重组结核分枝杆菌蛋白MPT64金纳米棒生物传感器诊断结核病的研究

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硕士学位论文重组结核分枝杆菌蛋白MPT64金纳米棒生物传感器诊断结核病的研究学科专业病原生物学学位类型☑科学学位□专业学位研究生姓名蒋华科导师姓名、职称袁仕善教授论文编号湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一六年五月 湖南师范大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进斤研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其值个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体。，均已在文中明确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签杂：么年６月ｂ曰湖南师范大学学位论文版巧使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查閑和借阅。本人授权湖南卿范大学可Ｌ乂将本学位论文的Ｌ乂、全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可采用影印缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于１□。、保密，在年解密后适用本授权书２、不保密过。＂－’（请在Ｌ乂上相应方框巧打Ｖ）作者签葦：日期：么？／备年６月６曰导师签葦：曰期：＾年／月＾曰 分类号密级学校代码10542学号201302191464重组结核分枝杆菌蛋白MPT64金纳米棒生物传感器诊断结核病的研究DiagnosisoftuberculosiswithgoldnanorodsbiosensorbasedonrecombinantMycobacteriumtuberculosisproteinMPT64研究生姓名蒋华科指导教师姓名、职称袁仕善教授学科专业病原生物学研究方向病原分子生物学湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一六年五月 摘要目的：构建原核表达质粒pET-28a(+)-mpt64，表达并纯化重组MPT64；酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）与金纳米棒生物传感器分析重组MPT64抗原诊断结核病的效果，为结核病血清学诊断提供实验依据与技术支持。方法：提取结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA，PCR扩增mpt64基因，克隆至pMD18-T载体，菌落PCR与测序鉴定阳性克隆，亚克隆至pET-28a(+)表达载体，菌落PCR与限制性内切酶酶切鉴定阳性重组子。IPTG诱导重组蛋白表达，亲和层析纯化重组蛋白MPT64，western-blot分析MPT64的抗原性。Bradford法测定MPT64抗原浓度，ELISA评价重组蛋白诊断结核病的效果。采用种子生长法制备金纳米棒，经十一巯基十一烷酸（MUA）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）化学修饰，将MPT64连接至金纳米棒，制备金纳米棒生物传感器，评价其诊断结核病的效果。结果：自结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增出mpt64基因；经克隆和测序鉴定，扩增的mpt64基因序列与GenBank中H37Rv的mpt64基因序列99%同源；经PCR和双限制性内切酶酶切鉴定，获得了与预期大小一致的DNA片段，表明成功构建原核表达质粒pET-28a(+)-mpt64。IPTG诱导阳性重组菌表达约26kDa的重组MPT64，经western-blot分析其具有良好的抗原性。ELISA分析MPT64诊断结核病的敏感度为81.4%，特异性为94.9%，阳性预测值为94.1%，阴性预测值为83.6%，诊断效率为88.1%。制备的金纳米棒经化学修饰后，成功构建基于MPT64抗原的金纳米棒生物传感器，其诊断结核病的敏感度为91.5%，特异性为93.2%，阳性预测值为I 93.1%，阴性预测值为91.7%，诊断效率为92.4%。对重组MPT64抗原的ELISA和金纳米棒生物传感器法检测结核病的效果，进行配对2的四格表卡方检验χ分析，P=0.146>0.05，差异无统计学意义。结论：（1）成功克隆和表达重组蛋白MPT64。（2）纯化的重组MPT64具有良好的抗原性。（3）重组MPT64的金纳米棒生物传感器诊断结核病具有较高的灵敏度与特异性。关键词：结核分枝杆菌；MPT64；金纳米棒；生物传感器；结核病诊断II ABSTRACTObjective:ToconstructprokaryoticexpressionplasmidpET-28a(+)-mpt64soastoexpressandpurifyrecombinantproteinMPT64.ThediagnositicvalueofrecombinantproteinMPT64fortuberculosiswasanalyzedbyEnzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)andnanometergoldbiosensors,astoprovideexperimentalbasisandtechnicalsupportforserologicaldiagnosisoftuberculosis(TB).Methods:Thegenempt64wasamplifiedfromMycobacteriumtuberculosisstandardstrainH37RvgenomicDNAbypolymerasechainreaction,andwasclonedintopMD18-Tvector,positivecloneswasidentifiedbycolonyPCRandthesequencewasdeterminedbyDNAsequencing;Thegenempt64wassubclonedintotheprokaryoticexpressionvectorpET-28a(+),thepositiverecombinantbacteriawasidentifiedbycolonyPCRanddoublerestrictiveenzymedigestion.TherecombinantproteinMPT64wasabundantlyinducedtoexpressbyIPTG,andwaspurifiedbyaffinitychromatography.TheimmunologicalactivityofMPT64wasanalyzedbywestern-blot.TheconcentrationofMPT64wasdeterminedbyBradfordmethod.ThediagnosisefficiencyofrecombinantproteinMPT64fortuberculosiswasevaluatedbyELISA.Thegoldnanorods(AuNRs)weresynthesizedwithseed-mediatedmethod,afterchemicalmodificationwith11-mercaptoundecanoicacid(MUA),1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDC)andN-hydroxy-succinimide(NHS),theseAuNRswereconjugatedwiththerecombinantproteinMPT64todevelopAuNRsbiosensor,thenthediagnosticpotentialofthebiosensorforTBwasdetectedbyseroanalysis.Results:Thempt64genewasobtainedfromtheMycobacteriumIII tuberculosisstandardstrainH37Rv.Theamplifiedsequenceofmpt64genewas99%homologoustothesequenceofmpt64geneinGenBankdetectedbysequencing.ProkaryoticexpressionplasmidpET-28a(+)-mpt64wassuccessfullyconstructedasdeterminedbypolymerasechainreactionandenzymedigestionidentification.RecombinantproteinMPT64withmolecularweightas26kDawassuccessfullyexpressedwheninducedbyIPTG.TherecombinantproteinMPT64wasshownwithgoodimmunologicalactivitywhenanalyzedbyWestern-blot.Theoverallsensitivity,specificity,positiveandnegativepredictivevalues,anddiagnosticefficiencyofELISAwhichusingMPT64asantigenwere81.4%,94.9%,94.1%,83.6%and88.1%respectively.Afterchemicalmodification,thegoldnanorodsbiosensorbasedonMPT64antigenwassuccessfullyconstructed,andtheoverallsensitivity,specificity,positiveandnegativepredictivevalues,anddiagnosticefficiencyfortuberculosisdiagnosiswere91.5%,93.2%,93.1%,91.7%,and92.4%respectively.ComparedELISAwithgoldnanorodsbiosensorsfortuberculosisdiagnosisbychisquaretestanalysis,thedifferencebetweenELISAandgoldnanorodsbiosensorswasnotstatisticallysignificant(P=0.146>0.05).Conclusion:(1)RecombinantproteinMPT64wassuccessfullyexpressedinprokaryoticexpressionsystem.