60℃60s95℃15s3.1.2.7WesternBlot检测蛋白表达1、蛋白电泳（1）将玻璃板用去离子水洗净，放置，待玻璃板晾干后，将两块玻璃板固定于固定架。12%分离胶的配制：在干净的50mL小烧杯中加入以下试剂：蒸馏水1.0mL；30%Acr-Bis2.0mL；1MTris（pH8.8）1.9mL；10%SDS0.05mL；10%APS（过硫酸铵）0.05mL，TEMED0.004mL，快速将以上溶液混匀，加入凝胶制备板中，上层加入2mL的无水乙醇，静置40min。（2）弃去上层无水乙醇，用滤纸沿边缘将多余的无水乙醇除去，然后加入5%的浓缩胶，加入上样梳。放置1h后，可用于试验。5%浓缩胶配制：蒸馏水1.4mL；30%Acr-Bis2.00mL1MTris（pH8.8）0.25mL；10%SDS0.02mL；10%APS（过硫酸铵）0.02mL，TEMED0.004mL。（3）待凝胶凝固后，将凝胶放入电泳槽中，加入适量的SDS-PAGE电泳缓冲液后，将上样梳轻轻拔出。（4）蛋白样品浓度测定按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度，用移液器将制备完成的蛋白样品，等蛋白总浓度加入上样孔，70V恒压，30min，后110V恒压，120min。（5）电泳结束后，将含有凝胶的玻璃板取出，进行下一步的Westernblot试验。2、Westernblot检测（1）裁剪与凝胶分离胶大小相同的醋酸纤维（PVDF）膜，放置于甲醇中激活60s，迅速取出后，待甲醇挥发后，再次将PVDF膜加入甲醇中10s，放置于转膜缓冲液中备用。（2）裁剪通凝胶分离胶一致大小的滤纸，置于转膜缓冲液中，备用。（3）以夹板-海绵-滤纸-滤纸-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-滤纸-滤纸-海绵-夹板，将各层之间的气泡赶尽。（4）将3步骤中的夹心放入转膜槽中，加入转膜缓冲液，200mA恒流，转膜120min。（5）转膜完成后，将PVDF膜置于甲醇，10s，取出后，灭菌的去离子水洗去甲醇。（6）将PVDF膜置于10mL封闭液中，置于摇床30r/min，室温，孵育封闭2h。（7）孵育结束后，弃去封闭液，加入10mL1×TBST，每次5min，清洗PVDF膜3次。25 （8）将PVDF膜放置于稀释后的合适的一抗中，4℃孵育过夜。（9）弃去孵育一抗稀释液，加入中10mL1×TBST，每次5min，清洗PVDF膜3次。（10）将PVDF膜加入合适稀释倍数的二抗，置于摇床30r/min室温孵育封闭1h。（11）弃去孵育二抗稀释液，加入10mL1×TBST，每次5min，清洗PVDF膜3次。（12）将PVDF膜放置于暗盒中，用以底物发光。（13）将ECL发光液A液和B液各取1mL，混合后放置5min，将PVDF膜放入混合液中孵育2min，将多余的发光液沥尽，放入暗盒进行底物胶片发光显影。（14）取合适大小的显影胶片，置于PVDF膜上方，关上暗盒，根据不同试验要求，曝光时间不同，一般在10s-300s。（15）曝光结束后，将曝光后的胶片置于显色液中，轻轻晃动，显色5min，后用镊子取出胶片，置于蒸馏水中清洗两次，每次10s。（16）将胶片置于定影液中约10min，取出，置于蒸馏水中清洗2次，每次10s。（17）将曝光后的胶片置于通风处晾干后，拍照保存。3.2结果与分析3.2.1sIFITMs真核表达载体构建的结果通过基因克隆和载体构建，经PCR和测序验证显示结果正确，成功构建了两类真核融合表达载体pcDNA3.1-HA-sifitm1、pcDNA3.1-HA-sifitm2、pcDNA3.1-HA-sifitm3、pEGFP-N1-sifitm1、pEGFP-N1-sifitm2、pEGFP-N1-sifitm3真核表达载体。结果分别如图3-1和图3-2。图3-1：pEGFP-N1-sifitm1、pEGFP-N1-sifitm2、pEGFP-N1-sifitm3重组质粒的构建图A：sifitms目的片段的扩增（M：DM2000DNAMarker；1：sifitm1PCR扩增片段；2：sifitm2PCR扩增片段；3：sifitm3PCR扩增片段；B：sifitm2目的片段PCR扩增（M：DM2000DNAMarker；1-2：26 sifitm2）；C：pEGFP-N1-sifitm1、pEGFP-N1-sifitm3重组质粒菌液PCR(M：DM2000DNAMarker；1：sifitm1CK；2-5：pEGFP-N1-sifitm1；6：sifitm3CK；7-10：pEGFP-N1-sifitm3)；D：pEGFP-N1-sifitm2重组质粒菌液PCR(M：DM2000DNAMarker；1-2：pEGFP-N1-sifitm2)Figure3-1:ConstructionofpEGFP-N1-sifitm1、pEGFP-N1-sifitm2、pEGFP-N1-sifitm3recombinantplasmidsFigureA:Amplificationofthetargetfragmentofsifitms(M:DM2000DNAMarker;1:sifitm1PCRamplifiedfragment;2:sifitm2PCRamplifiedfragment;3:sifitm3PCRamplifiedfragment;B:sifitm2targetfragmentPCRamplification(M:DM2000DNAMarker;1-2:sifitm2);C:pEGFP-N1-sifitm1,pEGFP-N1-sifitm3recombinantplasmidbrothPCR(M:M:DM2000DNAMarker;1:sifitm1CK;2-5:pEGFP-N1-sifitm1;6:sifitm3CK;7-10:pEGFP-N1-sifitm3);D:pEGFP-N1-sifitm2recombinantplasmidbrothPCR(M:DM2000DNAMarker;1-2:pEGFP-N1-sifitm2)图3-2：pcDNA3.1-HA-sifitms的重组质粒构建PCR验证A：sifitms目的片段的扩增M：DM2000DNAMarker；1：CK2：sifitm1PCR扩增片段；3：sifitm2PCR扩增片段；4：sifitm3PCR扩增片段；B：pcDNA3.1-HA-sifitm2、pcDNA3.1-HA-sifitm3菌液PCR（M：DM2000DNAMarker；1-2：pcDNA3.1-HA-sifitm2菌液PCR验证；3-4：pcDNA3.1-HA-sifitm3菌液PCR验证Figure3-2:ConstructionofpcDNA3.1-HA-sifitmsrecombinantplasmidsA:Amplificationofthetargetfragmentofsifitms(M:DM2000DNAMarker;1:CK2:sifitm1PCRamplifiedfragment;3:sifitm2PCRamplifiedfragment;4:sifitm3PCRamplifiedfragment;B:pcDNA3.1-HA-sifitm2,pcDNA3.1-HA-sifitm3bacterialcellPCR(M:DM2000DNAMarker;1-2:pcDNA3.1-HA-sifitm2PCRverification;3-4:pcDNA3.1-HA-sifitm3bacterialPCRvalidation3.2.2sIFITMs敲除载体构建的结果PCR结果显示（图3-3），成功构建了用于分别敲除sIFITM1和sIFITM3基因的载体：pHMG-sgRNA-ssgRNAifitm1-1、pHMG-sgRNA-ssgRNAifitm1-2、pHMG-sgRNA-ssgRNAifitm3。27 图3-3：ssgRNAifitm1、ssgRNAifitm3敲除重组质粒构建菌液PCR结果M：Marker；1-3：pHMG-sgRNA-ssgRNAifitm1-1；4-6：pHMG-sgRNA-ssgRNAifitm1-2；7-8：pHMG-sgRNA-ssgRNAifitm3-1Figure3-3:ConstructionofssgRNAifitm1andssgRNAifitm3knockoutrecombinantplasmidsM:DM2000DNAMarker;1-3:pHMG-sgRNA-ssgRNAifitm1-1;4-6:pHMG-sgRNA-ssgRNAifitm1-2;7-8:pHMG-sgRNA-ssgRNAifitm3-13.2.3sIFITMs过表达细胞系的构建与筛选通过筛选，分别获得可同时表达绿色荧光蛋白和2个猪IFITM蛋白的细胞系：PK15-GFP-sIFITM2和PK15-pEGFP-N1-sIFITM1及只表达绿色荧光蛋白的对照细胞系PK15-GFP。结果如图3-4。图3-4：PK15稳定表达IFITM细胞系的构建A和D：PK15-GFP-sIFITM2细胞系；B和E：PK15-pEGFP-N1-sIFITM1细胞系；C和F：PK15-GFP细胞系Figure3-4:ConstructionofstableIFITM-expressionPK15celllinesAandD:PK15-GFP-IFITM2cellline;BandE:PK15-pEGFP-N1-IFITM1cellline;CandF:PK15-GFPcellline3.2.4过表达sIFITMs对JEV病毒复制的影响将IFITM真核表达载体分别转染PK15和HEK293细胞后，1MOI感染JEV(SA14-14-2)，取感染后不同时间后培养上清，进行荧光定量PCR检测病毒拷贝数。结果显示猪的三28 个IFITM都具有明显的抗JEV作用（图3-5和图3-6），且IFITM1的作用最强。JEVRNA(Copies/mL)hh4h82247图3-5：sIFITMs在PK15细胞中的抗JEV病毒试验（Ttest：*；P<0.05；**P<0.01；***：P<0.001）Figure3-5:Anti-JEVdetectionofsIFITMsinPK15cells（Ttest:*:P<0.05;**P<0.01;***:P<0.001）在PK15细胞中，与转染pEGFP-N1的对照组相比、转染pEGFP-N1-sifitm1、pEGFP-N1-sifitm2、pEGFP-N1-sifitm3的细胞，JEV的拷贝数明显降低（图3-5），且其中sIFITM1抑制JEV能力较sIFITM2、sIFITM3强（sIFITM1p=0.013557、sIFITM2p=0.018409、sIFITM3p=0.011566），感染后的48h，sIFITM1较对照组具有显著性差异抑制JEV复制（p=0.001231），sIFITM2（p=0.01344）、sIFITM3(p=0.013107)也显著抑制JEV复制。图3-6：HEK293过表达sIFITM1对JEV复制的影响A:RT-PCR结果；B：IFITM1和GAPDH的Westernblot（Ttest：*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001）Figure3-6:Anti-JEVdetectionofsIFITM1inHEK293cellsA:ResultsofRT-PCR;B:Over-expressedIFITM1andafter72hinfectioncellswereused;B:WesternblotofIFITM1和GAPDH(Ttest:*:P<0.05;**P<0.01;***P<0.001)（2）更换被试细胞为HEK293，对抗JEV作用较强的sIFITM1进一步验证，用pcDNA3.1-HA-sifitm1转染HEK293细胞24h后，感染JEV，对感染后不同时间的上清中的病毒进行荧光定量检测，结果显示在感染后的24h、48h都显示病毒扩增明显减少，与对照相比差异显著，在72h差异极显著。29 3.2.5敲除sIFITMs对JEV病毒复制的影响将构建的敲除质粒，分别转染PK15和ST细胞，并进行病毒感染实验，结果如下：在PK15细胞中，转染pHMG-sgRNA-ssgRNAifitm1-1敲除质粒，JEV(SA14-14-2)感染敲除sIFITM1的细胞，24h后，与对照组相比，病毒拷贝数显著性升高（p=0.006337）（图3-7A）。ST细胞转染pHMG-sgRNA-ssgRNAifitm1-1敲除质粒后，在敲除sIFITM1的ST细胞中，感染JEV(SA14-14-2)，荧光定量测定结果显示，sIFITM1的缺失对病毒的复制具有极其显著提高（p=0.000053）（图3-7B）。图3-7：在PK15、ST细胞中，敲除sIFITM1对JEV的影响Figure3-7:TheeffectsonJEVreplicationofsIFITM1knockoutinPK15andSTcells30 第四章sIFITM1与sABHD16A相互作用的研究4.1材料与方法4.1.1材料4.1.1.1实验材料AH109酵母菌株、pEGFP-N1-sifitm1、pEGFP-N1-sifitm2、pEGFP-N1-sifitm3、酵母双杂交载体：pGBKT7、pGBKT7-53、pGBKT7-lam、pGADT7、pGADT7-T、SD-Ade/-His/-Leu/-TrpDOSupplement，SD-Leu/-TrpDOSupplement，SD-Ade/-Leu/-TrpDOSupplement、购自Clontech公司，YNB购自于Sigma公司，X-α-GAL、X-GAL均购自索莱宝。猪肾上皮细胞PK15由实验室保存。4.1.1.2实验仪器见3.1.1.24.1.1.3实验试剂与耗材1、实验试剂及配制：50%PEG4000：PEG400025g，在恒温水浴锅水浴中溶解，至终体积500mL，0.22μm过滤灭菌，4℃保存。10×TEbuffer：0.1MTris-HCl，10mMEDTA，pH7.5，121℃，30min，4℃保存。10×LiAc溶液：1MLiAc，醋酸调节pH至7.5，121℃高压灭菌，室温保存。