(2)RecombinantMPT64antigenwasshowntoowngoodimmunologicalactivities.(3)AuNRsbasedonMPT64antigenwasspecificandsensitiveforthediagnosisofTB.Keywords:Mycobacteriumtuberculosis;MPT64;goldnanorods;biosensor;diagnosisIV 目录摘要.............................................................................................................IABSTRACT.....................................................................................................III1引言.........................................................................................................12材料与方法.............................................................................................32.1菌株与血清....................................................................................32.2主要仪器.......................................................................................32.3.1试剂盒..................................................................................42.3.2其它试剂..............................................................................42.4主要溶液配制................................................................................42.5实验方法........................................................................................92.5.1结核分枝杆菌mpt64基因的扩增.......................................92.5.2克隆质粒pMD18-T-mpt64的构建...................................102.5.3重组克隆质粒与表达质粒的大量提取............................112.5.4重组表达质粒pET-28a（+）-mpt64的构建...................132.5.5重组蛋白MPT64的诱导表达..........................................132.5.6重组蛋白MPT64的纯化..................................................142.5.7重组蛋白MPT64的抗原性..............................................152.5.8Braford法测定重组MPT64浓度......................................152.5.9棋盘滴定法筛选最佳MPT64包被浓度与血清稀释度...162.5.10MPT64的ELISA诊断结核病.........................................162.5.11金纳米棒种子的制备.......................................................172.5.12金纳米棒的制备...............................................................172.5.13金纳米棒的化学修饰.......................................................182.5.14金纳米棒与MPT64的连接.............................................182.5.15金纳米棒生物传感器的血清学检测...............................192.5.16仪器参数..........................................................................193结果.....................................................................................................203.1结核分枝杆菌mpt64的扩增与克隆.........................................203.2重组表达质粒pET-28a（+）-mpt64的构建............................213.3重组蛋白MPT64的诱导表达...................................................22 3.4重组蛋白MPT64的纯化...........................................................223.5重组蛋白MPT64的抗原性.......................................................233.6Braford法测定重组蛋白MPT64浓度.......................................243.7棋盘滴定法确定最佳重组MPT64包被浓度与血清稀释度....243.8重组MPT64抗原ELISA诊断结核病......................................243.9金纳米棒的制备..........................................................................253.10金纳米棒的MPT64抗原连接..................................................263.11金纳米棒生物传感器的血清学检测........................................273.12重组蛋白MPT64的ELISA和金纳米棒生物传感器诊断结核病的比较.............................................................................................294讨论...................................................................................................30结论...........................................................................................................36参考文献...................................................................................................37文献综述................................................................................................42参考文献...................................................................................................47中英文缩略词对照表..............................................................................51在校期间发表的主要学术论文..............................................................53致谢...........................................................................................................54湖南师范大学学位论文原创性声明......................................................55 1引言结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,MTB）引起的慢性传染病，是继艾滋病毒/艾滋病之后，在全世界由单一传染性病原体引起的最大杀手。据WHO统计，2014年，全球有960万人罹患结核病，150万人死于该疾病，[1,2]而我国2014年新发肺结核人数为93万，高居全球第三位。结核病正严重威胁着人类健康，仍是严重的公共卫生问题之一。近年来，由于多药耐药(multidrugresistance,MDR)结核病的暴发流行及艾滋病毒(HIV)的双重感染等因素，MTB的感染率呈上升趋势，结核病问题已变得[3]更复杂化。在结核病的预防和临床诊断治疗领域，急需简便、快速、廉价且可靠的诊断方法，但迄今为止临床上仍没有一种灵敏、特异、快速、易普及的结核病诊断方法。传统的痰涂片和痰培养抗酸杆菌检测仍是许多国家诊断结核病的首选方法，但其操作繁琐，且灵敏度和特异性均不高，需多次检测，耗费大量人力。PCR、核酸分子杂交、BACTEC培养系统以及酶联免疫斑点技术诊断TB的灵敏度和特异性高，但其试剂和设备相对较贵，对操作人员的技术要求也较高[4-6]。血清学诊断技术因其快速、结果稳定且可肉眼判断、操作简单、易于临床推广、无需昂贵仪器等优势，日益成为研究的热点；该诊断技术关键是获得高纯度[7,8][9-11]的特异性抗原。临床上诊断结核病特异性抗原主要有三类：第一类为基因重组的抗原，如：16kD蛋白、38kD蛋白、MPT64、CFP10、MTB84、MTB81、HspX和ESAT-6等；第二类为常用的结核菌素衍生物（purifiedproteinderivative,PPD）；第三类为从结核分枝杆菌中直接提取的菌体成分如糖脂类抗原、菌壁抗原等。MPT64是结核分枝杆菌的特异性分泌蛋白，是早期培养滤液的主要成分之一，由基因组RD2区的Rv1980c基因编码，开放式阅读框(ORF)为687bp。MPT64主要诱导机体产生特异性细胞毒性T细胞(CTL)和分泌IFN-γ(干扰素)，同时也能[12-15]诱导体液免疫应答。天然以及重组的MPT64均可以诱导结核病患者产生T细胞反应和迟发性变态反应(delaytypehyperensitivity,DTH)，然而卡介苗（BacillursCalmette-Gurérin,BCG）接种者以及非结核分枝杆菌（如鸟分枝菌)1 [16,17]感染者对MPT64皮肤试验不反应；研究表明，MPT64在鉴别诊断结核感染者、BCG接种者以及非结核分枝杆菌致病菌群感染者，特异性比PPD强，有望[18][19]成为PPD皮肤诊断试剂的替代品。Purohit等比较重组MPT64与PPD作为结核病血清学诊断抗原的价值，发现重组MPT64特异性与PPD相当，而敏感性低于PPD，但重组MPT64成分单一、稳定好且易建立标准化诊断体系，成为结核病血清学诊断的组合抗原研究热点。纳米金生物传感器是近年兴起的一种生物传感器，能实时、在线监测抗原-抗体相互作用，是疾病免疫学诊断中灵敏、特异的新技术。金纳米棒表面经修饰、固定特定的分子（如抗原），当与之作用的溶液中有能和它相互作用的物质（如抗体）时，它们之间发生的吸附作用将会导致其表面的折射率发生改变，从而引起共振角或共振波长发生变化。基于金纳米棒的这种局域表面等离子体共振技术（Localizedsurfaceplasmonresonance,LSPR），可以定性或定量测定溶液中与固定相相互作用的物质。纳米金LSPR技术已应用于肿瘤治疗、基因/药物运输、[20-24][25]以及诊断检测等领域研究，并取得了可喜结果。Kah等证明纳米金表面等[26]离子体共振（SPR）技术可以对普通癌症进行早期诊断。LawWC等证明纳米[27]金作为SPR传感器的放大标签，能将灵敏度提高25～100倍。陈萌梦等通过巯基修饰Au膜并固定抗体，建立一种快速检测尿微量白蛋白(MAU)的SPR生物传感器，检测限低至0.03μg/L，显著放大检测阈值。本文构建结核分枝杆菌MPT64的原核表达质粒pET-28a(+)-mpt64，表达并纯化重组MPT64，建立基于MPT64抗原的金纳米棒生物传感器，分析其诊断结核病的能力，为结核病的血清学诊断提供新的实验依据和技术支持。2 2材料与方法2.1菌株与血清大肠杆菌DH5α、BL21和原核表达质粒pET-28a(+)由湖南师范大学医学院分子生物学研究室保存；结核分枝杆菌标准株H37Rv由湖南省胸科医院检验科提供。59份肺结核患者血清收集于湖南省胸科医院检验科，为抗酸染色涂片镜检和结核抗体IgG检测均为阳性的患者血清；59份其他肺部疾病患者血清与59份体检无异常的健康者血清收集于湖南省人民医院检验科。2.2主要仪器热循环仪美国Thermo公司YXQ-LS-50SI型高压蒸汽灭菌锅上海博讯实业有限公司生物安全柜通鑫企业有限公司无菌操作台苏州安泰空气技术有限公司JY92-II型超声波细胞破碎仪宁波新芝生物科技股份有限公司微量可调加样器德国Eppendorf公司5804(R)型高速离心机德国Eppendorf公司电子分析天平德国METTLERTOLEDO公司凝胶成像仪美国UVP公司PYX-150S-A型恒温培养箱杭州科力仪器仪表有限公司HZQ-2型恒温摇床金坛市医疗仪器厂恒温水浴箱上海医疗器械七厂电泳仪北京六一仪器厂多功能酶标仪美国BioTek公司UV1750型紫外可见光光度计苏州岛津仪器有限公司公司3 JBZ-14型磁力搅拌器上海大普仪器有限公司BCD-217YH型海尔冰箱青岛海尔股份有限公司ZLSC-10型电热重蒸器上海申安医疗器械厂2.3试剂2.3.1试剂盒DAB显色试剂盒北京鼎国生物技术有限公司DNA胶回收纯化试剂盒大连宝生物工程公司2.3.2其它试剂硝酸纤维素膜（NC）购自美国Bio-rad公司；胰化蛋白胨(Tryptone)、酵母抽提物(Yeastextract)购自英国OXIOD公司；GeneFinder™核酸荧光染料购自厦门致善生物科技有限公司；Tween-20和十一巯基十一烷酸（MUA）购自美国Sigma公司；辣根过氧化酶（HRP）标记羊抗人IgG购自美国Thermo公司；His-BindingResin购自美国Novogen公司；硼氢化钠(NaBH4)、抗坏血酸、硝酸银（AgNO3）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）购自国药集团化学试剂有限公司；N-羟基琥珀酸酰亚胺（NHS）和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）购自上海晶纯试剂有限公司；3,3",5,5"-四甲基联苯胺（TMB）色原底物A、B溶液与终止液购自北京万泰生物药业股份有限公司；pMD18-T载体、DNAMarker（DL2000）、dNTP、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶BamHI与HindIII等购自大连宝生物工程公司；预染色标准分子量蛋白、氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）等购自北京鼎国生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯。2.4主要溶液配制（1）LB液体培养基胰化蛋白胨(Tryptone)5g酵母抽提物(Yeastextract)2.5g氯化钠(NaCl)5g4 滴加5.0mol/LNaOH调节pH至7.0，加双蒸水溶解并定容至500mL，高压蒸汽灭菌，4℃密封贮存。（2）100mg/mL氨苄青霉素（Amp）称取1g氨苄青霉素钠粉末溶解于10mL双蒸水中，0.22µm过滤器过滤除菌，并分装至1.5mL离心管，于-20℃贮存。（3）50mg/mL卡那霉素（Kan）称取0.5g卡那霉素溶解于10mL双蒸水中，0.22µm过滤器过滤除菌，并分装至1.5mL离心管，于-20℃贮存。（4）Amp/LB、Kan/LB琼脂糖平板LB液体培养基100mL琼脂粉2.2g高压蒸汽灭菌，待培养基冷却至约60℃时，向100mL培养基加入100μL的100mg/mLAmp或50mg/mLKan，充分混匀，快速倾倒平板，4℃贮存。（5）10×磷酸盐缓冲液（10×PBS，pH7.4)KH2PO42.5gNaCl81.8gKCl2.0gNa2HPO4•12H2O36.2g加双蒸水溶解并定容至1000mL，搅拌充分溶解，即为10×贮存液；使用时按10倍稀释成0.01mol/L的PBS工作液。（6）0.5mol/LEDTA（pH8.0）称取43.05g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na•2H2O）于400mL双蒸水中，边搅拌边滴加5.0mol/LNaOH调节pH至8.0，充分溶解后并定容至500mL，高压蒸汽灭菌，于室温贮存。（7）50×TAE缓冲液Tris24.2g冰醋酸5.71mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）10mL加双蒸水溶解并定容至100mL，即为50×贮存液，用双蒸水稀释至1×即为5 工作液。（8）10%（W/V）SDS称取10g十二烷基磺酸钠（SDS），加双蒸水充分溶解，并定容至100mL。（9）0.1mol/LCaCl2称取1.1g无水CaCl2，加双蒸水溶解并定容至100mL；高压蒸汽灭菌，4℃密封贮存。（10）Tris-HCl缓冲液①1mol/LTris-HCl（pH8.0）称取24.26gTris溶解于180mL双蒸水中，盐酸调节pH至8.0，补加双蒸水至200mL。②1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）称取36.39gTris溶解于180mL双蒸水中，盐酸调节pH至8.8，用双蒸水定容至200mL。③1.0mol/LTris·HCl（pH=6.8）称取24.26gTris碱溶于180mL去离子水中，盐酸调节pH至6.8，补加双蒸水至200mL。（11）溶液Ⅰ量取12.5mL1mol/LpH8.0的Tris-HCl、10mL0.5mol/LpH8.0的EDTA；称取葡萄糖4.730g，加双蒸水溶解并定容至500mL，高压蒸汽灭菌，于4℃贮存。（12）溶液Ⅱ（现配现用）量取1mL2mol/LNaOH、1mL10%（W/V）SDS，补加双蒸水至10mL。（13）溶液Ⅲ量取300mL5mol/L醋酸钾、57.5mL冰醋酸，补加双蒸水至500mL，高压蒸汽灭菌，于4℃贮存。（14）TE溶液量取5mL1mol/LpH8.0的Tris-HCl和1mL0.5mol/LpH8.0的EDTA，加入约400mL双蒸水混合均匀，将溶液定容到500mL后，高温高压蒸汽灭菌，室温贮存。6 （15）30%丙烯酰胺称取29g丙烯酰胺和1g甲叉双丙烯酰胺，溶解于80mL双蒸水中，补加双蒸水至100mL，滤纸过滤除杂质。（16）4×SDS-PAGE上样缓冲液Tris-HCl(1mol/L，pH6.8)2mLSDS0.8g溴酚蓝40mg甘油4mL加双蒸水充分溶解并定容至10mL，按1mL/份分装于室温贮存，使用前每份加入40uL的β-巯基乙醇。（17）5×Tris-Gly电泳缓冲液称取15.1gTris、94g甘氨酸和5.0gSDS，溶解于800ml双蒸水中，定容至1L，即为5×贮存液；用双蒸水稀释至1倍即为工作液。（18）裂解液缓冲液（pH7.4）称取1.21gTris和1.46gNaCl，溶解于400mL双蒸水中，加入5mL0.5mol/LpH8.0的EDTA，盐酸调pH至7.4，补加双蒸水至500mL。（19）考马斯亮蓝R-250染色液称取0.5g考马斯亮蓝R-250，加入90mL甲醇、20mL冰乙酸不断搅拌彻底溶解，再补加90mL双蒸水混匀后，贮存于棕色瓶中，室温贮存。（20）脱色液冰醋酸70mL甲醇100mL加双蒸水至1000mL，于室温贮存。（21）电转移缓冲液称取5.8gTris、2.9g甘氨酸和0.37gSDS，溶解600mL双蒸水中，加入200mL甲醇后，定容到1L，室温贮存。（22）PBST向500mLPBS工作液中，加入0.25mLTween-20（V/V=0.05%），混匀于室温贮存。7 （23）5%（W/V）脱脂奶粉封闭液（现配现用）脱脂奶粉0.5gPBST10mL充分溶解。（24）0.1mol/LNa2CO3/NaHCO3包被液(pH9.6)Na2CO30.15gNaHCO30.29g加入约80mL双蒸水充分溶解，将溶液定容到100mL后，于-4℃贮存。（25）考马斯亮蓝G-250染料：称取0.1g考马斯亮蓝G-250，加入50mL95%乙醇、100mL85%浓磷酸充分溶解，补加双蒸水至1000mL，即为工作液。（26）标准蛋白液：牛血清白蛋白BSA（0.1mg/mL）称取牛血清白蛋白0.02g，用双蒸水溶解并稀释至20mL，分装后置-20℃贮存。