X-Gal、X-α-GAL溶液(1%，m/V)：加入二甲基甲酰胺(DMF)溶解X-Gal、X-α-GAL，终浓度20mg/mL的贮存液，-20℃避光保存。鲑鱼精载体的制备：将20mg蛙鱼精DNA溶于1mLTE(PH7.5)中，冰上融化，至完全溶解。加入1mL75%乙醇，20μLLiAc，沉淀DNA，再用70%乙醇洗两次。1mLTE(PH7.5)溶解，将纯化后的载体鲑鱼精DNA置于-20℃保存。油红O染色液：0.1g油红O加入10mL异丙醇溶解后配成过饱和溶液储备液，4℃棕色瓶密封保存。工作液的配置︰取储备液：三蒸水=3︰2，混匀后定性滤纸过滤，现配现用。Zbuffer溶液(1L配置量)：Na2HPO4•7H2O16.1g；NaH2PO4•H2O5.50g；KCl0.75g；MgSO4•7H2O0.246g，调节PH至7.0，121℃高压灭菌，室温下保存。Zbuffer/X-GAL溶液：Zbuffer100mL；β-mercaptoethanol(β-巯基乙醇)0.27mL；X-α-GAL贮存液(20mg/mL)1.67mL，混匀后，避光保存，现配现用。1×TE/LiAc溶液(100mL)：10×TEbuffer10mL；10×LiAc10mL；ddH2O80mL。2、酵母双杂交选择性培养基31 （1)YPD液体培养基(YPD)(1L配置量)：Poplypeptone（胰蛋白胨）20g；Yeastextract（酵母提取物）10g；Glucoses(葡萄糖)20g。（2)YPD固体培养基(YPDAgar)(1L配置量)：Poplypeptone（胰蛋白胨）20g；Yeastextract（酵母提取物）10g；Glucoses(葡萄糖)20g；Agar(琼脂)20g。（3)YPDA液体培养基(1L)(pH6.5)：Poplypeptone（胰蛋白胨）20g；Yeastextract（酵母提取物）10g；Glucoses(葡萄糖)20g；15mL0.2%L-AdenineHemisulphate(L-硫酸腺嘌呤)。（4)YPDA固体培养基(1L)(pH6.5)：Poplypeptone（胰蛋白胨）20g；Yeastextract（酵母提取物）10g；Glucoses(葡萄糖)20g；Agar(琼脂)20g，15mL0.2%L-AdenineHemisulphate(L-硫酸腺嘌呤)。（5）SD-Ade/-His/-Leu/-Trp：酵母氮源（YNB）6.7g；SD-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.60g；调节PH至5.8，ddH2O加至950mL，121℃，15min高压灭菌后，冷却至50℃左右，加入50mL40%Glucoses，混匀后备用。（6）SD/-leu/-trp：酵母氮源（YNB）6.7g；SD-ade/-leu/-trpDOsupplement0.64g；调节PH至5.8，ddH2O加至950mL，121℃，15min高压灭菌后，冷却至50℃左右，加入50mL40%Glucoses，混匀后备用。（7）SD/-trp：酵母氮源（YNB）6.7g；SD/-trp0.74g；调节PH至5.8，ddH2O加至950mL，121℃，15min高压灭菌后，冷却至50℃左右，加入50mL40%Glucoses，混匀后备用。4.1.2方法4.1.2.1sABHD16A生物信息学分析1、多序列比对通过NCBIBLASTABHD16氨基酸序列：野猪(Susscrofa)NP_001182255.1、智人（Homosapiens）AQY76647.1、小鼠(Musmusculus)NP_848707.1、牛(Bostaurus)NP_001069073.1、褐鼠(Rattusnorvegicus)NP_997696.1，运用DANMAN多序列比对。2、系统进化树构建通过NCBIBLAST搜索并下载以下ABHD16氨基酸序列：东欧马鹿(Cervuselaphushippelaphus)OWK13288.1、智人（Homosapiens）AQY76647.1、小鼠(Musmusculus)NP_848707.1、褐鼠(Rattusnorvegicus)NP_997696.1、食蟹猴(Macacafascicularis)NP_001271025.1、苏门答腊猩猩(Pongoabelii)NP_001126487.1、牛(Bostaurus)NP_001069073.1、家猫(Ictidomystridecemlineatus)XP_005339052.1、夏威夷僧海豹(Neomonachusschauinslandi)XP_021552832.1、长爪沙鼠(Merionesunguiculatus)XP_021511549.1、叙利亚地鼠(Mesocricetusauratus)XP_005086874.1、卡氏小鼠(Muscaroli)32 XP_021041675.1、野猪(Susscrofa)NP_001182255.1、白尾鹿德克萨斯亚种(Odocoileusvirginianustexanus)XP_020752876.1、大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)XP_002930068.1、中华菊头蝠(Rhinolophussinicus)XP_019571172.1、黑猩猩(Pantroglodytes)NP_001267411.1、上加利利山瞎鼹鼠(Nannospalaxgalili)XP_008819747.1穴兔(Oryctolaguscuniculus)XP_008260804.1、纳塔尔长翼蝠(Miniopterusnatalensis)XP_016070849.1、刺猬(Erinaceuseuropaeus)XP_007537218.1、草原鹿鼠(Peromyscusmaniculatusbairdii)XP_006995325.1、美洲河狸(CastorCanadensis)XP_020032186.1、鼠耳蝠(Myotisdavidii)XP_015425368.1、东北虎(Pantheratigrisaltaica)XP_007098882.1、旱獭(Marmotamarmotamarmota)XP_015342931.1、羊驼(Vicugnapacos)XP_006215394.1、绵阳(Ovisaries)XP_004018993.1、欧洲盘羊(Ovisariesmusimon)XP_012018788.1、家马(Equuscaballus)XP_001490984.1、树鼩(Tupaiachinensis)XP_014445559.1、野骆驼(Camelusferus)XP_006178831.1、野牦牛(Bosmutus)XP_005904257.1、橙腹草原田鼠(Microtusochrogaster)XP_005370882.1、地中海雪貂(Mustelaputoriusfuro)XP_004781027.1、奥氏更格卢鼠(Dipodomysordii)XP_012886832.1、非洲跳鼠(Jaculusjaculus)XP_004671926.1、鼩鼱(Sorexaraneus)XP_004621337.1、北美鼠兔(Ochotonaprinceps)XP_004598762.1、小耳大婴猴(Otolemurgarnettii)XP_023368673.1、星鼻鼹(Condyluracristata)XP_004695190.1、虎鲸(Orcinusorca)XP_004286641.1、白颊长臂猿(Nomascusleucogenys)XP_012358471.1、智力八齿鼠(baOctodondegus)XP_023577430.1、豚尾猴(Macacanemestrina)XP_011767154.1、鬼狒(Mandrillusleucophaeus)XP_011855895.1、疣猴(Colobusangolensispalliates)XP_011800090.1、单峰骆驼(Camelusdromedari)XP_010976507.1es、双峰驼(Camelusbactrianus)XP_010959808.1、非洲草原象(LoxodontaAfricana)XP_010599841.1、秦岭川金丝猴(Rhinopithecusroxellana)XP_010361089.1、普通猕猴(Macacamulatta)AFH33993.1、普氏野马(Equusprzewalskii)XP_008535763.1、土豚(Orycteropusaferafer)XP_007949546.1、白鳍豚(Lipotesvexillifer)XP_007459621.1、北大西洋小须鲸(Balaenopteraacutorostratascammoni)XP_007194012.1、亚洲水牛(Bubalusbubalis)XP_006041981.1、抹香鲸(Physetercatodon)XP_007110188.1、金毛鼹(Chrysochlorisasiatica)XP_006875656.1、(Elephantulusedwardii)XP_006896244.1、威德尔海豹(Leptonychotesweddellii)XP_006738555.1、藏羚羊(Pantholopshodgsonii)XP_005965436.1、普通狨(Callithrixjacchus)JAB36799.1在MEGA5软件中进行系统进化树的构建，分类群的进化关系使用UPGMA方法。用1000次重复推断出Bootstrap共有相似序列分析的分类群方法表示进化关系。忽略小于50%的程序性比对中再现的分区对应的分支。系统进化树按比例绘制，分支长度与用于推断系统发育树的进化距离远近。进化距离使用泊松校正法计算，并以每个位点的氨基酸取代数为单位。分析涉及64个氨基酸序列。忽略所有包含缺口和缺失的氨基酸序列位置。33 3、sABHD16理化性质预测（1）根据NCBI预测的猪ABHD16A氨基酸序列进行预测，TMHMM法分析蛋白质的跨膜区。（2）利用在线工具Protparam，对sABHD16A理化性质进行预测。4.1.2.2sABHD16A基因克隆与表达载体构建1、根据细胞培养方法，培养PK15细胞，按照总RNA提取方法提取RNA用于cDNA第一条链的合成，然后用于扩增sabhd16a基因。2、sabhd16a的扩增与回收。根据NCBI已经提交预测的数据库，通过与其他物种氨基酸序列比对，根据已经预测的野猪(susscrofa)NP_001182255.1氨基酸序列，Oligos设计特异性引物扩增，设计引物附表。提取PK15细胞的RNA，反转录合成第一条链cDNA为模板，用以上设计引物进行特异性扩增目的片段。PCR反应体系如表3-3所示，PCR反应程序如表3-4。sabhd16a基因扩增Tm值为57℃。反应完成后，产物中加入10μL6×DNALoadingBuffer，轻轻混匀后，2%琼脂糖凝胶电泳(120V，25min)检测，根据GeneMark公司PlusDNAClean/ExtractionKit试剂盒说明书对扩增目的条带进行回收目的DNA片段。将回收后的DNA片段进行加polyA，在PCR管中，加入已经回收后的DNA片段5μL、2×Taqpolymerasemix5μL，混合后，在PCR仪中72℃，30min。将反应结束后的产物直接用于下游T载体的连接。3、T-sabhd16a连接，连接反应见表4-1。通过测定DNA片段的浓度，根据载体：目的片段摩尔比为1：3比例加入以下反应体系。表4-1T载体连接反应体系Tabe4-1T-Vectorcouplingreactionsystem组分（Components）Volume回收纯化后DNA片段4μLpMD-19TVector1μLSolutionⅠ5μL将上述反应体系加入离心管中，于4℃过夜连接反应。将上述酶连产物，转化大肠杆菌DH5α，涂布含有8μLIPTG(1mM)、40μLX-gal(20mg/mL)50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基正置于37℃，30min后，倒置培养过夜。在上述培养的平板上，挑选白色菌落，进行单菌落扩摇培养，使用小量提取DNA方法（GeneralPlasmidMiniKit）提取质粒，PCR检测阳性克隆子。将提取的阳性重组质粒进行双酶切验证，双酶切体系见表3-5。34 表4-2质粒双酶切反应体系Table4-2TherecationsystemofrestrictionenzymedigestionComponentsVolume10×NEBCutSmartBuffer5μLEcoRⅠ1μLBamHⅠ1μLpMD19-T-sabhd16a2μL（1μg）ddH2O41μL将上述反应液于离心管中混匀，置于37℃水浴锅中6h，将酶切产物通过2%琼脂糖凝胶电泳验证重组质粒。验证正确的重组质粒送北京华大基因有限公司测序。将测序正确的阳性重组质粒进行下游实验。4、sabhd16a真核表达载体的构建（1）目的片段的回收和载体的双酶切将已经验证正确的阳性重组质粒pMD19-T-sabhd16a、pEGFP-N1、pdsRed-monomer-N1、pcDNA3.1(+)-HA进行双酶切反应，反应体系见表3-5。双酶切后，用于1%琼脂糖凝胶电泳检测。（2）根据表3-6反应体系进行连接反应，构建重组质粒pEGFP-N1-sabhd16a、pcDNA3.1(+)-HA-sabhd16a，pdsRed-monomer-N1-sabhd16a。（3）转化连接反应结束后，将重组质粒大肠杆菌DH5α感受态细胞进行转化，将含有重组质粒pcDNA3.1(+)-HA-sabhd16a涂布含有氨苄青霉素（Amp）平板，将含有重组质粒pEGFP-N1-sabhd16a、pdsRed-monomer-N1-sabhd16a涂布含有卡那霉素（Kana）平板37℃培养12-16h。挑取单克隆，置于5mL试管中，37℃，220r/min，15h。（4）重组质粒验证采用克隆该基因的引物，对挑取的单菌落进行PCR反应，反应体系见表3-7。重组质粒菌液PCR验证程序见表3-8。将验证正确的重组质粒送于北京华大基因有限公司北京测序部测序。4.1.2.3sABHD16A功能初探1、sABHD16A脂肪酶功能探究：（1）传代培养HEK293T细胞，对生长对数期的细胞进行传代至24孔板中，用于转染。（2）通过瞬时转染过表达sABHD16A。（3）转染12h后，移去含有10%FCS的DMEM完全培养基，1×PBS清洗2遍，更换新鲜的完全培养基。（4）在细胞培养板中加入4%多聚甲醛0.5mL，室温固定30min，吸去固定液，加入1×PBS清洗2遍。（5）加入新配置的油红O工作液0.5mL，室温避光孵育30min。（6）移去染色液，加入60%异丙醇漂洗两次，除去多余的染色液。（7）加入1×PBS清洗，倒置显微镜下观察染色结果。35 4.1.2.4酵母双杂交载体构建1、引物设计。根据NCBI已有的基因组数据库中，结合连接目的载体pGBKT7、pGADT7酶切位点，设计引物酶切位点同构建pEGFP-N1-sabhd16a、pEGFP-N1-sifitm1、pEGFP-N1-sifitm2、pEGFP-N1-sifitm3引物相同。2、目的片段扩增与回收。根据以上引物，根据表3-3，在PCR管中加入反应体系，分别以pEGFP-N1-sifitm1、pEGFP-N1-sifitm2、pEGFP-N1-sifitm3、pEGFP-N1-sabhd16a为模板，进行扩增，扩增体系见表3-4，反应Tm：sifitm1、sifitm2、sifitm3、sabhd16a退火温度分别为：57℃、50℃、56℃、57℃。反应结束后，取PCR产物通过GeneralPlasmidMiniKit纯化回收DNA片段。3、酶切与酶连。通过纯化回收后的DNA片段用于双酶切反应，sifitm1、sifitm2、sifitm3、pGBKT7、sabhd16a、pGADT7通过限制性内切酶（EcoRⅠ和BamHⅠ）进行双酶切，双酶切体系见表3-5。双酶切完成后，将双酶切产物进行PCR产物回收目的片段与载体。将回收后的载体与目的片段用于目的片段与载体的连接反应链接反应见表3-6。4、转化。将酶连反应后的产物分别转化大肠杆菌DH5α，涂布含有卡那霉素（Kana）平板37℃培养12-16h。挑取单克隆，置于5mL试管中，37℃，220r/min，培养15h。5、重组阳性克隆的验证。将扩增后的单菌落用于菌液PCR反应，扩增所用引物为克隆所用引物，退火温度为扩增时退火温度。反应体系见表3-7。重组质粒菌液PCR验证程序见表3-8。将验证正确的重组质粒送于北京华大基因有限公司北京测序部测序。4.1.2.5sIFITMs与sABHD16A的酵母双杂交系统分析1、菌种的活化和保存（1）从-80℃冰箱中取甘油保存的酵母AH109，YPDA平板上划线，30℃培养3周左右，使得酵母单菌落生长状态较好。（2）取划线后的酵母单菌落，继续YPDA平板上划线，30℃培养3-5天。（3)取直径2～3mm菌落接种10mLYPDA液体培养基，培养至对数期OD600=1.0左右。（4）加入等体积50%甘油，混匀后分装1mL每管，冻存于-80℃。2、AH109酵母感受态细胞的制备（1）在YPDA固体培养基平板上取直径2～3mm的克隆接种到1mLSD培养基中。（2）剧烈振荡或涡旋5min，重悬酵母菌液，使所有团块分散开。（3）转移酵母菌液至5mLSD培养基中。（4）置于30℃摇床中，250r/min震荡培养基16～18h，直到OD600>1.5。（5）转移酵母过夜培养菌液5mL到200mLYPD培养基中，使酵母菌液OD600在0.2～0.3之间。（6）30℃，230r/min，培养条件下3～4h，检测酵母菌液OD600≈0.4～0.6。36 （7）转移酵母培养液至无菌的50mL离心管中，1000r/min，室温，离心5min。（8）弃去培养上清，加入50mL无菌的1×TE重悬酵母，充分悬浮酵母。（9）1000r/min，室温，离心5min，重新收集酵母菌。（10）弃上清，将酵母细胞重悬于1.5mL新配制无菌的1×TE/1×LiAc。（11）转移至1.5mL管中12000r/min离心20s，弃上清，500μL1×TE/1×LiA重悬。3、酵母转化：以sIFITM1与sABHD16A为例说明试验：（1）向无菌的1.5mL微量离心管中加入质粒DNA0.1μg和0.1mg鲑鱼精载体DNA。表4-3酵母转化实验分组Table4-3YeastTransformationExperimentGroup实验组阳性对照阴性对照ss载体鲑鱼精用量pGBKT7-sifitm1pGBKT7-53pGBKT7-lam0.1μgpGADT7-sabhd16apGADT7-TpGADT7-T0.1μgpGBKT7-sifitm1/0.1μgpGADT7-sabhd16a（2）将上步每管混合物混匀后，向每管中加入0.1mL酵母感受态细胞，并且震荡混匀。（3）向每一管加入600μL无菌PEG/LiAc溶液，高速振荡混匀。（4）30℃摇床以200r/min的转速振荡培养30min。（5）向每一管加入70μLDMSO轻轻颠倒轻轻混匀。（6）42℃水浴热激15min。（7）取出后在冰上冷却1-2min。（8）1000r/min，室温，离心5min，弃去上清，收集菌体。（9）用0.5mL无菌的1×TE重悬酵母。（10）分别取100μL体积的菌液涂在选择性的SD/–Leu/–Trp、SD/–His/–Leu/–Trp培养基的平板上，在30℃培养箱中培养3-5天。4、检验自激活：以sIFITM1与sABHD16A为例的自激活验证试验方法：（1）在SD固体平板复苏活化AH109菌株，在30℃培养箱中培养3-5天。（2）挑取酵母单菌落接种到YPDA液体培养基，在30℃，16h，220r/min。（3）在每个1.5mLEp管中加入诱饵质粒DNA和猎物空载质粒，同时设不加质粒的阴性对照。表4-4酵母双杂交自激活验证分组Table4-4YeastTwo-HybridSelf-ActivationValidationGroup实验组阳性对照ss鲑鱼精用量pGBKT7-sIFITM1pGADT70.1μgpGADT7-sABHD16ApGBKT70.1μg（4）将以上每管混匀，加入100μL酵母感受态，后放入42℃水浴锅热激30min。37 （5）离心12000r/min，1min，弃上清，用500μL1×TE重悬。（6）重悬后取100μLSD/-Trp和SD/-Trp/-Leu固体平板上，放置30℃培养箱中培养3天，观察平板中菌落生长情况。5、滤膜试验：（1）挑取四缺培养平板上生长较旺盛的菌株（直径约1-3mm）转接到新的选择性SD-ade/-leu/-trp/-his固体培养平板中，30℃培养3-5天。（2）制备新鲜Zbuffer/X-gal溶液。（3）每个缺素培养平板准备一张无菌的Whatman滤纸，置于无菌平板中用5mLZbuffer/X-gal溶液浸泡5min。（4）用无菌的镊子将无菌Whatman滤纸覆盖到需要测试的平板表面，使所有的待测菌株都有部分沾到滤纸上。（5）在Whatman滤纸上做出相应的标记，用以识别不同的方向。（6）将上步骤中滤纸放入液氮中1min，后再置于室温1min至融化，反复冻融5次。（7）将带有酵母菌株的Whatman滤纸放到预浸泡的滤纸上，有酵母菌株一面向上，两层滤纸中间用无菌镊子赶尽气泡。（8）平板放到30℃培养箱中，0.5～8h内观察其是否变蓝。如果变蓝，则说明阳性，反之，结果不明确。4.1.2.6sIFITMs与sABHD16A的亚细胞定位（1）通过复苏、培养细胞HEK293、PK15、Huh7细胞，传代至3-5代。（2）将涨势较好、生长旺盛的细胞2×105个/孔传代至激光共聚焦小皿（35mm）。（3）按照每孔总共4μg质粒DNA和8μLPOLOdeliverer3000分别稀释。到500μL基本DMEM培养基中，混匀后室温放置5min。（4）将上述POLOdeliverer3000溶液滴加到质粒DNA溶液中，轻轻混匀后室温下孵育15min。（5）将上述混合物均匀滴加到35mm小皿，轻轻摇匀。（6）将转染的细胞在37℃，5%CO2条件下培养24h，在转染24h后进行病毒感染。（7）实验分为未感染病毒组和感染病毒组，感染组是在转染后1MOI感染JEV(SA14-14-2株)，感染后再培养36h。（8）转染组细胞培养48h后，感染病毒组感染病毒后36h，对细胞进行固定和染色。（9）配置好的Hoechest33342染色母液，用1×PBS稀释1000倍至终浓度为5ng/mL，避光保存，配置后，4℃保存，一周内使用完毕。（10）将转染后的细胞，吸去原有的培养基，加入1×PBS清洗细胞两次，加入4%的多聚甲醛1mL，置于室温固定30min。（11）移去固定液，加入1×PBS清洗3次，清洗多余的固定液。38 （12）加入稀释后的1mLHoechest33342染色液，置于37℃，孵育30min。（13）加入1×PBS清洗3次，清洗多余的Hoechest33342染色液。（14）加入适量的1×PBS立即用于亚细胞结构观察。（15）在Huh7细胞中，设置共转染pEGFP-N1(2μg）/pdsRed-monomer-N1(2μg）、pEGFP-N1-sifitm1(2μg）/pdsRed-monomer-N1-sabhd16a(2μg）组，转染后48h，通过激光显微镜拍照，观察蛋白亚细胞共定位。4.2结果与分析4.2.1ABHD16A的多序列比对结果使用DNAMAN软件进行氨基酸多序列比对，结果显示不同物种间相似性高达96.99%。ABHD16A不仅具有典型的ABHD家族α/β-水解酶结构域（C281-C407），还具有保守的酰基转移酶基序HXXXXD（H：组氨酸，D：天冬氨酸，X：任何氨基酸残基）和脂肪酶相似基序GXSXXG（G：甘氨酸，S：丝氨酸，X：任何氨基酸残基）图4-1：5种哺乳动物ABHD16A氨基酸序列比对GXSXXG：脂肪酶样基序；HXXXXD：基转移酶基序；*活性亲核体区域Figure4-1:AminoacidsequencealignmentofaminoacidsequencesoffivemammalianABHD16AGXSXXG:lipase-likemotif;andHXXXXD:thetransferasemotif;(*):theactivenucleophileregion4.2.2系统进化树构建结果经MEGA软件分析发现，该蛋白保守位点462个，变异位点95个，简约性信息位点33个，自裔位点62个。通过蛋白系统发育树分析发现，人类的ABHD16A与普通狨（Callithrixjacchus，JAB36799.1）、白颊长臂猿（Nomascusleucogenys，XP_012358471.1）、苏门答腊猩猩（Pongoabelii，NP_001126487.1）、家猫(Ictidomystridecemlineatus，XP_005339052.1)、39 黑猩猩(Pantroglodytes，NP_001267411.1)、旱獭(Marmotamarmotamarmota，XP_015342931.1)遗传关系较近，猪ABHD16A与藏羚羊(Pantholopshodgsonii，XP_005965436.1)、白尾鹿德克萨斯亚种(Odocoileusvirginianustexanus，XP_020752876.1)、绵阳(Ovisaries，XP_004018993.1)、亚洲水牛(Bubalusbubalis，XP_006041981.1)、欧洲盘羊(Ovisariesmusimon，XP_012018788.1)、东欧马鹿(Cervuselaphushippelaphus，OWK13288.1)、野牦牛(Bosmutus，XP_005904257.1)、牛(Bostaurus，NP_001069073.1)遗传距离较近，小鼠与橙腹草原田鼠(Microtusochrogaster，XP_005370882.1)草原鹿鼠(Peromyscusmaniculatusbairdii，XP_006995325.1)卡氏小鼠(Muscaroli，XP_021041675.1)褐鼠(Rattusnorvegicus,NP_997696.1)褐鼠(Rattusnorvegicus，NP_997696.1)叙利亚地鼠(Mesocricetusauratus，XP_005086874.1)遗传距离较近。图4-2：ABHD16A进化树（红色、绿色、蓝色分别标注Susscrofa、Musmusculus、Homosapiens，不同颜色的灰色区域表示同一个群）Figure4-2:ThesystemevolutionarytreeofABHD16Aphylogenetictree（(red,green,andbluearelabeledsusscrofa,Musmusculus,andHomosapiens,andgrayareasofdifferentcolorsindicatethesamegroup)4.2.3sABHD16A理化性质的预测（1）根据TMHMM法分析蛋白质的跨膜区，预测了sABHD16A两个跨膜区，其中跨膜区C60-C82、C95-C117，两个胞外区C1-59、C118-C558，一个区胞内C83-C94(见图4-3)。40 图4-3：TMHMM法分析蛋白质的跨膜区Figure4-3:TMHMMmethodforanalysisoftransmembraneregionsofproteins（2）根据预测sABHD16A理论等电点为8.53，分子量：62891.92，总原子数：8808，带负电的残基总数（Asp+Glu）：53，带正电的残基总数（Arg+Lys）：58，在水中测量280nm消光系数（以M-1cm-1为单位）为111895。考虑序列的N-末端是M（Met），估计的半衰期：30小时（哺乳动物网状细胞，体外）；>20小时（酵母，体内）；>10小时（体内大肠杆菌）；不稳定指数指数（II）计算为51.63，将蛋白质分类为不稳定的，脂肪族指数：86.88，亲水性平均值（GRAVY）：-0.210（总亲水性）。