（27）1%（W/V）AuCl3AuCl31.0g加入80mL双蒸水并超声助溶，定容至100mL，4℃贮存。（28）0.01mol/L硼氢化钠溶液（现配现用）NaBH40.0038g用10mL双蒸水溶解。（29）0.01mol/L硝酸银溶液AgNO30.170g加入双蒸水充分溶解并定容至100mL，保存于棕色瓶，置室温贮存。（30）0.1mol/LCTAB称取10.934gCTAB，置于240mL双蒸水中，不断搅拌充分溶解，补加双蒸水至300mL，于室温贮存。（31）0.1mol/L抗坏血酸（现配现用）抗坏血酸0.1761g用10mL双蒸水溶解。8 （32）5mmol/LMUAMUA0.0546g50mL无水乙醇溶解，4℃密封贮存。（33）王水小心量取100mL浓硝酸缓慢倒入300mL浓盐酸中，静置过夜，于室温贮存。2.5实验方法2.5.1结核分枝杆菌mpt64基因的扩增（1）引物的设计与合成登录美国国家生物技术信息中心的GenBank数据库，查找结核分枝杆菌标准株H37Rv的mpt64基因序列，GeneID：885925。根据mpt64基因序列，使用oligo6.0软件设计引物：上游：5‘-GGATCCGTGCGCATCAAGATCTTC-3’（划线为BamHI位点），下游：5‘-AAGCTTCTAGGCCAGCATCGAGT-3’（划线为HindIII位点），设计的引物由上海铂尚生物科技公司合成。（2）结核分枝杆菌基因组DNA的提取1）用接种环刮取改良罗氏培养基培养三周的结核分枝杆菌标准株H37Rv菌体，悬于TE缓冲液中；8000r/min离心5min，收集菌体，重悬于TE缓冲液，100℃煮沸15min，灭活菌体。2）向TE缓冲液中分别加入终浓度为：5μg/μL溶菌酶、2μg/μL蛋白酶K和1%（W/V）SDS，充分混匀裂解过夜。3）用酚：氯仿：异戊醇(V/V=25：24：1)抽提三次，10000r/min离心5min，轻轻吸取上清液，加入无水乙醇沉淀，用预冷的70%乙醇洗涤，离心后溶解于25μL灭菌双蒸水，-20℃冻存备用。（3）结核分枝杆菌mpt64基因的扩增以H37Rv基因组DNA为模板，PCR扩增mpt64基因。扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s；反应32个循环，72℃延伸5min。（4）PCR产物琼脂糖凝胶电泳9 制备1%琼脂糖凝胶，取3μLPCR产物与GeneFinder™荧光染料混匀上样，加入1×TAE缓冲液以5V/cm电压电泳，当溴酚蓝电泳至凝胶底部1cm处，结束电泳，在紫外透射仪下观察电泳结果。（5）结核分枝杆菌mpt64基因的纯化1）制备1.0%琼脂糖凝胶，使用新配制的1×TAE缓冲液对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。2)在紫外透射仪上切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶。3)吸干凝胶表面液体并称重，以1mg=1μL计算凝胶体积，放入1.5mL离心管中，加入3个凝胶体积量的凝胶融化液BufferGM。4）37℃水浴10min以融化凝胶释放DNA，期间每2-3min取出震荡混匀至胶块完全融化。5）将试剂盒中的SpinColumn安置于收集管上。6）将1.5mL离心管中溶解的凝胶液转移至SpinColumn中，若体积超过700μL，需进行两次转移。7）室温12000r/min离心1min，弃收集管中液体。8）向SpinColumn加入700μLBufferWB，室温12000r/min离心1min。9）弃收集管中的液体后，加入500μL的WashBuffer，室温12000r/min离心1min。10）重复操作步骤9。11）弃收集管中的液体后，将SpinColumn安置于收集管上，室温12000r/min离心1min。12）将SpinColumn安置于另一洁净的1.5mL的离心管上，于SpinColumn膜的中央加入30μL-50μL的60℃预热的灭菌双蒸水，室温静置1min。13）室温12000r/min离心1min洗脱DNA，于-20℃保存备用。2.5.2克隆质粒pMD18-T-mpt64的构建（1）大肠杆菌感受态细胞的制备1）将大肠杆菌DH5α甘油保种菌从-80℃冰箱中拿出置于冰上，用吸头吸取10 少量菌液，涂布无抗生素的LB琼脂糖平板上，置37℃恒温培养箱中倒置培养过夜，同时设置空白平板对照。2）确定平板无污染并挑取1-2个单菌落，于5mL无抗性培养基中，37℃培养震荡培养至OD600约为0.2-0.4。3）将培养液置于冰浴处理10min，4℃6000r/min离心10min。4）弃上清，加入2mL预冷的0.1mol/L的氯化钙溶液，轻轻重悬菌体，冰浴30min，4℃，3500r/min离心15min。5）弃上清，加入600-800μL预冷的0.1mol/L的氯化钙溶液，温和地重悬菌体。6）按每管200μL分装感受态细胞至1.5mL无菌离心管中，4℃放置过夜，于1-2天内短期使用。（2）pMD18-T-mpt64克隆质粒的构建1)取3.5μL纯化的mpt64基因片段与1.5μLpMD18-T载体，加至5μL含T4DNA连接酶的SolutionⅠ缓冲液中混匀，16℃连接过夜。2）将连接产物加入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴作用30min，42℃热休克90s，快速置于冰浴静置2min，加入800μL无抗性液体LB培养基，37℃低速震荡培养1h。3）6000r/min离心5min，弃上清保留约100μL培养基充分重悬菌体，涂布于含100μg/mLAmp的LB琼脂糖平板，待液体吸干后倒置平板，37℃培养过夜。4）挑取单个菌落，以同上PCR条件进行菌落PCR以及琼脂糖凝胶电泳，筛出阳性菌落。5）将阳性菌落接种于含100μg/mL氨苄青霉素LB培养基中培养。6）取培养的菌液进行DNA测序，对获得的DNA序列与GenBank数据库中H37Rv的mpt64基因序列进行比对分析。2.5.3重组克隆质粒与表达质粒的大量提取（1）将阳性克隆菌株接种至200mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中扩大培养，37℃震荡培养过夜。另将含pET-28a（+）大肠杆菌DH5α菌株接11 种至200mL含50μg/mLKan的LB培养基中扩大培养，37℃震荡培养过夜。（2）6000r/min离心5min，弃上清，收集菌体。（3）先后加入4mL溶液Ⅰ充分重悬菌体，8mL溶液Ⅱ轻轻颠倒混匀，6mL溶液Ⅲ充分混匀，冰浴10min。（4）4℃12000r/min离心10min，转移上清至另一洁净的离心管中，加入异丙醇（0.6倍上清体积量）充分混匀，室温静置5min。（5）室温12000r/min离心10min，弃上清，加入2mL预冷的70%乙醇洗涤沉淀，4℃12000r/min离心5min，弃上清。（6）先后加入1.2mLTE溶液充分溶解沉淀，1.2mL预冷的5mol/L氯化锂充分混匀，冰浴5min。（7）4℃12000r/min离心5min，转移上清至另一洁净的离心管中，加入异丙醇（1倍上清体积量）充分混匀，室温12000r/min离心10min，弃上清，加入1mL预冷的70%乙醇洗涤沉淀。（8）4℃12000r/min离心5min，收集上清，加入200μLTE溶液充分溶解沉淀，并转移至另一洁净的洁净离心管中，加入2μLRNA酶充分混匀，室温静置30min。（9）加入200μL含13%（W/V）PEG-8000的1.6mol/L氯化钠溶液充分混匀，4℃12000r/min离心5min，弃上清。（10）加入160μLTE溶液充分溶解沉淀，160μL酚/氯仿(V/V=1:1)充分混匀，12000r/min离心2min。（11）小心移取上层水相至另一洁净离心管中，先后加入1/4体积的5mol/L醋酸铵，2倍体积的无水乙醇充分混匀，室温静置10min。（12）室温12000r/min离心5min，弃上清，加入450μL预冷的70%乙醇洗涤沉淀。（13）室温12000r/min离心5min，弃上清，敞开离心管口，待乙醇挥发干净，加入20-200μL灭菌双蒸水充分溶解质粒，于-20℃储存备用。12 2.5.4重组表达质粒pET-28a（+）-mpt64的构建（1）用BamHI、HindIII限制性内切酶切质粒pET-28a（+）和重组质粒pMD18-T-mpt64，37℃酶切过夜。（2）制备1.0%琼脂糖凝胶，使用新配制的TAE缓冲液对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。（3）胶回收试剂盒回收、纯化酶切后的目的基因片段和质粒片段，操作步骤同上。（4）制备大肠杆菌BL21感受态细胞，操作步骤同上。（5）取6μL纯化的mpt64基因片段与2μLpET-28a(+)质粒片段，与1μL的T4DNA连接酶、10×Buffer混匀，16℃连接过夜。（6）将连接产物加至大肠杆菌BL21感受态细胞中，42℃热休克90s，快速置于冰上2min，加入800μL无抗性LB液体培养基，37度低速震荡培养1h。（7）6000r/min离心5min，弃上清保留约100μL培养基重悬菌体，涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂糖平板，待液体吸干后倒置平板，37℃培养过夜。（8）用接种环挑取单个菌落，以同上PCR条件进行菌落PCR以及琼脂糖凝胶电泳，筛出阳性菌落。（9）将阳性菌落接种至200mL含50μg/mL卡那霉素LB培养基中，扩大培养。（10）按上述步骤提取重组质粒，用限制性内切酶BamHI和HindIII进行酶切，并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒。2.5.5重组蛋白MPT64的诱导表达（1）重组蛋白MPT64的诱导表达1）用接种环挑取阳性重组菌于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。2）取过夜培养基按1:100比例，转至含卡那霉素的LB液体培养基中，继续培养至OD600约0.6。3）加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.5mmol/L，继续培养5h，13 同时设置未诱导的重组菌作对照。4）于2、3、4、5h时间点，取诱导的重组菌液1mL，室温6000r/min离心5min，收集菌体沉淀。5）加入90μL双蒸水和30μL4×SDS-PAGE上样缓冲液，充分重悬菌体，沸水浴10min，12000r/min离心10min。6）制备12%的SDS-PAGE分离胶与浓缩胶，取15μL上清上样。7）26mA电流恒流，当溴酚蓝指示剂电泳至分离胶底部时，停止电泳。8）卸下胶板，剥离分离胶胶放入染色液中，室温染色15-30min；加入脱色液，置于脱色摇床上，每30min更换一次脱色液，至分离胶完全脱净。2.5.6重组蛋白MPT64的纯化（1）用接种环挑取阳性重组菌，接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。