4.2.4sabhd16a基因克隆和表达载体构建结果（1）测序结果显示，成功克隆出sabhd16a基因，序列如下：atggcgaagctgctgagctgcgtcctaggaccccggctctacaaaatctaccgggaaagggactcagaaagggccgcgtctggtgtccctgggactccaacttcagtcactaccgcctcttccagctcctgggatacatattatcagccccgtgccctcgagaaacatgctgacagcatcctcgcgctggcttcagtcttctggtccatctcttattactcctctcccttcgccttcttctacttgtacaggaaaggttacttgagtttgtccaaagtggtgccgttttctcactatgccgggacattgcttctactgctggcgggagtggcctgcctccgaggcattggccgctggaccaacccccagtaccggcagttcatcaccatcttggaggcagcacataggaaccagtccgcagagaacaagaggcagctcgccaactacaactttgacttcaggagctggccagtcgacttccactgggaagaacccagcagccggaaggggtcccgggggggcccttcccgccggggcgtggccctgctccgcccagagtccctgcaccgggggacggcagacaccctcctcaaccgggtcaagaagctgccttgtcagatcaccagctacctggtggcacacaccctgggccgccggatgctgtatccgggctccgtgtacctgctccagaaggccctcatgcctgtgctgctgcagggccaggcccggctggtggaagagtgtaatggacgccgggcaaagctgctggcctgtgacggcaacgaggttgacaccatgtttgtggaccggcgggggacagccgagccccagggacagaagctggtgatctgctgtgaggggaacgcaggcttctatgaggtgggctgcgtctccacccccctggaagctggatattcagtcctgggctggaaccatcccggctttgctggaagcacgggggtgccgttcccacagaacgaggccaatgccatggatgtggtggtccagtttgccatccaccgcctgggcttccagccccaggacatcatcatctatgcctggtccatcggcggcttcactgctacatgggcagccatgtcctacccagacattagcgccgtgatcctggatgcctccttcgatgacctggtgcccttggccttgaaggttatgccagacagctggaggggcctggtgaccaggactgtgaggcagcatctcaatctaaacaacgcggaacagctgtgcaggtaccagggccctgtgctgctgatccgaagaaccaaggatg41 agatcatcaccaccacggttcctgaggatgtcatgtcgaatcgaggcaatgacctcctgctgaagctgctgcagcatcggtatccccgtgtgatggcagaggaggggcttcgagtggtgaggcagtggctggaggcctcctcacagctggaggaagcctcaatttacagccgatgggaagtggaggaggactggtgcctgtcggtcctccgctcctaccaggccgagcacgggcccgagttcccctggagcgtgggggaggacatgagtgcagatggcagacggcagctggccttgtttctggctcagaagcatctgcacaactttgaggccacacactgcaccccgctcccggcccccaacttccagatgccctggcacctctag将序列提交至NCBI数据库，获得序列编号：KX068708.1。（2）成功构建了用于酵母双杂交实验的载体和用于激光共聚焦亚细胞定位的载体：pGBKT7-sifitm1、pGBKT7-sifitm2、pGBKT7-sifitm3、pGADT7-sabhd16a、pEGFP-N1-sabhd16a、pcDNA3.1(+)-HA-sabhd16a，pdsRed-monomer-N1-sabhd16a，这些载体经PCR验证和测序公司测序显示序列正确，结果分别如图4-4、图4-5、图4-6、图4-7、图4-8。图4-4：PMD19T-sabhd16a重组质粒的构建图A：sabhd16a目的片段的PCR扩增(M：DM2000DNAMarker；1：sabhd16a)：图B：PMD19T-sabhd16a重组质粒菌液PCR(M：DM2000DNAMarker；1-3：sabhd16a)；Figure4-4:ConstructionofPMD19T-sabhd16arecombinantplasmidA:PCRamplificationofsabhd16afragment(M:DM2000DNAMarker;1:sabhd16a);B:PMD19T-sabhd16arecombinantplasmidbacterialPCR(M:DM2000DNAMarker;1-3:sabhd16a)图4-5：sabhd16a、pEGFP-N1、pcDNA3.1(+)-HA、T-sabhd16a载体及重组质粒双酶切M：DM2000DNAMarker；1：pEGFP-N1；2：pcDNA3.1(+)-HA；3：PGEMTeasy-sabhd16a；4:PMD19T-sabhd16a；M2:λDNAHindⅢFigure4-5:Doubledigestionofsabhd16a,pEGFP-N1andpcDNA3.1(+)-HAT-sabhd16aM:DM2000DNAMarker;1:pEGFP-N1;2:pcDNA3.1(+)-HA;3:PGEMTeasy-sabhd16；4:PMD19T-sabhd16aM2:λDNAHindIII42 图4-6：sabhd16a重组质粒菌液PCR验证1-9：pEGFP-N1-sabhd16a重组质粒菌液PCR；10：CK；11-14：pcDNA3.1(+)-HA-sabhd16aFigure4-6:PCRvalidationofsabhd16arecombinantplasmidsolution1-9:sabhd16a-pEGFP-N1recombinantplasmidliquidPCR;10:CK;11-14:-pcDNA3.1(+)-HA-sabhd16a图4-7：pdsRed-monomer-N1-sabhd16a重组质粒的构建A:sabhd16a、pdsRed-monomer-N1双酶切（M1：DM2000DNAMarker；1：sabhd16a目的片段；2：pdsRed-monomer-N1载体；M2：λ-HindⅢDNAMarker)；B：pdsRed-monomer-N1-sabhd16aPCR(M：DM2000DNAMarker；1：CK；2-5：pdsRed-monomer-N1-sabhd16aPCR)Figure4-7:ConstructionofpdsRed-monomer-N1-sabhd16arecombinantplasmidA:sabhd16at5,pdsRed-monomer-N1doubledigestion(M1:M:DM2000DNAMarker;1:sabhd16atargetfragment;2:pdsRed-monomer-N1vector;M2:λ-HindIIIDNAMarker);B:pdsRed-monomer-N1-sabhd16arecombinantplasmidPCR(M:DM2000DNAMarker;1:CK;2-5:pdsRed-monomer-N1-sabhd16a)图4-8：pGBKT7-sifitms、pGADT7D-sabhd16a重组质粒菌液PCR验证A：pGBKT7-sifitm1(M：DM2000DNAMarker；1：CK；2-3：pGBKT7-sifitm1)；B：pGBKT7-sifitm2(M：DM2000DNAMarker；1：CK；2-4：pGBKT7-sifitm2)；C：pGBKT7-sifitm3(M：DM2000DNAMarker；1：CK；2-3：pGBKT7-sifitm3)；D：pGADT7-sabhd16a(M：DM2000DNAMarker；1：CK；2-4：pGADT7D-sabhd16a）Figure4-8:PCRvalidationofpGBKT7-sifitmsandpGADT7D-sabhd16arecombinantplasmids43 A:pGBKT7-sifitm1(M:DM2000DNAMarker;1:CK;2-3:pGBKT7-sifitm1);B:pGBKT7-sifitm2(M:DM2000DNAMarker;1:CK;2-4:pGBKT7-sifitm2);C:pGBKT7-sifitm3(M:DM2000DNAMarker;1:CK;2-3:pGBKT7-sifitm3);D:pGADT7-sabhd16aPCR(M:DM2000DNAMarker;1:CK;2-4:GADT7D-sabhd16a)4.2.5探究sABHD16A功能的结果在HEK293T中转染sabhd16a真核表达质粒，过表达sABHD16A后，采用油红O染色检测脂肪合成，结果如图4-9(A)，与对照相比，细胞内有红色脂滴的聚集，说明sABHD16A和脂肪代谢有关。图4-9：油红O染色检测sABHD16A酶活性A：油红O染色过表达ABHD16A的HEK293T细胞（40×10倒置显微镜观察）；B：WesternBlot检测sABHD16A表达。Figure4-9:TheresultsofoilRedOstainingofHEK293TcellstransfectedwithsABHD16ApalsmidA:RedOstaining(40×10invertedmicroscopeobservation);B:WesternblotofABHD16AandGAPDH.4.2.6sIFITMs与sABHD16A酵母双杂交结果1、自激活验证结果如图4-10，pGBKT7-sifitm1、pGBKT7-sifitm2、pGBKT7-sifitm3分别与pGADT7共转后，在YPDA培养基上生长正常，说明pGBKT7-sifitm1、pGBKT7-sifitm2、pGBKT7-sifitm3转染AH109酵母菌株后，对酵母无毒性，不影响酵母的生长。在SD/-leu/-trp培养基中，无酵母菌落的生长，进一步说明无自激活现象，可用于进一步的酵母双杂交的验证。pGADT7-sabhd16a/pGBKT7共转染AH109酵母菌，于YPDA培养基上酵母生长正常，SD/-leu/-trp缺素培养基中无酵母生长，证明无自激活。以上结果说明，酵母双杂交载体均无自激活现象，均可进行下一步的酵母双杂交的验证。图4-10：AH109酵母菌的培养和自激活验证A：酵母AH109在YPDA培养基培养；B：pGADT7与pGBKT7-sifitm1共转酵母后在SD/trp-/leu-缺素培养基培养；C：pGADT7与pGBKT7-sifitm2共转酵母后在SD/trp-/leu-缺素培养基培养；D：pGADT744 与pGBKT7-sifitm3共转酵母后在SD/trp-/leu-缺素培养基培养；E：pGBKT7与pGADT7-sabhd16a共转酵母后在SD/trp-/leu-缺素培养基培养Figure4-10:Cultureandself-activationverificationofAH109yeastA:YeastAH109wasculturedinYPDAmedium;B:pGADT7andpGBKT7-sifitm1werecotransformedwithyeastinSD/trp-/leu-medium;C:pGADT7andpGBKT7-sifitm2werecotransformedwithyeastinSD/trp-/leu-mediumculture;D:cotransformationofPgadt7andpGBKT7-sifitm3inSD/trp-/leu-medium;E:cotransformationofpGBKT7andpGADT7-sabhd16ainSD/trp-/Leu-mediumculture2、在AH109酵母中分别共转染以下质粒：pGBKT7-sifitm1/pGADT7-sabhd16a、pGBKT7-sifitm2/pGADT7-sabhd16a、pGBKT7-sifitm3/pGADT7-sabhd16a，在SD/-trp、SD/-leu/-trp、SD-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基培养并对生长状态进行观察，结果显示（图4-11），在SD/-trp培养平板上，生长状态良好，说明共转对AH109酵母无毒性，在SD/-leu/-trp选择缺陷型培养基上有酵母菌落的形成，相对于SD/-trp培养平板菌落较少，在相同时间、相同培养条件下，酵母单菌落相对较小，有酵母菌落在SD-Ade/-His/-Leu/-Trp缺素培养基中生长，以上结果初步说明sIFITM1、sIFITM2、sIFITM3与sABHD16A具有相互作用关系。