(2)取过夜培养基按1:100比例，转至1L含卡那霉素的LB液体培养基中，继续培养至OD600约0.6。（3）添加IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续培养3h，室温6000r/min离心5min收集菌体沉淀。（4）加入裂解液重悬菌体沉淀，反复冻融三次，冰水浴超声充分裂解细胞（超声条件：功率200W，超声时间2s，间隔时间4s，持续15-20min），4℃12000r/min离心20min，收集上清和沉淀。™2+（5）放空His-bind（Ni-NTA）亲和层析柱的20%乙醇保存液，先用5个柱体积的裂解液平衡亲和层析柱；取5个柱体积的上清液过柱，用5个柱体积50mmol/L咪唑进行洗涤杂蛋白，用300mmol/L咪唑洗脱重组蛋白；部分收集。（6）收集重组蛋白洗脱液，12%的SDS-PAGE检测纯化产物。（7）纯化后的重组蛋白放入6kDa截留分子量的透析袋中，置于4℃，用PBS透析48h，期间换液6次；透析结束后用PEG-6000粉末进行吸水浓缩，浓缩的纯化蛋白于-20℃冻存备用。14 2.5.7重组蛋白MPT64的抗原性（1）电转移：将纯化的重组蛋白进行12%SDS-PAGE，电泳结束后，剥取分离胶，与硝酸纤维素(NC)膜紧贴，放入电转移槽内，120mA恒流2h，将蛋白转移至NC膜上。（2）用新配的5%脱脂奶粉封闭NC膜，置于4℃过夜。（3）TBST漂洗NC膜3次，加入1:100稀释的20例结核病患者混合血清，另设健康者血清对照组，37℃孵育2h。（4）TBST漂洗NC膜6次，加入辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG(以TBST作1:3000稀释)，37℃孵育2h。（5）TBST漂洗NC膜6次，置于室温微晾干，加入DAB试剂并显色10min，蒸馏水终止反应。2.5.8Braford法测定重组MPT64浓度（1）标准曲线的制备1、取14支洁净试管，按表2-1进行编号，同时设一平行对照组。2、制备标准蛋白液：0.1mg/mL牛血清白蛋白BSA。3、按表2-1加入试剂并混匀，室温静置3min；以空白管调零，读取595nm吸光度值；以吸光度值为纵坐标，以标准蛋白液浓度（μg/mL）为横坐标作图得出标准曲线。表2-1Braford法——蛋白质浓度标准曲线的制备管号试剂1（空白）234567标准蛋白溶液/mL—0.10.20.30.40.60.8双蒸水/mL1.00.90.80.70.60.40.2考马斯亮蓝染液/mL4.04.04.04.04.04.04.0蛋白质浓度（μg/mL）0102030406080（2）重组蛋白浓度测定另取一支洁净试管（同时设一平行组），加入考马斯亮蓝染液4.0mL和样品液0.1mL以及0.9mL双蒸水混匀，室温静置3min，读取595nm吸光度值；以平行管的平均吸光度值作为实验数据，查标准曲线计算重组蛋白浓度。15 2.5.9棋盘滴定法筛选最佳MPT64包被浓度与血清稀释度（1）包被：以0.1mol/LNa2CO3/NaHCO3(pH9.6)包被液稀释MPT64抗原，调整抗原浓度分别为4μg/100μL、2μg/100μL、1μg/100μL、0.5μg/100μL、0.25μg/100μL，微孔板每孔加入100μL抗原稀释液，4℃孵育过夜；设置包被液空白对照组，每组设置一平行复孔。（2）封闭：弃包被液，加入100μL5%脱脂奶粉封闭液，置37℃封闭2h。（3）孵育一抗：弃封闭液，以PBST洗板3次每次5min；分别取20份结核患者混合血清和体检无异常的健康者血清为一抗，用PBST分别作1:25、1:50、1:100、1:200倍稀释，加入至不同抗原浓度包被孔，每孔100μL，置37℃孵育2h。（4）孵育二抗：弃血清稀释液，PBST洗板6次，每次10min拍干，以PBST作1:3000稀释的HRP-羊抗人IgG，每孔加入100μL二抗稀释液，置37℃孵育2h。（5）显色：弃二抗稀释液，PBST洗板6次，每次10min拍干，每孔先后加入TMB显色液A液和B液各1滴，显色10min，加终止液终止。（6）数据处理：酶标仪读取每孔OD450，以平行复孔OD450平均值为实验数据；计算结核病患者混合血清OD450/正常人混合血清OD450（P/N）值，结合P/N≥2.0基础上，取P/N比值最大值的MPT64抗原包被浓度及血清稀释度作为ELISA条件。2.5.10MPT64的ELISA诊断结核病（1）包被抗原：按上述最佳MPT64包被浓度，每孔加入100μLMPT64稀释液包被微孔板，4℃孵育过夜。（2）封闭：弃包被液，加入100μL5%脱脂奶粉封闭液，置37℃封闭2h。（3）孵育一抗：弃封闭液，PBST洗板3次，每次5min；按照最佳血清稀释浓度稀释待测结核病患者血清、其他肺部疾病患者血清与健康者血清；每孔加入100μL血清稀释液，同时设置一平行复孔，37℃孵育2h。（4）孵育二抗：弃血清稀释液，PBST洗板6次，每次10min拍干；以PBST16 作1:3000稀释的HRP-羊抗人IgG，每孔加入100μL二抗稀释液，37℃孵育2h。（5）显色：弃二抗稀释液，PBST洗板6次，每次10min，拍干，每孔先后加入TMB显色液A液和B液各1滴，显色10min，加终止液终止。（6）数据处理：酶标仪读取每孔OD450值，以平行复孔平均值作为实验数据；以正常人血清OD450均值加2倍标准差，为阳性判断标准，当待测血清OD450大于该值判定为阳性。2.5.11金纳米棒种子的制备（1）取一个洁净的50mL小烧杯，加入5mL0.1mol/LCTAB溶液，置于磁力搅拌器上不断搅拌。（2）搅拌同时加入0.75mL0.12mol/L预冷的1%AuCl3溶液，继续搅拌4-5min，观察溶液颜色变化。（3）加入2.5mL双蒸水，继续搅拌。（4）缓慢滴加预冷的0.01mol/LNaBH4溶液，边滴加边观察溶液颜色变化：当溶液由黄色变成浅棕色时滴定终止，继续搅拌2-3min，于25℃静置4h，即为金纳米棒种子溶液。2.5.12金纳米棒的制备（1）取一个洁净的50mL小烧杯，加入15mL0.1mol/LCTAB溶液，置于磁力搅拌器上不断搅拌。（2）加入0.4mL0.01mol/LAgNO3溶液，继续搅拌4-5min。（3）加入1.5mL预冷的1%AuCl3，继续搅拌7-8min，可观察溶液由无色变成红棕色。（4）缓慢滴加0.1mol/L抗坏血酸溶液，直至溶液由红棕色刚褪至无色，滴定终止，继续搅拌4-5min即得金纳米棒成长溶液。（5）边搅拌边加入37μL金纳米棒种子溶液至成长液中，待溶液颜色稳定后，静置于25℃恒温培养箱中过夜，即得金纳米棒溶液。（6）采用紫外可见光光度计对金纳米棒溶液进行光谱扫描，并观察金纳米17 棒溶液的特征吸收峰：纵向等离子体吸收峰（LongitudinalPlasmonPeak,LPP）和横向等离子体吸收峰（TransversePlasmonPeak,TPP）的波长，并记录为LPW和TPW。2.5.13金纳米棒的化学修饰（1）取5mL金纳米棒溶液于10mL洁净玻璃小瓶中，加入1mL5mmol/LMUA溶液混匀，27℃静置过夜。（2）用紫外可见光光度计进行光谱扫描MUA修饰后的金纳米棒溶液，记录金纳米棒溶液的LPW和TPW。（3）用1.5mL离心管分装MUA修饰的金纳米棒溶液，27℃8000r/min离心15min，小心弃去上清。（4）用5mL0.01mol/LCTAB溶液轻轻重悬金纳米棒沉淀，并转移至另一洁净玻璃小瓶中，此时金纳米棒溶液可放置4℃备用。（5）向MUA修饰后的金纳米棒溶液，先后加入EDC和NHS分别至终浓度75mmol/L、15mmol/L，充分混匀，27℃恒温培养箱中静置40min。（6）27℃7000r/min离心15min，小心弃去上清，收集金纳米棒沉淀。（7）用0.01mol/LCTAB轻轻重悬金纳米棒沉淀，转移至另一洁净玻璃小瓶中。（8）采用紫外可见光光度计对修饰后金纳米棒溶液进行光谱扫描，观察并记录金纳米棒溶液的LPW和TPW。2.5.14金纳米棒与MPT64的连接（1）0.3mg/mL的MPT64抗原用双蒸水分别按1:1500、1:500、1:100的稀释度加至修饰后的金纳米棒溶液并轻轻混匀，即终浓度分别为0.2μg/mL、0.6μg/mL、3.0μg/mL，27℃恒温培养箱中静置2h。（2）采用紫外可见光光度计对加入抗原的金纳米棒溶液进行光谱扫描，观察并记录加入不同浓度的MPT64的金纳米棒溶液的LPW和TPW。18 2.5.15金纳米棒生物传感器的血清学检测（1）成功连接上MPT64抗原的金纳米棒溶液，即基于重组MPT64的金纳米棒生物传感器，按1.0mL每管分装至洁净的1.5mL离心管中待用。（2）用双蒸水100倍稀释待测血清。（3）往分装的1.0mL金纳米棒溶液加入10μL稀释的待测血清，轻轻混匀，427℃静置2min，此时待测血清终稀释度为10倍。（4）采用紫外可见光光度计对金纳米棒溶液进行光谱扫描，检测抗原抗体反应后金纳米棒溶液的LPW和TPW，记录数据。2.5.16仪器参数采用岛津UV1750紫外可见分光光度计，扫描可见近红外光谱（Vis-NIRspectroscopy）：待仪器稳定后，用双蒸水调基线并调零，设置光谱扫描范围1100-400nm，狭缝宽度为1nm，扫描速度为中速。19 3结果3.1结核分枝杆菌mpt64的扩增与克隆结核分枝杆菌mpt64PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱见图3-1。由图3-1可知：PCR扩增获得大小约700bp的基因片段，与预期mpt64基因687bp大小相符。将目的基因片段连接至克隆质粒pMD18-T，构建的重组克隆质粒经BamHI、HindIII双酶切后产物琼脂糖凝胶电泳图见图3-2，由图3-2可知：重组克隆质粒经限制性内切酶酶切后，获得的低分子量的基因条带与预期目的基因大小相符，提示重组克隆质粒pMD18-T-mpt64构建成功。图3-1结核分枝杆菌mpt64PCR扩增图谱图3-2克隆质粒pMD18-T-mpt64电泳图谱M．标准分子量DNA（DL2000）；M．标准分子量DNA（DL2000）；1.mpt64PCR产物1.重组质粒pMD18-T-mpt64；2.双酶切重组质粒pMD18-T-mpt64DNA测序获得mpt64基因序列，与GenBank中结核分枝杆菌标准株H37Rvmpt64的序列进行比对，结果见图3-3。由图3-3可知，在254bp处发生点突变，由A碱基突变成G碱基，编码的氨基酸苏氨酸突变成丙氨酸。其余序列与GenBank中的结核分枝杆菌mpt64基因一致。20 图3-3mpt64基因测序结果序列比对图3.2重组表达质粒pET-28a（+）-mpt64的构建重组表达质粒pET-28a（+）-mpt64经限制性内切酶BamHI、HindIII酶切后产物琼脂糖凝胶电泳图见图3-4。由图3-4可知：重组表达质粒经限制性内切酶酶切后，获得约700bp的DNA条带，与预期大小一致，提示重组表达质粒pET-28a（+）-mpt64构建成功。图3-4重组质粒pET-28a（+）-mpt64电泳图谱M.