图4-11：AH109酵母双杂交筛选图A-C：pGBKT7-sifitm1/pGADT7-sabhd16a共转后分别涂板于SD-Trp、SD-Ade/-Leu/-Trp、SD-Ade/-His/-Leu/-Trp选择性培养基；D：从C平板中挑去单菌落克隆二次涂板划线于SD-Ade/-His/-Leu/-Trp选择性培养基；E-G：pGBKT7-sifitm2/pGADT7-sabhd16a共转后分别涂板于SD-Trp、SD-Ade/-Leu/-Trp、SD-Ade/-His/-Leu/-Trp选择性培养基；H：从G平板中挑去单菌落克隆二次涂板划线于SD-Ade/-His/-Leu/-Trp选择性培养基；I-L：pGBKT7-sifitm3/pGADT7-sabhd16a共转后分别涂板于SD-Trp、SD-Ade/-Leu/-Trp、SD-Ade/-His/-Leu/-Trp选择性培养基；L：从K平板中挑去单菌落克隆二次涂板划线于SD-Ade/-His/-Leu/-Trp选择性培养基45 Figure4-11:Co-transfectionofAH109YeastTwo-hybridScreeningPanelA-C:CotransfectionofpGBKT7-sifitm1/pGADT7-sabhd16aintoAH109andcultruedonSD-Trp,SD-Ade/-Leu/-Trp,andSD-Ade/-His/-Leu/-Trpselectivemedia,D:PicksinglecolonyfromtheCplateandclonethesecondaryplate.DrawontheSD-Ade/-His/-Leu/-Trpselectivemedium;E-G:pGBKT7-sifitm2/pGADT7-sabhd16aareco-transfectedandplatedonSD-Trp,SD-Ade/-Leu/-Trp,SD-Ade/-His/-Leu/-Trpselectivemedium;H:SinglecolonypickedfromtheGplateCloningSecondaryplateScribeonSD-Ade/-His/-Leu/-Trpselectivemediummedium;I-L:pGBKT7-sifitm3/pGADT7-sabhd16aareco-transfectedandplatedonSD-Trp,SD-Ade/-Leu/-Trp,SD-Ade/-His/-Leu/-Trpselectivemedium;L:SinglecolonypickedfromtheKplateCloningSecondaryplateScribeonSD-Ade/-His/-Leu/-Trpselectivemedium.4、将初步证明具有相互作用的酵母单菌落，在SD-Ade/-His/-Leu/-Trp缺陷型培养基二次划线（图4-12），生长状态较好时进行滤纸显色实验和x-α-gal显色试验，在约6h左右，在共转染的三组中，Whatman滤纸上出现蓝色，在含有x-α-gal缺陷型培养基SD-Ade/-His/-Leu/-Trp上均观察有蓝色菌落；在阴性对照组pGBKT7-lam与pGADT7-T共转后没有X-α-gal的显色反应，为白色酵母菌落；在阳性对照组pGBKT7-53与pGADT7-T共转后X-α-gal显色反应为蓝色菌落。证明在酵母双杂交体系中，sIFITM1、sIFITM2、sIFITM3与sABHD16A均具有相互作用。图4-12：酵母双杂交显色反应A：pGBKT7-sifitm1/pGADT7-sabhd16a；B：pGBKT7-sifitm2/pGADT7-sabhd16a；C：pGBKT7-sifitm3/pGADT7-sabhd16a；D：阳性对照：pGBKT7-53/pGADT7-T；E：阴性对照：pGBKT7-lam/pGADT7-T.Figure4-12:Yeastwo-hybridZBuffer/X-galcolorreactionA:pGBKT7-sifitm1/pGADT7-sabhd16a;B:GBKT7-sifitm2/pGADT7-sABHD16A;C:pGBKT7-sifitm3/pGADT7-sabhd16a;D:positivecontrol:pGBKT7-53/pGADT7-T;E:negativecontrol:pGBKT7-lam/pGADT7-T4.2.7sIFITM1与sABHD16A的亚细胞定位结果1、将构建成功的融合荧光表达载体转染HEK293细胞，转染pEGFP-N1/pdsRed-monomer-N1空载体为对照组，Hoechest33342细胞核染色，激光共聚焦显微镜观察。结果显示sIFITM1、sBAT5分别聚集并定位于细胞膜性结构，叠加后的图片显示，46 sIFITM1、sABHD16A具有共同定位于细胞膜性结构（图4-13）。质粒共转染24h后，1MOIJEV(SA14-14-2)感染转染质粒的细胞，继续培养至48h，经Hoechest33342染色，激光共聚焦显微镜观察，结果显示经过JEV感染后，sIFITM1、sABHD16A的定位与感染前相比有明显变化，共定位区域有朝向细胞近核区域移动的趋势。2、将构建成功的融合荧光表达载体转染PK15细胞，以转染pEGFP-N1/pdsRed-monomer-N1空载体为对照组，共转染pEGFP-N1-sifitm1、pdsRed-monomer-N1-sabhd16a，结果显示（图4-14），sIFITM1、sABHD16A均聚集定位于PK15细胞中的膜性结构中，叠加后的黄色显示sIFITM1、sABHD16A在相同的膜性结构中定位。图4-13：sIFITM1与sABHD16A在HEK293细胞中的亚细胞定位(标尺：10mm)Figure4-13:SubcellularlocalizationofsIFITM1andsABHD16AinHEK293cells(bar:10mm)47图4-14：sIFITM1与sABHD16A在Huh7细胞中的亚细胞定位(标尺：10mm)Figure4-14:SubcellularlocalizationofsIFITM1andsABHD16AinHuh7cells(bar:10mm)47 图4-15：sIFITM1与sABHD16A在PK15细胞中的亚细胞定位(标尺：10mm)Figure4-15:SubcellularlocalizationofsIFITM1andsABHD16AinPK15cells(bar:10mm)3、将融合荧光表达载体转染Huh7细胞中，以共转染pEGFP-N1/pdsRed-monomer-N1空载体为对照，sIFITM1、sABHD16A共转染结果表明（图4-15），在Huh7细胞中，sIFITM1、sABHD16A都有颗粒状聚集的现象，叠加后，sIFITM1和sABHD16A显示共定位于胞内颗粒状膜性结构。4.3讨论通过对sABHD16A的生物信息学分析，我们观察到sABHD16A与人的ABHD16A有较高的同源性。发现猪IFITMs与ABHD16A相互作用，对前人报道的人ABHD16A与IFITM具有相互作用是一个补充[105]。对sABHD16A功能初步探究显示其确实参与了脂代谢过程，此功能与人ABHD16A具有脂肪酶功能类似[98]。虽然酵母双杂交普遍用于研究蛋白的相互作用，但较高的假阳性率值得关注[106]。本研究通过在缺陷型选择培养基上SD-Ade/-His/-Leu/-Trp进行二次划线的方式，选择生长状态较好的菌落进行再次选择性培养基上划线，通过ZBuffer/X-α-gal进行显色实验，在阳性的菌落中，显而易见能够看到阳性的蓝色菌落出现。成功证明sIFITM1、sIFITM2、sIFITM3与sABHD16A具有相互作用。48 为了进一步说明利用sIFITM1与sABHD16A相互作用，对两个蛋白进行了亚细胞定位，发现在不同的细胞系中，虽然定位区域有所不同，但sIFITM1与sABHD16A均存在共定位现象，并且在JEV感染后，sIFITM1与sABHD16A有向内聚集现象，可能是JEV感染后sIFITM1与sABHD16A蛋白伴随JEV入侵而内化，这个有意思的现象有待进一步研究。sIFITM1的膜定位和来源于人、鼠的IFITM定位相似，不同的细胞也稍有差异。49 第五章sIFITM1抗病毒机制的初步探究5.1材料与方法5.1.1材料5.1.1.1实验材料见3.1.1.1。5.1.1.2实验仪器见3.1.1.1。5.1.1.3实验试剂与耗材见4.1.1.3。5.1.2方法5.1.2.1sabhd16a敲除载体构建1、引物设计根据克隆结果，提交NCBI数据库sabhd16a序列，通过在线设计网站（crispr.mit.edu/），遵循CRISPR/Cas9的sgRNA设计原则合成Oligos，根据数据库中基因组序列，在敲除靶点上游和下游设计特异性引物，扩增敲除靶点附近基因编辑现象。敲除靶序列和验证引物见附表。2、构建方法（1）将合成的Oligos按照溶解说明，将oligos溶解为终浓度100μM，用于下游实验。（2）0ligos退火程序：退火程序见表3-9。（3）退火完成后，进行与载体pHMG-sgRNA连接反应，见表3-10。（4）连接后转化方法见3.1.2.4中转化方法。（5）转化后，重组质粒的验证见表3-11、表3-12。（6）经菌液PCR验证正确的重组质粒送于华大基因有限公司北京测序部测序，通过DNAMAN序列比对合成Oligos序列。5.1.2.2sabhd16a敲除载体的转染1、通过细胞培养方法，培养PK-15、ST、HEK293细胞。2、通过瞬时转染敲除质粒pHMG-sgRNA-ssgRNAabhd16a。3、转染后72h，移去含有10%FCS的DMEM完全培养基，1×PBS清洗2遍，加入胰蛋白酶消化，收取细胞，1000r/min，离心5min，弃去上清，收集细胞。4、上步骤收集到一半细胞通过通用型基因组DNA快速提取试剂盒提取基因组，用于下游50 实验。5、步骤3中收集一半的细胞用来通过提取RNA，反转录合成cDNA第一条链，用于RT-PCR检测下游试验。5.1.2.3敲除sabhd16a基因细胞系的构建与筛选1、通过细胞培养方法，培养PK-15细胞。2、对生长较好的细胞1×106个/每孔进行传代至6孔板中，通过瞬时转染敲除质粒pHMG-sgRNA-ssgRNAabhd16a。3、转染36h，移去含有10%FCS的DMEM完全培养基，1×PBS清洗2遍，加入胰蛋白酶消化，收取细胞，1000r/min，离心5min，弃去上清，收集细胞。5、将每6孔板细胞重新铺板于24孔板中，37℃，5%CO2条件下培养。6、传代培养24h后，加入嘌呤霉素，使得嘌呤霉素终浓度为2ng/mL。7、之后每24h更换新的完全培养基，维持嘌呤霉素终浓度为2ng/mL8、连续培养至不再有细胞死亡。9、将24孔板中的细胞消化，一半传代于新的24孔板中，一半细胞收集用于检测。10、将收集用于检测的细胞通过通用型基因组DNA提取试剂盒提取基因组。11、将提取纯化后的基因组为模板用于PCR反应，反应引物为表5-1中扩增特异性靶点引物，引物退火温度为52℃，反应体系见表3-3，反应PCR程序为表3-4。12、取5μLPCR产物加入2μL6×DNALoadingBuffer于2%琼脂糖凝胶检测。13、将验证正确的目的条带，经过GeneMark公司PlusDNAClean/ExtractionKit试剂盒对PCR产物进行纯化回收。14、回收后的PCR产物送于北京华大基因有限公司测序测序，测序引物采用扩增引物。15、DNAMAN比对测序结果于无转染pHMG-sgRNA-ssgRNAabhd16a组测序结果。5.1.2.4敲除sabhd16a对JEV复制的影响1、通过细胞培养方法，培养ST、PK-15细胞。2、对涨势旺盛的细胞2×105个/每孔进行传代至24孔板中，通过瞬时转染pHMG-sgRNA-ssgRNAabhd16a敲除sabhd16a。3、转染12h，移去含有10%FCS的DMEM完全培养基，1×PBS清洗2遍，更换新鲜的完全培养基。4、转染后24h，按照病毒感染方法感染病毒1MOIJEV(SA14-14-2)感染细胞。5、取感染后24h培养上清，提取上清中病毒RNA，反转录合成cDNA第一条链，用于RT-PCR检测E基因表达量。51 5.1.2.5过表达sABHD16A对JEV复制的影响1、通过细胞培养方法，培养BHK-21、L02、PK-15细胞。2、对生长较好的细胞2×105个/每孔进行传代至24孔板中，通过瞬时转染过表达sABHD16A3、转染12h，移去含有10%FCS的DMEM完全培养基，1×PBS清洗2遍，更换新鲜的完全培养基。4、转染后24h，按照病毒感染方法感染病毒1MOIJEV(SA14-14-2)感染细胞。5、取感染后24h、48h、72h培养上清，提取上清中病毒RNA，反转录合成cDNA第一条链，用于RT-PCR检测E基因表达量。7、收集24h、48h、72h培养细胞，提取总蛋白，用于WesternBlot检测sABHD16A蛋白表达情况。5.1.2.6sIFITM1与sABHD16A共表达对JEV复制的探究1、通过细胞培养方法，培养BHK-21、HEK293细胞。2、对生长较好的细胞2×105个/每孔进行传代至24孔板中，通过瞬时转染pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1、pcDNA3.1(+)-HA-sabhd16a、pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1/pcDNA3.1(+)-HA-sabhd16a共转染、pcDNA3.1(+)-HA。3、转染12h，移去含有10%FCS的DMEM完全培养基，1×PBS清洗3遍，更换新鲜的完全培养基。4、转染后24h，按照病毒感染方法感染病毒1MOIJEV(SA14-14-2)感染细胞。5、取感染后24h、48h、72h培养上清，提取上清中病毒RNA，反转录合成cDNA第一条链，用于RT-PCR检测E基因表达量。5.1.2.7sIFITM1S-棕榈酰化位点突变体构建1、sIFITM1突变体的构建根据生物信息学分析，通过融合PCR原理，设计构建突变体引物，将半胱氨酸（C）突变为丝氨酸（S）。表5-1sifitm1突变体引物Table5-1Primersofsifitm1mutant引物名称序列（5’-3’）sifitm1-C50-51A-FTCCTGAACTGGAGCAGCCTGGGCTTCGTGGsifitm1-C50-51A-RCCACGAAGCCCAGGCAGCACCAGTTCAGGAsifitm1-C84-FCCCAGATGTTCAGGCACTTGGCGGTGGAGGsifitm1-C84-RCCTCCACCGCCAAGAGCCTGAACATCTGGG2、PCR突变扩增设计：（1）sifitm1-F、sifitm1-C5051A-R；sifitm1-C50-51A-F、sifitm1-R；为两组引物，以pcDNA3.1(+)-52 HA-sifitm1为模板，扩增后的片段经PCR产物回收，以两种产物各取适量混合后为模板，以sifitm1-F、sifitm1-R为引物，PCR扩增得到含有C50A、C51A的突变位点的突变体pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1-C50A-C51A。（2）sifitm1-F、sifitm1-C84-R；sifitm1-C84-F、sifitm1-R；为两组引物，以pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1为模板，扩增后的片段经PCR产物回收，以两种产物各取适量混合后为模板，以sifitm1-F、sifitm1-R为引物，PCR扩增得到含有C84A的突变位点的突变体pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1-C84A。（3）sifitm1-F、sifitm1-C5051A-R；sifitm1-C50-51A-F、sifitm1-C84-R；sifitm1-C84-F、sifitm1-R；为三组引物，以pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1为模板，扩增后的片段经PCR产物回收，以三种产物各取适量混合后为模板，以sifitm1-F、sifitm1-R为引物，PCR扩增得到含有C50A、C51A、C84A突变位点的突变体pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1-C50A-C51A-C84A。3、将以上设计的扩增引物，在PCR体系中，按照表3-3加入反应体系，反应体系按照表3-4的反应程序进行目的片段的扩增。4、反应完成后按照表3-6目的片段与载体的连接反应进行连接。5、按照重组质粒的转化DH5α的方法，将上述构建的重组质粒进行转化。6、按照重组质粒的验证体系表3-7进行重组质粒的验证，程序按照表达3-8PCR程序进行反应。7、将验证正确的重组质粒，送于北京华大基因有限公司测序。5.1.2.8sIFITM1S-棕榈酰化位点突突变体对JEV复制的影响1、通过细胞培养方法，培养PK-15细胞。2、对生长较好的细胞2×105个/每孔进行传代至24孔板中，通过瞬时转染pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1-C50A-C51A-C84A。3、转染12h，移去含有10%FCS的DMEM完全培养基，1×全培养清洗2遍，更换新鲜的完全培养基。4、转染后24h，按照病毒感染方法感染病毒1MOIJEV(SA14-14-2)感染细胞。5、取感染后24h培养上清，提取上清中病毒RNA，反转录合成cDNA第一条链，用于RT-PCR检测E基因表达量。5.2结果与分析5.2.1sabhd16a基因敲除载体构建的结果对阳性克隆子进行菌液PCR验证，结果显示成功构建pHMG-sgRNA-ssgRNAabhd16a（图5-1）。53 图5-1：pHMG-sgRNA-ssgRNAsabhd16a重组质粒菌液PCR验证（M：DM2000DNAMarker；1-3：pHMG-sgRNA-ssgRNAsabhd16a菌液PCR）Figure5-1:PCRvalidationofrecombinantplasmidpHMG-sgRNA-ssgRNAsabhd16aBacterialPCRofM:DM2000DNAMarker;1-3:pHMG-sgRNA-ssgRNAsabhd16a5.2.2sabhd16a敲除的结果在PK15、ST细胞中转染pHMG-sgRNA-ssgRNAabhd16a，并用定量方法检测sabhd16a的mRNA表达，结果显示sabhd16a的表达量明显降低（图5-2）。在PK15细胞中，转染pHMG-sgRNA-ssgRNAabhd16a，检测sabhd16a基因相对对照组表达量有显著性下调（图5-2A，P=0.005043）；在ST细胞中，转染pHMG-sgRNA-ssgRNAabhd16a，检测sabhd16a基因表达，结果显示比对照组显著性降低（图5-2B，P=0.004689）图5-2：在PK15、ST细胞中验证敲除基因后sabhd16a基因相对表达量A：PK15；B：STFigure5-2:Relativeexpressionofsabhd16ainPK15andSTcellsA:PK15;B:ST5.2.3基因敲除sabhd16a细胞系构建结果对转染敲除质粒的细胞进行抗生素筛选，提取筛选细胞的DNA，送公司测序，对靶位点测序结果显示在主峰下，有明显的亚峰出现，说明靶标序列对基因进行了有效的编辑，然后通过嘌呤霉素筛选获得单克隆敲除细胞系。54 图5-3：基因敲除sabhd16asanger测序HEK293转染pHMG-sgRNA-ssgRNAabhd16a的细胞DNA靶标位点sanger测序峰图Figure5-3:Knockoutsabhd16asangersequencingpHMG-sgRNA-ssgRNAabhd16atransfectedwithHEK293Sangersequencingpeakmap5.2.4敲除sabhd16对JEV复制影响在敲除sabhd16的PK15和ST细胞中，JEV的拷贝数明显升高，与对照相比，差异显著（分别为p=0.020642和p=0.015007）。该结果说明sABHD16A对JEV具有抑制作用。图5-4：PK15和ST细胞敲除sabhd16a后JEV的复制抑制A：K15细胞；B：ST细胞(T检验：*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001)Figure5-4:TheinhibitionofJEVinPK15andSTcellssabhd16a-knockoutA:PK15cells;B:STcells（Ttest:*:P<0.05;**:P<0.01；***:P<0.001)5.2.5过表达sABHD16A对JEV复制影响在BHK-21细胞中，通过瞬时转染pcDNA3.1(+)-HA-sabhd16a过表达sABHD16A，感染病毒后24h，过表达组相对于对照组对病毒有显著抑制，病毒复制，感染病毒后48h，转染组相对于未转染组，抑制JEV作用更为明显（p=0.005743）（图5-5A）。在L02细胞中，过表达sABHD16A蛋白，相对于对照组，感染病毒后24h（p=0.617794），对JEV复制的影响无显著差异，48h（p=0.000354）和72h(P=0.003127)测定结果显示对JEV复制的抑制差异极其显著（图5-5B）。55 在HEK293中，过表达sABHD16A蛋白，24h(P=0.121374)感染病毒后与对照组无显著性差异对JEV病毒复制有影响，48h(p=0.049712)，具有差异性显著抑制JEV病毒的复制，72h（p=0.020415），具有显著抑制病毒复制的作用（图5-5C）。图5-5：在三种细胞中过表达sABHD16A对JEV(SA14-14-2)复制的影响A：BHK-21细胞过表达sABHD16A，24h、48h、72h检测JEV(SA14-14-2)拷贝数；B：L02细胞过表达sABHD16A，24h、48h、72h检测JEV(SA14-14-2)拷贝数；C：HEK293过表达sABHD16A，24h、48h、72h检测JEV(SA14-14-2)拷贝数。(T检验：*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001)，D：HEK293中24h、48h、72hsABHD16A表达情况。Figure5-5:EffectofoverexpressionofsABHD16AonthereplicationofJEV(SA14-14-2)in3differentcelllinesA:JEV(SA14-14-2)copynumberinsABHD16A-overexpressingBHK-21cellsat24h,48h,and72h;B:JEV(SA14-14-2)copynumberinsABHD16A-overexpressingL02cellsat24h,48h,and72h.C:JEV(SA14-14-2)copynumberinsABHD16A-overexpressingHEK293,at24h,48h,and72h.(Ttest:*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001).D:sABHD16AexpressioninHEK293at24h,48h,and72h.5.2.6sIFITM1与sABHD16A共表达对JEV复制影响的结果在BHK-21细胞中，与正常表达细胞相比，在单独过表达sIFITM1或sABHD16A时，结果如下：在感染24h（p=0.021713）、48h(p=0.001277)和72h(p=0.011024)，sIFITM1都显著抑制JEV的复制。过量表达sABHD16A时，在感染的后的24h（p=0.025707）、48h(p=0.005743)和72h(p=0.011498)也都显著抑制JEV的复制。在将pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1/pcDNA3.1(+)-HA-sabhd16a共转后，在感染的三个时间点检测病毒的量，结果显示共表达两个蛋白对JEV56 的抑制作用明显比单独表达的抑制作用强。这个结果说明sIFITM1与sABHD16A有协同抑制JEV复制的功能。图5-6：共表达sIFITM1与sABHD16A对JEV复制的影响(Ttest：*：P<0.05；**P<0.01；***：P<0.001)Figure5-6:Effectsofco-expressionofsIFITM1andsABHD16AonJEVreplication5.2.7sIFITM1S-棕榈酰化位点突变体构建的结果为了探明sIFITM1的抗JEV作用是否和其棕榈酰化有关，采用PCR点突变技术，扩增出棕榈酰化位点序列突变体（图5-7），并构建突变体载体pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1-C50A-C51A-C84A、pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1-C84A、pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1-C84A真核表达载体（图5-8）。图5-7：sIFITM1突变体片段PCR扩增图A：M：DM2000DNAMarker；1：sifitm1-F、sifitm1-C84-RPCR扩增片段；2：sifitm1-C50-51A-F、sifitm1-RPCR扩增目的片段；3-4：sifitm1-F、sifitm1-RPCR扩增目的片段；5：sifitm1-F、sifitm1-C84-RPCR扩增片段；6：sifitm1-C84-F、sifitm1-RPCR扩增片段；7-8：sifitm1-F、sifitm1-RPCR扩增片段；图B：M：DM2000DNAMarker；1：sifitm1-F、sifitm1-C5051A-RPCR扩增目的片段；2：sifitm1-C50-51A-F、sifitm1-RPCR扩增目的片段；3：sifitm1-C50-51A-F、sifitm1-C84-RPCR扩增目的片段；5：sifitm1-C84-F、sifitm1-RPCR扩增目的片段；6：sifitm1-F、sifitm1-RPCR扩增目的片段Figure5-7:sIFITM1mutantfragmentPCRamplificationA:M:DM2000DNAMarker;1:sifitm1-F,sifitm1-C84-RPCRamplifiedfragment;2:sifitm1-C50-51A-F,sifitm1-57 RPCRamplifiedtargetfragment;3-4:sifitm1-F,sifitm1-RPCRamplificationofthetargetfragment;5:sifitm1-F,sifitm1-C84-RPCRamplificationfragment;6:sifitm1-C84-F,sifitm1-RPCRamplificationfragment;7-8:sifitm1-F,sifitm1-RPCRamplifiedfragment;panelB:M:DM2000DNAMarker;1:sifitm1-F,sifitm1-C5051A-RPCRamplifiedfragment；2:sifitm1-C50-51A-F,sifitm1-RPCRamplifiedtargetfragment;3:sifitm1-C50-51A-F,sifitm1-C84-RPCRamplifiedtargetfragment;5:sifitm1-C84-F,sifitm1-RPCRamplificationTargetfragment;6:sifitm1-F,sifitm1-RPCRamplificationofthetargetfragment图5-8：pcDNA3.1(+)-HA-sifiitm1突变体菌液PCR验证M：DM2000DNAMarker；1-2：pcDNA3.1(+)-HA-sifiitm1-C50A-C51A；2-5：pcDNA3.1(+)-HA-sifiitm1-C84A；6-7：pcDNA3.1(+)-HA-sifiitm1-C50A-C51A-C84AFigure5-8:PCRvalidationofpcDNA3.1(+)-HA-sifiitm1M:DM2000DNAMarker;1-2:pcDNA3.1(+)-HA-sifiitm1-C50A-C51A;2-5:pcDNA3.1(+)-HA-sifiitm1-C84A;6-7:pcDNA3.1(+)-HA-sifiitm1-C50A-C51A-C84A5.2.8sIFITM1S-棕榈酰化位点突变体对JEV复制的影响过表达sIFITM1、sABHD16A、C50A-C51A-C84A位点突变的▲sIFITM1、sIFITM1sABHD16A、▲sIFITM1/sABHD16A后感染JEV（SA14-14-2)，取24h后培养上清，RT-PCR检测病毒拷贝数。