标准分子量DNA（DL2000）；1.重组质粒pET-28a（+）-mpt64；2.双酶切重组质粒pET-28a（+）-mpt6421 3.3重组蛋白MPT64的诱导表达重组MPT64的诱导表达的SDS-PAGE图谱见图3-5。由图3-5可知，诱导后的重组菌比未诱导的重组菌，约在26kDa处明显多了一条蛋白条带，为预期24kDa的天然MPT64与pET-28a（+）表达载体标签蛋白大小之和。0.5mmol/LIPTG诱导重组菌，在2、3、4、5h时间点分别取样并进行SDS-PAGE检测，结果发现诱导3h时重组MPT64表达量最高，结果见图3-4。重组菌诱导后经超声裂解离心后的产物进行电泳，结果发现重组MPT64蛋白主要在上清中，即该条件下重组MPT64主要以可溶形式表达。图3-5重组菌诱导表达电泳图谱M.标准分子量蛋白；1.未经诱导的重组菌；2-5：分别为诱导2、3、4、5h的重组菌；6-7：分别为超声破碎重组菌的沉淀和上清3.4重组蛋白MPT64的纯化诱导后的重组菌经超声裂解，上清经镍柱亲和层析纯化，纯化后的重组MPT64的SDS-PAGE电泳结果见图3-6。由图3-6可知：亲和层析获得了较高纯度的重组蛋白。22 图3-6纯化的重组蛋白电泳图谱M.标准分子量蛋白；1-2.分别为重组菌超声破碎后的沉淀和上清；3.纯化的重组蛋白3.5重组蛋白MPT64的抗原性纯化重组蛋白MPT64的免疫印迹结果见图3-7。由图3-7可知：纯化的重组蛋白MPT64能被结核病患者血清识别，而与健康者血清无交叉反应，提示纯化的重组蛋白MPT64具有良好的抗原性。图3-7重组蛋白免疫印迹图谱M.标准分子量蛋白；2.与结核患者血清反应；3.与健康者血清反应；23 3.6Braford法测定重组蛋白MPT64浓度Braford法测得标准蛋白质浓度吸光度值，应用SPSS19.0统计软件进行线性2回归分析，获得线性回归方程y=0.00133x-0.0032，线性相关系数R=0.994，计算得经10倍稀释的重组蛋白MPT64浓度为30μg/mL，即纯化后的重组蛋白MPT64浓度为0.3mg/mL。3.7棋盘滴定法确定最佳重组MPT64包被浓度与血清稀释度以结核病患者混合血清OD450与健康者混合血清OD450的比值（P/N）最大值，作为判定最佳的重组蛋白MPT64包被浓度和血清稀释度条件的标准。经计算，当重组蛋白MPT64包被浓度为2.0μg/100μL时，血清稀释比例为1:100时，P/N值达到最大为3.48。后续检测将以2.0μg/100μL的重组蛋白MPT64包被浓度，和1:100血清稀释度作为ELISA条件。表3-1不同包被浓度和血清稀释度测得OD450重组MPT64结核病患者血清健康者血清阴性1:251:501:1001:2001:251:501:1001:200对照4.0μg/100μl0.4740.4300.4370.2660.2710.1960.1690.1150.0852.0μg/100μl0.4010.4020.3900.3050.1630.1460.1120.1280.0731.0μg/100μl0.4260.4130.3750.3080.2400.1840.1400.1100.0520.5μg/100μl0.4100.3640.3630.2820.1640.1470.2030.1550.0510.25μg/100μl0.3220.2750.2080.1650.1990.1610.1500.1040.0463.8重组MPT64抗原ELISA诊断结核病以待测血清OD450>健康者血清OD450均值+2SD作为阳性结果判断标准。经ELISA检测：59份肺结核病患者血清测得阳性结果有48份，59份其他肺部疾病患者血清测得阳性结果有9份，59份健康者血清测得阳性结果有3份，检测结果见图3-8。重组MPT64抗原对结核病检出率为81.4%，对其他肺部疾病患者血清检出率为15.3%，对健康者血清的检出率为5.1%；即重组MPT64抗原ELISA诊断结核病的敏感度为81.4%，特异性为94.9%，阳性预测值为94.1%，阴性预测值为83.6%，诊断效率为88.1%。24 健康者血清其他肺部疾病患者血清结核病患者血清图3-8重组MPT64抗原的ELISA分析3.9金纳米棒的制备采用种子成长法制备金纳米棒中，溶液颜色随着时间而变化：无色淡红色深红色红紫色，静置于25℃恒温培养箱中过夜，即得金纳米棒溶液。紫外可见分光光度计对金纳米棒溶液进行光谱扫描，其Vis-NIR吸收光谱图见图3-9。由图3-9可知：金纳米棒a、b的横向等离子体吸收峰TPP分别为519、520nm；纵向等离子体吸收峰LPP分别为774、840nm。制备的金纳米棒a、b的TPP差异不大，而LPP差异很大。由于金纳米棒LLP吸收峰波长越大，其对应[28,29]的金纳米棒长径比（aspectratio,AR）越大，AR越大灵敏度越高，为达到更好的检测效果，后续金纳米棒生物传感器检测分析选用LPP为840nm的金纳米棒。25 图3-9金纳米棒的Vis-NIR吸收光谱图a：金纳米棒a；b：金纳米棒b3.10金纳米棒的MPT64抗原连接金纳米棒经MUA和EDC、NHS活化后，与MPT64抗原连接时，本文对抗原浓度进行了摸索，从100倍稀释到3000倍稀释抗原，与金纳米棒室温反应2h后，紫外分光光度计进行光谱扫描，记录金纳米棒的LPW变化值。金纳米棒与不同浓度MPT64抗原连接的Vis-NIR吸收光谱图见图3-10。由图3-10可知：0.2μg/mLMPT64连接的AuNRs，其LPW基本不变化（+2nm）；0.6μg/mLMPT64连接的AuNRs，其LPW发生了明显红移（+20nm）；继续增加抗原浓度3.0μg/mLMPT64连接的AuNRs其LPW发生蓝移（-4nm）。故在后续实验采用0.6μg/mL的MPT64抗原浓度与金纳米棒组装。26 图3-10金纳米棒与MPT64连接的Vis-NIR光谱图a：0.6μg/μLMPT64连接的AuNRs；b：3.0μg/μLMPT64连接的AuNRs；c：0.2μg/μLMPT64连接的AuNRs；d：未修饰的AuNRs3.11金纳米棒生物传感器的血清学检测连接MPT64抗原的金纳米棒（MPT64-AuNRs）与结核病患者血清、健康者血清反应的紫外可见吸收光谱图见图3-11。A为连接MPT64抗原的金纳米棒光谱图，其LPW为843nm；b为MPT64-AuNRs与结核病患者血清反应的光谱图，其LPW为865nm；c为MPT64-AuNRs与健康者血清作用的光谱图，其LPW为845nm。由图3-11可知：MPT64-AuNRs检测结核病患者血清时，其LPW红移了22nm；检测健康着血清时，其LPW基本不变（只红移了2nm）。这与抗原-抗体的特异性反应效果是一致的。27 图3-11MPT64-AuNRs与血清反应的紫外可见吸收光谱图a：MPT64-AuNRs；b：与结核病患者血清反应；c：与健康者血清反应采用MPT64-AuNRs金纳米棒生物传感器，对117份血清进行检测，结核病患者血清反应大部分发生了7-17nm红移，根据医学检验统计规律要求，认为大于等于4nm的红移为检出（阳性反应），本文按红移≥5nm判定为阳性。经计算结核病患者血清的检出率为91.5%，对其他肺部疾病患者血清检出率为13.6%，对健康者血清的检出率为6.8%；基于重组MPT64抗原的金纳米棒生物传感器法诊断结核病的敏感度为91.5%，特异性为93.2%，阳性预测值为93.1%，阴性预测值为91.7%，诊断效率为92.4%，MPT64-AuNRs血清学分析结果见图3-12。28 健康者血清其他肺部疾患者血清结核病患者血清图3-12MPT64-AuNRs的血清学分析3.12重组蛋白MPT64的ELISA和金纳米棒生物传感器诊断结核病的比较将重组蛋白MPT64的ELISA检测结核病患者血清结果与金纳米棒生物传感器检测结果进行统计分析，结果见表3-2。检测结果采用SPSS19.0统计软件进行配对的四格表卡方检验，计算得P=0.146>0.05，差异无统计学意义，即不认为这俩种方法的检测结果有差别，重组蛋白MPT64的金纳米棒生物传感器检测结核病效果与ELISA检测效果没有差异。2表4-1重组蛋白MPT64的ELISA和金纳米棒生物传感器检测结果的χ检验ELISA金纳米棒生物传感器合计阳性阴性阳性45348阴性9211合计5455929 4讨论随着全球结核病感染率和发病率持续升高，结核病的快速和鉴别诊断显得尤为重要，结核病诊断的延误不仅影响患者的健康而且增加了结核病传播的机会。目前结核病的诊断主要依靠痰涂片抗酸杆菌染色镜检、结核杆菌痰培养、结核菌素试验和影象学等相关技术进行检测。结核分枝杆菌细菌学诊断虽然是检测的金标准，但痰涂片抗酸染色镜检阳性率低，易出现假阳性；而结核杆菌培养周期长，易出现假阴性，因此急需一种灵敏度高、特应性强、快速的诊断方法，提高结核病患者的检出率。MPT64是结核分枝杆菌早期主要的分泌蛋白之一，由基因组RD2区的Rv1980c基因编码的228个氨基酸约24kDa大小。MPT64是结核分枝杆菌主要抗原之一，MPT64诊断结核病的特异性比PPD强，有望成为结核血清学诊断的组合抗原候选者。本实验从结核分枝杆菌标准株H37Rv中扩增mpt64，DNA测序发现其基因序列在254bp处发生点突变由A碱基突变成G碱基，导致表达的重组MPT64第84位氨基酸由苏氨酸突变成丙氨酸，其余序列与GenBank中的结核分枝杆菌标准株H37Rv的mpt64基因一致。已有研究表明，分泌蛋白MPT64的B细胞[30][31]抗原表位主要位于第124-143氨基酸残基区域。仇艳等研究mpt64基因突变对结核病检测结果的影响，发现63bp的缺失会造成检测的假阴性，其它单位点突变对检测结果无影响；本实验的蛋白免疫印迹结果表明，表达的重组蛋白具有良好的免疫原性，以上均支持本实验mpt64基因发生的254bp处点突变对表达的重组蛋白免疫活性无影响。本实验构建结核分枝杆菌重组蛋白MPT64原核表达质粒，选用的pET-28a（+）载体具有高表达、耗时短的优点，该载体标签蛋白带有六个组氨酸，便于结合镍离子亲和层析柱，简化了重组蛋白的纯化过程。pET-28a（+）载体标签蛋白约2kDa大小，对24kDa大小的MPT64抗原的空间结构以及免疫活性影响小。30 [32,33]重组蛋白的诱导表达量在一定时间范围内与诱导时间成正比，本实验选用大肠杆菌BL21宿主菌，37℃0.5mmol/LIPTG诱导重组蛋白表达，在第2、3、4、5h时间点检测重组蛋白的表达情况；蛋白电泳结果表明，重组菌在IPTG诱导2h之后，有明显的MPT64蛋白表达，且在第3h重组蛋白表达量最高。经37℃0.5mmol/LIPTG诱导3h后，诱导的重组菌经超声裂解，离心后取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，结果显示目的蛋白主要位于上清中，即以可溶性形式表达；可溶性的重组蛋白可以直接进行镍离子亲和层析柱纯化，避免蛋白复性等问题，简化了重组蛋白的纯化过程。本实验以纯化的重组蛋白MPT64为抗原，采用ELISA诊断结核病，其敏感度为81.4%，特异性为94.9%，诊断效率为88.1%。MPT64抗原在结核病诊断与[34]预防方面受到了国内外研究者的关注。Nakamura等采用MPT64抗原做皮肤划痕试验，以PPD阳性的健康者为对照，研究发现MPT64抗原检测结核病的敏感度和特异性分别为98.1%和100%，故MPT64被认为最有希望取代PPD成为结[35]核病皮肤诊断试剂。Mijung等以MPT64抗原建立双抗夹心ELISA，检测389例结核病患者血清，检测下限达到2.1ng/μL，其灵敏度和特异性均达到100%，无交叉反应。研究发现，MPT64抗原在痰涂片个体的血清学诊断，表现出同样[36][37]的灵敏度，可应用于结核病痰涂片阴性个体的血清学诊断；Sartain等通过蛋白质芯片筛选结核病血清特异性诊断标志物，发现MPT64抗原能够特异性诊[38]断空洞型肺结核；Tadele等研究发现MPT64抗原能够提高肺外结核的诊断率；Jyoti和Martin建立双抗夹心ELISA检测MPT64蛋白来鉴别结核杆菌MTB复合[39,40]群。对结核分枝杆菌复合群的抗原生物信息学研究，发现MPT64抗原表位[41]与其他抗原表位没有重叠处，表明MPT64抗原具有独特性。[42]YangH等使用噬菌体随机展示肽库筛选MPT64抗原的特异性多肽，其诊断结核灵敏度和诊断效率均明显高于MPT64，尤其在结核病痰涂片阴性个体诊断具有较高的诊断价值。QinLH和ZhuCT等筛选高亲和力的MPT64抗原核酸[35,43]适配体，用于结核病血清学诊断，均取得较好的诊断效果。这些成果为后续开发以MPT64抗原的血清学诊断试剂，以及MPT64抗原替代物如优势表位多肽等提供理论和技术基础。纳米颗粒（粒径0.1-100nm）是介于宏观物品与微观分子之间的物体，具有31 表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应等基本效应，产生特殊的光学、电学、磁学、力学的性质，备受研究者青睐。金纳米棒颗粒具有独特的光学性质，表现为两个不同的局域表面等离子共振（LSPR），在光谱上显现为俩个不同的峰位：沿着纳米棒短轴的横向表面等离子体共振（TSP）吸收峰和长轴方向的纵向表面等离子体共振（LSP）吸收峰；其中纵向等离子共振吸收峰（LPP）由金纳米棒的长径比决定，且LPP的波长随长径比增加而增加。金纳米棒的独特LSPR性质已成为众多研究领域里一种实用和直观的研究手段，在生物医学、癌症治疗、生物分子和重金属离子的检测、传感器等领域，都取得了可喜的成果，受到研究者关注青睐。在病原检测和医疗诊断等方面，金纳米棒生物传感器具有快速、特异性强、识别灵敏等优势，成为生物医学诊断中特异的新技术。目前合成金纳米棒的方法有多种：模板法、电化学法，种子生长法等；其中[44]种子生长法对设备要求低，制备过程简单，产率高可达到99%，为制备金纳米棒最常用的方法。种子生长法制备金纳米棒过程中，硝酸银中银离子有利于控制金纳米棒的长径比，提高金纳米棒的产率。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)是一种阳离子表面活性剂，吸附至纳米棒表面起到稳定剂和保护剂作用；CTAB易吸附到金纳米棒{1,1,0}和{1,0,0}面，而{1,1,1}面即纳米棒的头尾端吸附CTAB能力弱，容易暴露[45,46]常被修饰。制备金纳米棒过程中，CTAB的浓度很重要，过低浓度的CTAB难以制得金纳棒，而过高浓度CTAB则易形成金纳米球，降低金纳米棒的产率；在金纳米棒生物传感器的组装与检测中，高浓度的CTAB在高离子强度环境中，[47,48]易于蛋白质和多糖形成复合物沉淀，干扰蛋白质与金纳米棒的偶联。本实验在制备金纳米棒，以及金纳米棒生物传感器的组装和结核病的检测试验中，均使用低浓度0.01mol/L的CTAB溶液，此浓度对金纳米棒的稳定和保护效果较好。在金纳米棒的化学修饰中，EDC与NHS通过提供氨基酸酰胺反应条件，在金纳米棒偶联蛋白质过程中起着“桥梁”作用；为了保证MPT64抗原与金纳米棒的偶联效率，本文采用活化效果较好的终浓度为75mmol/LEDC、15mmol/LNHS[49]活化剂量，。MPT64抗原偶联金纳米棒时，本实验对MPT64偶联浓度进行了探索；当溶32 液中MPT64抗原浓度较低时，不足以修饰金纳米棒，偶联效率较低，金纳米棒纵向等离子吸收峰（LPP）仅发生微弱红移（+2nm）；增加MPT64抗原浓度，金纳米棒LPP发生明显红移（+20nm）；继续增加MPT64抗原浓度，金纳米棒LPP发生蓝移（-4nm）；不同浓度的MPT64抗原偶联金纳米棒LPP发生的变化，可能与金纳米棒形成头碰头或肩并肩等组装体的机制有关。由于CTAB易大量吸附于金纳米棒的两侧面，难吸附于金纳米棒首尾两端面，由于空间位阻效应，金纳米棒侧面吸附的大量CTAB分子妨碍其侧面的蛋白质等大分子修饰，而被[50-52]暴露的首尾俩端面易被蛋白质等大分子修饰。在抗原抗体特异性反应中，头尾俩端经抗原修饰的金纳米棒，容易使形成头碰头（End-to-End）组装体，在光谱图上表现为金纳米棒纵轴等离子吸收峰发生红移；当蛋白质等大分子对金纳米棒进行过量修饰，金纳米棒首尾俩端面被饱和修饰后，侧面开始被蛋白质修饰，在抗原抗体特异性反应中，头尾以及侧面被修饰的金纳米棒，形成肩并肩（Side-by-Side）以及少见的头并肩（End-to-Side）组装体，在光谱图上表现为金[53-55]纳米棒纵轴吸收峰发生蓝移。MPT64-AuRNs金纳米棒生物传感器与结核病患者血清反应时，大部分检测到7-17nm的明显红移，与抗原抗体特异性反应是一致的；而MPT64-AuRNs金纳米棒生物传感器与健康者血清和其他肺部疾病患者血清反应时，检测到2-4nm微弱红移，对比结核病患者血清检测结果，差异明显；金纳米棒生物传感器检测血清发生的微弱红移，可能与金纳米棒溶液与蛋白质发生物理性吸附，如范德华力，静电吸附作用等，引起非特异性吸附，导致金纳米棒纵向等离子吸收峰微弱红移。本文构建基于重组结核分枝杆菌蛋白MPT64的金纳米棒生物传感器，对177份血清进行检测，MPT64-AuNRs金纳米棒生物传感器对结核病诊断的敏感度和特异性分别为91.5%、93.2%，对结核病有较好的诊断价值；MPT64-AuNRs对健康者血清和其他肺部疾病患者血清也有一定的阳性反应，但经SPSS19.0统计软件分析，差异具有统计学意义。[56]金纳米棒生物传感器作为一种快速血清学诊断方法亦多见报道，何鑫等采用固相金纳米棒光学免疫传感器对日本血吸虫感染的兔血清检测，与兔血清间接血凝试验（IHA）检测对比，在感染早期第1周，IHA检测为阴性感染，而传33 感器检测已呈阳性结果，缩短了检测窗口期，为免疫传感器诊断方法用于寄生虫[57]病的早期诊断提供理论依据。李峰杰等利用晶种生长法合成不同长径比（AR）的金纳米棒，并偶联羊抗人IgG二抗，建立类似双抗体夹心ELISA的金纳米棒传感器检测方法，发现金纳米棒可使人IgG（1mg/L）与羊抗人IgG的反应信号增强20100倍，而金纳米棒AR为2时检测信号增强倍数最高，达到90100倍；金纳米棒对检测信号增强，能将灵敏度提高50倍，对人IgG的最低检出限由500ug/L降低到10ug/L。金纳米棒作为一种SPR生物传感器检测能显著提高检测的灵敏度与阈值。本文对重组抗原MPT64的ELISA和金纳米棒生物传感器诊断结核病结果，进行配对四格表卡方统计分析，得出倆种方法诊断结核病的能力没有统计学差[58]异。Watanabe等比较mpt64RT-PCR、痰涂片和培养法三种检测方法，对715[59]例痰样本进行检测，发现三种检测方法诊断结核病没有明显的差异。LiuZH等对比MPT64双抗夹心ELISA与PCR检测技术，双抗夹心ELISA和PCR灵敏度分别为97.3%（110/113）和98.2%（111/113），俩种方法诊断率没有明显差异。ELISA是一种常用的血清学诊断方法，已广泛应用于多领域，在结核病的诊断亦多见报道，而金纳米棒生物传感器作为新型的高灵敏、快速诊断方法在结核病诊断报道甚少。ELISA需要专业人员花费几个小时才完成检测，而金纳米棒生物传感器最显著的优点是能现场快速、连续检测多个样品，具有简便、快速的优势，易于做到小型化和自动化，便于临床推广使用。结核病血清学抗体检测中，抗体水平高低与结核杆菌负荷量正相关，其检测数值在理论上可以反应结核感染的程度；结核病患者治疗期间可以通过实时监测抗体水平数值的变化，可为结核病的治疗效果提供参考；在检测治疗效果同时，也为耐药性结核菌的检测提供可能，其理论依据为：经过抗结核药物治疗一段时间后，随着结核菌的减少抗体水平应该有所下降，未下降应该提示可能为结核病[60,61]耐药菌。金纳米棒生物传感器简便、快速检测能力，提供在线连续读取病人血清特异性分析物（如抗体）的方法，这些优势为结核病实时监测结核病治疗效果以及结核病耐药菌的快速监测提供了理论依据与技术。34 本文构建结核分枝杆菌MPT64的原核表达质粒pET-28a(+)-mpt64，在大肠杆菌BL21中表达重组MPT64；通过优化诱导条件，获得可溶性重组蛋白，避免包涵体复性等问题，简化了纯化过程，使获得的纯化的MPT64蛋白结构更接近于天然MPT64蛋白，保持纯化的重组蛋白的免疫活性；本文纯化的重组蛋白MPT64能被结核病患者血清识别，具有良好的抗原性。本文采用ELISA和基于局域表面等离子共振技术的金纳米棒生物传感器诊断方法，探讨重组MPT64抗原对结核病的诊断效果，俩者血清学诊断方法都具有较理想的诊断效果；对倆种方法诊断结核病结果进行统计学比较分析，诊断效果无统计学差异。血清学诊断技术因其结果快速、稳定，操作简单易于临床推广以及无需昂贵仪器等优势，尤其可对痰培养阴性个体以及肺外结核的诊断，具有极重要的检测价值；基于抗原（抗体）的金纳米棒生物传感器是一种高效特异的血清学诊断技术，能连续检测多个血清样品，具有简便、快速的优势，易于做到小型化和自动化，这些为结核病的简便、快速诊断提供实验基础和技术支持。35 结论（1）成功构建结核分枝杆菌MPT64的原核表达质粒pET-28a(+)-mpt64，表达并纯化重组蛋白MPT64。（2）重组蛋白MPT64具有良好的抗原性。（3）重组蛋白MPT64的金纳米棒生物传感器诊断结核病具有较高的灵敏度和特异性。36 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文献综述结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64在结核病检测与诊断中应用MPT64是结核分枝杆菌主要的分泌蛋白和保护性抗原之一，作为结核病快速、高效、特异、灵敏的血清学标志物，在结核病的预防与诊断研究中备受关注，本文就MPT64抗原在结核病的诊断与预防中应用作一篇综述。结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,MTB）引起的慢性传染病，可以导致多器官多系统的疾病，是继艾滋病毒（humanimmuno-deficiencyvirus，HIV）/艾滋病之后，对人类健康危害最大的单一传染性病原体。据WHO统计，2014年全球有960万人罹患结核病，150万人死于该疾病，而我国2014[1]年新发肺结核人数为93万，结核病疫情高居全球第三位，仍是目前严峻的公共卫生问题。