相对于转染对照组，转染sIFITM1(p=0.000242)、sABHD16A(p=0.00021)、共转sIFITM1/sABHD16A(p=0.000126)后，JEV的复制均被明显抑制。而转染▲IFITM1的细胞中，病毒拷贝数明显高于转染野生sIFITM1组；且共转染突变体▲IFITM1和sABHD16A时，病毒拷贝数高于共转染sIFITM1/sABHD16A（p=0.007667）。这些结果说明猪IFITM1的抗病毒作用也依赖于其棕榈酰化位点，且该位点功能的发挥和sABHD16A的相互作用有关。图5-9：共表达sIFITM1与sABHD16A对JEV病毒复制的影响过表达sIFITM1、sABHD16A、▲sIFITM1、sIFITM1sABHD16A、▲sIFITM1/sABHD16A后感染JE58 （SA14-14-2)，取24h后培养上清RT-PCR检测病毒拷贝数（载体：pcDNA3.1(+)-HA；IFITM1：pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1；▲sIFITM1：pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1-C50A-C51A-C84A；sABHD16A：pcDNA3.1(+)-HA–sabhd16a；sIFITM1/sABHD16A：pcDNA3.1(+)-HA–sabhd16a/pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1）(Ttest：*：P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)Figure5-9:Effectsofco-expressionofsIFITM1andsABHD16AonJEVreplicationOverexpressionofsIFITM1,sABHD16A,▲sIFITM1,sIFITM1sABHD16A,▲sIFITM1/sABHD16AafterinfectionwithJEV(SA14-14-2),24hafterculturesupernatantRT-PCRdetectionofviruscopynumber(Vector：pcDNA3.1(+)-HA;IFITM1:pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1;▲sIFITM1:pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1-C50A-C51A-C84A;sABHD16A:pcDNA3.1(+)-HA–sabhd16a;sIFITM1/sABHD16A:pcDNA3.1(+)-HA–sabhd16a/pcDNA3.1(+)-HA-sifitm1）(Ttest：*:P<0.05；**:P<0.01；***P:<0.001)5.3讨论目前研究报道IFITM蛋白家族抗病毒确切的作用机制尚不十分清楚，IFITM通常在病毒通过外包被蛋白侵染细胞阶段具有抵御作用，一般RNA病毒逃逸IFITM的限制作用较为困难[25,40]。本研究中，JEV在过表达sIFITM蛋白的几种细胞系均抑制JEV复制，且和其相互作用蛋白sABHD16A对病毒进行协同抑制，但在不同的细胞系中，过表达sABHD16A显示出不同的抑制病毒复制能力，这可能是因为在非同源物种中，参与sABHD16A抑制病毒的细胞因子协同发挥作用不同。报道显示的IFITM1氨基酸序列中三个S-棕榈酰化位点对其功能的发挥非常重要[107]，本研究分析了猪的IFITM序列，发现这三个位点也保守存在。对突变体的抗JEV效果的测定结果显示，半胱氨酸位点（C50A-C51A-C84A）相应突变后，其抗JEV作用明显减弱，和人、鼠的IFITM的报道相似。根据亚细胞定位结果，推测该翻译后S-棕榈酰化修饰，可能影响JEV与膜的结合、膜结构域的分隔、运输或稳定性。本研究首次证明了sABHD16A能有效地抑制JEV，不仅扩展了sABHD16A的功能，也初步显示其通过和sIFITM1相互作用来抵御JEV病毒复制的可能机制。59 第六章sIFITMs与sABHD16A对炎症因子表达的影响6.1材料与方法6.1.1材料6.1.1.1实验材料见表3.1.1.1。6.1.1.2实验仪器见表3.1.1.2。6.1.1.3实验试剂与耗材见表3.1.1.3。6.1.2方法6.1.2.1感染JEV病毒对sifitm1与sabhd16a表达的影响1、在PK15细胞中，感染JEV病毒后，在不同时间对sifitms、sabhd16a基因表达的影响（1）通过细胞培养方法，培养PK15细胞。（2）对生长较好的细胞进行传代至24孔板中。（3）铺板24h后，移去含有10%FCS的DMEM完全培养基，1×PBS清洗3遍，更换新鲜的完全培养基。（4）按照病毒感染方法感染病毒1MOIJEV(SA14-14-2)感染细胞。（5）取感染后6h、12h、24h、36h、48h培养细胞，提取上清中病毒RNA，反转录合成cDNA第一条链，用于RT-PCR检测E基因表达量。2、在HEK293、ST细胞中，感染病毒后48h检测sifitms、sabhd16a基因表达的影响。方法同上6.1.2.1中1的方法。6.1.2.2sIFITM1、sABHD16A在炎症因子表达中的影响（1）通过细胞培养方法，培养HEK293细胞。（2）对生长较好的细胞进行传代至24孔板中。（3）铺板24h后，移去含有10%FCS的DMEM完全培养基，1×PBS清洗3遍，更换新鲜的完全培养基。（4）按照病毒感染方法感染病毒1MOIJEV(SA14-14-2)感染细胞。（5）取感染后48h培养细胞，提取细胞总RNA，反转录合成cDNA第一条链，用于RT-PCR检测E基因表达量。60 6.2结果与分析6.2.1JEV感染对sifitms与sabhd16a表达的影响1、JEV感染对PK15细胞sifitms、sabhd16a基因表达的影响SA14-14-2病毒感染PK15后，分别在6h、12h、24h、36h、48h检测sifitm1和sabhd16a的表达量，结果显示，和未感染细胞相比，6h、12h、24h、36h时的sifitm1有显著性的下调（图6-1A，p<0.01）；感染JEV6h和36h后，sifitm2具有及其显著性差异（图6-1B，P<0.001），而在12h、24h相对升高（p<0.01），无显著性变化（P>0.05）；在感染JEV6h后，sifitm3显著性降低（图6-1C，P<0.001），而在12h显著升高（p<0.01），24h、36h后sifitm3基因表达量则极其显著下调，48h后随略有增加，但仍低于未感染对照组（p<0.01）；与未感染对照组相比，感染病毒后的6h、24h、36h、48h，sabhd16a基因的相对表达量极显著性降低（P<0.001），12h后，sabhd16a基因相对表达量显著性的下调（p<0.01），但sabhd16a都明显低于对照细胞的表达量。图6-1：SA14-14-2病毒感染PK15后，不同时间检测sifitms、sabhd16a基因表达量A：SA14-14-2病毒感染后sifitm1表达量；B:SA14-14-2病毒感染后sifitm2表达量；C：SA14-14-2病毒感染后，sifitm3表达量；D：SA14-14-2病毒感染后sabhd16a表达量；(Ttest：*：P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)Figure6-1:Expressionofsifitmsandsabhd16ainPK15cellatdifferenttimesafterSA14-14-2virusinfectionA:sifitm1expressionlevelsafterinfectionwithSA14-14-2virus;B:sifitm2expressionlevelsafterSA14-14-2virusinfection.C:sifitm3expressionafterinfectionwithSA14-14-2virus;D:sabhd16aexpressionafterSA14-14-2virusinfection.(Ttest:*:P<0.05;**P<0.01;***P<0.001)61 2、JEV感染对HEK293、ST细胞sifitms、sabhd16a基因表达的影响相对于未感染细胞，JEV（SA14-14-2）感染的ST细胞中，ifitm1表达也显著性降低（p=0.004834），ifitm2基因有极其显著性升高（p=0.000073），ifitm3基因显著降低（p=0.017015），sabhd16a基因极显著性降低（p=0.00072）。相对于未感染细胞，JEV（SA14-14-2）感染的HEK293细胞中，ifitm1基因无差异性显著变化（p=0.891242），ifitm2基因有显著升高（p=0.018445），ifitm3基因极显著升高（p=0.000815），sabhd16a基因表达显著性降低（p=0.013827）。图6-2：在HEK293、ST细胞中，感染病毒48h后sifitms、sabhd16a基因表达A：ST细胞；B：HEK293细胞Figure6-2:Effectofsifitmandsabhd16ageneexpressioninHEK293andSTcellsinfectionwithJEV,A:STcell;B:HEK293cells,6.2.2过表达sIFITM1、sABHD16A对炎症因子表达影响的结果（1）MCP-1基因的表达变化（图6-3A）。在HEK293细胞中，和转染空载体的对照细胞相比，单转染和共转染时，MCP-1基因的表达量显著降低；在感染病毒组中，MCP-1基因的表达量更低。（2）IL6基因的表达变化（图6-3B）。分别转染sIFITM1、sABHD16A时，IL6明显升高，而共转染时，则明显下降，说明sIFITM1和sABHD16A的相互作用可降低炎症因子表达。在病毒感染组中，与空载体对照相比，IL6的表达量有所升高，但sIFITM1和sABHD16A共表达有降低IL6表达。（3）TNFα基因的表达变化（图6-3C）。分别转染sIFITM1、sABHD16A时，TNFα表达明显升高，而共转染时，则极其明显下降，而感染病毒组的TNFα都所降低。（4）IL1β基因的表达（图6-3D）。分别转染sIFITM1、sABHD16A时，IL1β表达明显升高，而共转染时，则极其明显下降，而感染病毒组的IL1β表达差异较大。.（5）IL10基因的表达变化（图6-3E）。分别转染sIFITM1、sABHD16A时，IL10表达明显升高，而共转染时，则极其明显下降，而感染病毒组的IL10表达也明显较低。（6）COX2基因表达变化（图6-3F）。COX2基因表达量在分别转染sIFITM1和sABHD16A及共转染时，都明显升高，而JEV的感染能使COX2的表达量降低。62 总之，对以上炎症相关因子的检测结果显示，单独过量表达sIFITM1、sABHD16A会提高炎症因子的表达，而共转染则可降低大部分因子的表达；而病毒感染也能抵消过表达所引起的炎症因子高表达。图6-3：过量表达sIFITM1、sABHD16A及JEV感染对炎症因子的表达影响A：MCP-1；B:IL-6；C：TNFα；D：IL1β；E：IL10；F：COX2Figure6-3:EffectsontheexpressionofinflammatoryfactorsafteroverexpressionofsIFITM1and/orsABHD16AinHEK293cells.A:MCP-1;B:IL-6;C:TNFα;D:IL1β;E:IL10;F:COX263 6.3讨论本研究发现细胞感染JEV后，sifitm1、sabhd16a的表达均有显著性下调，说明在所监测的时间点，病毒的入侵导致了sifitm1、sabhd16a表达变化，该结果提示这两个基因可能参与调控病毒入侵，但其表达的下调是不是病毒的一种免疫逃逸，则有待于进一步研究。并且在JEV入侵的不同时间，sabhd16a基因一直表现为显著降低，在感染JEV48h后，发现sifitm1恢复到与对照组接近的水平，这可能表明该基因在JEV入侵的前期发挥功能。在JEV入侵的前期（12h），sifitm1、sifitm2基因的表达量均具有显著升高，说明在JEV入侵过程中，该阶段发挥重要的抑制病毒的功能。研究结果显示，在不同的细胞系中，ifitm2在JEV入侵过程中，有显著mRNA水平的升高，在此过程中的功能还有待进一步研究。本研究中发现，IFITM1作为主要的抗病毒蛋白，在病毒入侵过程中发挥重要的生物活性，与前人在研究人的IFITM的抗病毒作用的研究结果一致[25]。肿瘤坏死因子TNF-α（tumornecrosisfactoralpha,TNF-α）是一个重要的的炎症相关因子，参与炎症产生、自身免疫、恶性肿瘤发生、细胞凋亡具有重要的作用[108-110]。已有的研究结果表明流行性乙型脑炎可以引起血TNF升高[111]。对病毒的复制具有一定的抑制作用，同时识别上游细胞因子IL1、IL-6的信号，应答败血症。本研究发现过表达sIFITM1和sABHD16A都能够促使该细胞因子显著性表达水平升高，过表达sIFITM1和sABHD16A后感染JEV，发现该因子表达水平有显著降低，进一步说明TNF-α在JEV感染中发挥功能，共表达两个蛋白结果显示降低了TNF-α的表达水平。细胞因子白介素-1β（IL-1β）是一种促炎细胞因子，可以被许多细胞类型表达[112]，可以通过内源性和竞争IL-1受体拮抗剂（IL-1RA），即能在发炎的组织产生的抗炎细胞因子被抑制。IL-1β是先天性免疫应答的一个重要的促炎性细胞因子[113]，在过表达sIFITM1后，与过表达后感染JEV比较，IL-1β表达量显著被降低。这和IL-1β通过激活免疫细胞并诱导许多次级促炎性细胞因子而在炎症反应中起关键作用的结果一致[114]。本研究的实验结果表明，过表达sIFITM1和sABHD16A都能够促使该细胞因子显著性表达水平升高，共转染后没有检测到该因子的表达，重复实验多次未检测到，推测是在共表达后，mRNA水平过低，并未被检测到。在共表达后感染JEV，检测到该因子上调。sIFITM1和sABHD16A对炎症因子的表达影响的结果提示，二者的相互作用有可能在有效平衡炎症方面发挥重要作用。64 第七章结论与展望7.1结论本研究研究了猪IFITMs的抗JEV作用，鉴定了其相互作用蛋白sABHD16A，证明了sABHD16A的抗JEV作用，并其相互作用在炎症发生作用中的角色进行了初步探究。不仅为后续研究开展提供了实验材料，也为乙型脑炎的预防和治疗提供了理论支持。主要研究结论如下：1、猪IFITMs具有抗JEV作用，其中sIFITM1抗JEV能力最强。2、通过酵母双杂交体系证明sIFITM1、sIFITM2、sIFITM3与sABHD16A具有相互作用关系。亚细胞定位研究证明sIFITM1与sABHD16A在细胞中具有共定位现象，JEV的入侵引起sIFITM1与sABHD16A蛋白的共转移。3、sABHD16A是一个具有脂酶功能的蛋白，且具有抑制JEV复制的功能。sIFITM1和sABHD16A相互作用可提高抑制JEV复制的能力。4、sIFITM1的抗JEV能力和其棕榈酰化有关，而其棕榈酰化则可能和sABHD16A有关。5、JEV感染可导致sABHD16A基因表达下调，而sIFITM1和sABHD16A的相互作用则有效地平衡JEV感染引起的炎症。7.2展望本研究所取得的研究结果扩大了IFITM的抗病毒谱，对其相互作用蛋白的鉴定和功能的研究有望拓展未来的研究方向，为进一步阐释IFITM抗病毒机制和解析宿主细胞在抵御病原微生物的机制提供了较好的理论研究基础。IFITMs和ABHD16A将来有可能被用作预防和控制感染疾病的新型靶点和潜在的抗病毒因子。未来对sIFITM1与sABHD16A在抗乙型脑炎病毒作用的机制研究，不仅有利于理解先天免疫在抵抗病毒过程，对其它病毒的抵抗作用的研究也提供了研究思路。在后期的研究中，将继续探究sABHD16A在SIFITM1S-棕榈酰化中所扮演的角色，有望进一步揭示其抗病毒和乙型脑炎发病方面的重要功能。65 附表：引物序列引物名称序列（5’-3’）sifiitm1-FATCAAGAGCCAGCACGAGsifiitm1-RGAACAGGGACCAGACGATsifiitm2-FAGATGGTGGGAGACATCACTsifiitm2-RCTGGTAGGCTGTTATGTATAsifiitm3-FTGGGAGACATCATTGGGGsifiitm3-RAACTGCTTGGAAAATTACsabhd16a-FGACTCAGAAAGGGCCGCGTsabhd16a-RGGGAGAGGAGTAATAAGAGshprt1-FGGACTTGAATCATGTTTGTGshprt1-RCAGATGTTTCCAAACTCAAChINOs-FAATGTGGAGAAAGCCCCCTGhINOs-RGGGGACTCATTCTGCTGCTThIL-1β-FGCTCGCCAGTGAAATGATGGhIL-1β-RGTCCTGGAAGGAGCACTTCAThifitm1-FGCACCATCCTTCCAAGGTCChifitm1-RTATGAAGCCCAGACAGCACChifitm2-FGTTGGTCGTCCAGGCCCAGChifitm2-RCTGTGGGGACAGGGCGAGGAhifitm3-FGCTGATCTTCCAGGCCTATGhifitm3-RGATACAGGACTCGGCTCCGGhIL-6-FAGTGAGGAACAAGCCAGAGChIL-6-RATTTGTGGTTGGGTCAGGGGhIL-10-FTGCCAAGCCTTGTCTGAGAThIL-10-RCACATGCGCCTTGATGTCTGhTNFα-FGCTGCACTTTGGAGTGATCGhTNFα-RCTTGTCACTCGGGGTTCGAGhCOX2-FGTTCCACCCGCAGTACAGAAhCOX2-RAGGGCTTCAGCATAAAGCGThMCP-1-FATGAAAGTCTCTGCCGCCChMCP-1-RGGGCATTGATTGCATCTGGChabhd16a-FGATACGTACTATCAGCCCCGTGhabhd16a-RAGGCGAAGGGAGAGGAGTAAT66 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ABSTRACTSWINEIFITMINHIBITSJAPANESEENCEPHALITISVIRUSVIAITERACTIONWITHABHD16ASupervisor:MasterCandidate:ABSTRACT:JapaneseencephalitisB(EpidemicencephalitisB)isaseriouszoonosesinfectiousdiseasecausedbytheJapaneseencephalitisvirus(JEV).ThedamageofJapaneseencephalitisvirusintheworldisbecomingmoreandmoreserious.Interferon-inducedtransmemberaneproteins(IFITMs)aresmalltransmembraneproteinsinducedbyinterferon(IFNs).StudieshaveshownthatIFITMfamilyproteinshavebroadspectrumantiviralcapabilities.Preliminarylaboratorystudiespreliminarilydemonstratedthatporcine-derivedinterferon-inducedtransmembraneproteins(sIFITMs)inhibitJEVaction.TofurtherinvestigateitsmechanismandtheroleinthedevelopmentofJapaneseencephalitis,relatedstudieswereconducted.Theresultsareasfollows:1.Real-timefluorescencequantitativePCRwasusedtodetectthereplicationofJEVwhenoverexpressingIFITMs.TheresultsshowedthatoverexpressionofsIFITM1,sIFITM2,andsIFITM3proteinsinPK15andHEK293cellssignificantlyinhibitedthereplicationofJEVat24h,48h,and72h,ofwhichIFITM1hadthestrongestabilitytoinhibitvirusreplication.TofurtherverifytheeffectofsIFITM1onvirusreplication,sIFITM1wasknockedoutinPK15cellsandSTcellsbyCRISPR/cas9technology.TheresultsshowedthatdeletionofsIFITM1significantlyincreasedJEVvirusreplicationat24h.2.Inordertoexploretheanti-JEVmechanismofsIFITMs,sIFITM1withstronganti-JEVeffectwasselectedastheobject,andtheinteractingproteinswerescreenedandstudied.Yeasttwo-hybridexperimentsconfirmedtheinteractionbetweensIFITM1andsABHD16A.InPK15andHEK293cells,theco-localizationofsIFITM1andsABHD16Aonthemembranestructurewasfoundbylaserconfocalsubcellularlocalizationtechnique.AfterJEVinfectedcells,theco-localizationofsIFITM1andsABHD16Awastransferredwithvirusinfection.76 3.ThecellculturesupernatantwasdetectedbyoverexpressingsABHD16AinBHK21,L02andHEK293cellsat24h,48hand72h.TheresultsshowedthatsABHD16AsignificantlyinhibitedJEVvirusreplication.TheCRISPR/cas9knockoutvectorpHMG-sgRNA-ssgRNAabhd16awasconstructedandthesabhd16awasknockedoutinPK15andSTcells.TheinfectionofthecellswithJEVfor24hourshadasignificantincreaseinJEVreplicationrelativetothecontrolgroup.4.ThepHMG-sgRNA-ssgRNAabhd16awastransfectedintoHEK293cells.AmonoclonalcelllinewithstabledeletionofsABHD16A-/-wasselectedandconstructed.DNAsequencingshowedthatsABHD16AwasknockedoutsuccessfullyinHEK293cells.5.ToinvestigatetheeffectofsIFITM1andsABHD16AinteractiononJEVinfection,sIFITM1andsABHD16Aexpressionplasmidswereco-transfectedintoBHK-21cells.Theresultsshowedthattheantiviraleffectofco-expressionofthetwoproteinswassignificantlystrongerthanthatofsIFITM1alone,indicatingthatsABHD16ASynergisticanti-JEVeffect.6.Inordertostudywhethertheanti-JEVeffectisrelatedtotheS-palmitoylationofsIFITM1,aS-palmitoylationsitemutantexpressionplasmid▲sIFITM1(sIFITM1-C50A-C51A-C84A)wasconstructedandtransfectedintoPK15cells.ComparedwithtransfectedsIFITM1,sABHD16AandsIFITM1/sABHD16A,theinhibitionofJEVwassignificantlydecreasedwhentransfectedwithsIFITM1,andthesynergisticanti-JEVactivitywassignificantlydecreasedwhensIFITM1/sABHD16Awasco-transfected.Thisresultinitiallydemonstratedthattheanti-JEVeffectofsIFITM1isrelatedtoitspalmitoylation,andthepalmitoylationofthissitemayberelatedtosABHD16A.7.TodeterminewhethersIFITMandsABHD16AareinvolvedintheregulationofJapaneseencephalitis,fluorescencequantitativePCRwasusedtodeterminetheexpressionofinflammation-relatedfactorsincellsoverexpressingsIFITM1orsABHD16A.TheresultsshowedthatIL-1β,IL-6,IL-10,TNFαandCOX2levelsincreasedsignificantly.However,whensIFITM1/sABHD16Awasco-expressed,themRNAofthesecytokineswassignificantlyreducedtobelowthecontrollevelwiththeexceptionofCOX2.ThemRNAlevelsofIL-1β,IL-6andTNF-αincreasedsignificantlyinJEV-infectedcellsexpressingsABHD16A,whereastheexpressionofinflammatoryfactorsinJEV-infectedcellsexpressingsIFITM1/sABHD16Awassignificantlyhigherthanthatincontrolandotherinfectedcells.Itsdecreaseindicated77 thatsIFITM1couldplayanimportantroleinregulatingthebalanceofinflammation.Theresultsaboveobtainedinthisstudynotonlyprovideaseriesofexperimentalmaterialsforfollowingresearch,butalsoprovidetheoreticalsupportforthepreventionandtreatmentofJapaneseencephalitis.Keywords:Japaneseencephalitisvirus,IFN-inducedtransmembraneprotein,sABHD16A,antiviral,effectinteraction,cytokines78