一、mpt64基因信息与蛋白功能[2,3]Oettinger和Andersen首次克隆并测序结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的编码序列，MPT64由基因组RD2区的Rv1980c基因编码，228个氨基酸大小约为23kDa，理论等电点为4.8。mpt64基因保守存在于结核分枝杆菌菌株H37Rv、H37Ra、Erdman和牛分枝杆菌，以及卡介苗（BacillursCalmette-Gurérin,BCG）菌株如Tokyo、Moreau、Russian、Sweden等基因组中；而Danish1331、Glaxo、Paster、Tice、Canadian、Phipps、Connaught、Prague等大部分BCG菌株和环境[4]分枝杆菌（如鸟分枝杆菌）等缺乏该基因。MPT64是结核分枝杆菌主要分泌蛋白之一，其第1-23位氨基酸为信号肽序列MRIKIFMLVTAVVLLCCSGVATA。MPT64的二级结构中含有7个α螺旋、9个β折叠、18个β转角，蛋白表面大量的β-grasp基序有利于与抗体亲和形成空[5]间构象，构成较强免疫原性区域。MPT64具有超氧化物歧化酶活性，在结核肉芽肿组织中，MPT64抑制细胞产生TNF-α并刺激肉芽肿的形成，参与调控宿主[6]细胞凋亡过程。MPT64能诱导结核病患者外周血单核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）增殖，产生大量IFN-γ，激活巨噬细胞清除结核分枝[7]杆菌致病原。42 MPT64的184-228位氨基酸残基区域能引发T细胞反应，刺激结核病患者++产生CD4Th1和CD8细胞，在结核病保护性免疫中发挥重要作用；173-187位氨基酸残基区域刺激患者产生迟发性超敏反应（DTH），具有重要的细胞免疫功能；MPT64的124-143位氨基酸残基区域刺激机体产生体液免疫反应，为主要的B细胞抗原表位。已有研究表明，天然和重组的MPT64蛋白均能引发特异性[8-10]T细胞反应和体液免疫反应。二、MPT64抗原诊断结核病分泌蛋白MPT64是结核分枝杆菌主要抗原之一，mpt64基因在大部分BCG和环境分枝杆菌基因组中缺失，已有研究将MPT64作为单一成分的结核病皮肤诊断试剂来替代结核菌素衍生物（purifiedproteinderivative,PPD）。Nakamura[11]等采用MPT64抗原做皮肤划痕试验，以PPD阳性的健康者作对照，其检测结[12]核病的敏感度和特异性分别为98.1%和100%。吴雪琼等比较重组MPT64与PPD诊断结核病，重组MPT64的敏感性低于PPD，而特异性相当。重组MPT64成分单一易获取和纯化，且序列高度保守交叉反应少，易建立标准化诊断体系为临床结核病检测提供便利；MPT64抗原被认为最有希望取代PPD成为新一代结核病皮肤诊断试剂。[13]Mijung等制备MPT64抗原的单克隆抗体，采用双抗夹心ELISA检测389份结核病患者血清，其灵敏度和特异性均为100%且没有交叉反应，检测MPT6444范围为2.1ng/mL至250ng/mL（相当于1.7×10CFU/mL至2.0×10CFU/mL）。研究表明，MPT64的免疫层析法(immunochromatograpicassay，ICA)诊断结核病5敏感度为92-99%，特异性为97-100%，检测下限可低至1×10CFU/mL，对比MPT64抗原的双抗夹心ELISA与ICA，双抗夹心ELISA诊断结核病灵敏度和特[14-17]异性均优异于ICA。肺外结核（Extrapulmonarytuberculosis，EPTB)占结核病的15%-20%，其临床表现往往十分隐匿而不易区分，痰涂片和培养法等方法阳性率不高，给EPTB的确诊带来挑战，是结核病诊断一大难点。[18]Tadele等采用MPT64抗原的多克隆抗体免疫组化检测肺外结核，其灵敏度和特异性分别为74.5%、89.5%，对比肺外结核的抗酸染色和培养法（诊断率分别为13.7%、19.6%），MPT64多抗免疫组化检测方法具有较高的诊断效率。43 [19]Purohit等使用MPT64的单抗免疫组化检测51份肺外结核病样本，其灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为100%，97%，97%，100%，具有较好[20]临床应用价值。Watanabe等研究mpt64基因RT-PCR、痰涂片和培养法三种诊断方法，检测715份痰样本，研究发现，mpt64基因RT-PCR检测结核病的灵敏度和特异性分别为90.3%、98.6%，与痰涂片（敏感度82.3%，特异性99.7%）和培养法（敏感度90.3%，特异性99.4%）相比，诊断结核病能力没有明显的差别，具有高灵敏度、特异性和耗时短的优点。MPT64作为一种血清学诊断用抗原，存在一些不足。Silva等报道重组MPT64[21]抗原在临床检测中，诊断的准确度存在波动，有学者推测其检测的准确度波动性，可能受重组蛋白纯化、复性过程中蛋白结构的改变，或制备该重组抗原的[22]表达载体受到污染等影响。重组MPT64抗原临床检测的不稳定性，影响其作为血清学诊断标志物在临床上的使用；为提高重组MPT64抗原在临床诊断的稳定性，研究者提出使用MPT64抗原优势表位多肽代替MPT64抗原，YangH等[23]使用噬菌体展示随机肽库筛选MPT64特异性多肽，其诊断结核病的灵敏度和诊断效率均明显高于MPT64抗原，尤其在结核病痰涂片阴性个体诊断，更具有诊断价值。QinLH和ZhuCT等研究者筛选高亲和力的MPT64抗原核酸适配体，用于结核病血清学诊断，均取得较好的诊断效果，这些成果为提高MPT64抗原[24,25]的临床诊断的稳定性指明新的思路。三、应用MPT64鉴别结核分枝杆菌复合群分泌蛋白MPT64是结核分枝杆菌复合群（MycobacteriumtuberculosisComplex，MTBC）活跃生长时，向其生存环境分泌的早期胞外蛋白，可以作为[26,27][28]一种检测标志物指示分枝杆菌的早期生长。许婉华等采用免疫胶体金检测培养滤液中分泌蛋白MPT64，在2、4周末可分别检测到60%与95%以上的阳性样本，建议分泌蛋白MPT64可用于指示结核杆菌生长，以及选择快速检测和培[29]养终点检测的适宜时点。何霞等应用分泌蛋白MPT64指示结核分枝杆菌生长，以BACTECMGIT960快速培养法为参照，其敏感性为97.61%、特异性为97.43%，具有较高的临床应用价值。Vishnu和Martin以MPT64抗原，采用ICA与ELISA等方法鉴定结核杆菌[30,31]MTB复合群，都具有高度灵敏度和特异性。尹小毛和刘忠华等以采用ELISA44 检测分泌蛋白MPT64来鉴定MTB复合群，最低检测下限为10μg/ml，检测MTB[32,33]复合群的敏感度为97.3%(110/113)，具有较高的临床应用价值。非结核分枝杆菌(Non-tuberculousmycobacterium,NTM)主要侵袭肺部，其临床表现和X光线检查以及抗酸染色，与结核病检测结果相似难以鉴别，且临床治疗上多数NTM耐一线抗结核药物与耐多药结核分枝杆菌难以区分；我国NTM占结核病样患者的3%～15%。尽管世界卫生组织大力在高负担结核病疫情国家推荐培养法，但由于非结核分枝杆菌造成交叉反应，给传统的培养法易造成假阳性结果；如何快速、有效地鉴别NTM感染患者与MTB，对结核病临床治疗起着重要作用，故需一种能快速鉴定NTM与结核分枝杆菌复合群感染的检测方法[34]。[35]KanadeS等使用“SDBIOLINETBAgMPT64Rapid”商业化试剂盒，采用免疫层析法鉴别MTBC和NTM，检测150例样本，其灵敏度和特异性分别为[36][37]99.19%、100%，且检测过程只需15-30分钟。JyotiA与ColMK等评价免疫层析法快速鉴别MTBC与NTM的临床应用价值，也取得了相似的检测效果。研究表明MPT64能够区分鉴别MTB与NTM，以MPT64为靶蛋白建立的免疫层析（ICA）是一种简单快速、诊断可靠、廉价的鉴别MTBC的方法，可以在低收入地区用来代替传统的生化检测，确认MTBC分离株具有良好的临床应用前[38-41]景。鉴别MTBC和NTB除了ICA，显微观察药物敏感试验（MODS）也是种简[42]单、快速廉价的结核病诊断方法，LinweiW等采用MODS鉴别MTBC与NTM，检测360份临床样本，比较结核杆菌MGIT960液体培养法（阳性率为61.4%），MODS检测阳性率为97.1%（95%CI：92.8%-99.2%)，具有较好诊断效果，但其生物安全性等弊端限制了该方法的临床推广。四、MPT64DNA疫苗研究由于结核分枝杆菌耐药菌株、非结核分枝杆菌、结核病/艾滋病共感染等导致结核病疫情复杂化且持续加重。而当前用于结核病预防的BCG疫苗免疫原性持续时间大概10年，对结核病的免疫保护力在0-80%范围波动，差异很大，不[43]能有效预防成人结核病的发生。我国用于生产卡介苗菌株上海D2PB302，源自DanishBCG菌株，为我国指定生产皮内注射卡介苗的唯一菌株，该BCG菌45 [44]株缺乏mpt64基因，不表达结核分枝杆菌蛋白MPT64。MPT64作为基因疫苗能诱导机体产生急性应答，引起迟发性超敏反应MPT64已成结核病疫苗研究的热点之一。DNA疫苗以构建的表达保护性抗原基因的真核表达质粒，导入宿主细胞来表达保护性抗原，可诱导体液免疫和细胞免[45]疫，具有较高的应用价值。Kamath等报道MPT64的DNA疫苗免疫小鼠能诱导脾细胞产生IFN-γ和特异性细胞毒性T细胞反应（CTL）。研究表明，Ag85A/MPT64、CFP21/MPT64等融合基因DNA疫苗，免疫感染的小鼠，其肺[46]部结核分枝杆菌荷菌量显著低于卡介苗对照组和单一基因疫苗组。基于蛋白质的亚单位疫苗被认为是一种很有前途的新型疫苗，MPT64与保护性抗原ESAT-6/CFP10等融合制备疫苗，能减少肺部结核分枝杆菌荷菌量。[47]WangC等制备CFP21-MPT64融合疫苗病导入BCG形成重组BCG，免疫感[48]染的小鼠，其肺部荷菌量明显低于单一抗原疫苗和BCG。XunL等融合多个抗原，构建ESAT6-Ag85B-MPT64(190-198)-Mtb8.4-Rv2626c(LT70)分子量为70kDad的亚单位疫苗，与佐剂DPC混合免疫感染的小鼠，能诱导小鼠产生较强的特异性体液和细胞免疫，对结核分枝杆菌感染产生长期高效保护效果。WangX[49]等构建Rv1813-Rv2660c-Ag85B-Rv2623-HspX的亚单位疫苗，能提高疫苗的保护效果。亚单位疫苗是结核病疫苗研究一个新的热点，该疫苗的研发主要在于特异性抗原的筛选，由于单一抗原引起的免疫效应有限，研究者常融合俩个甚至多个抗原来增强疫苗的免疫效应和保护力。在结核病的感染中，目前普遍认为Th1细胞和IFN-γ能有效保护机体抵抗结核分枝杆菌入侵，而Th2和Treg细胞阻止过强Th1型反应造成的组织损伤，但[50,51]过度抑制也会促使结核分枝杆菌逃避免疫监视，如何在倆者之间寻求平衡，有效的预防甚至杀死结核分枝杆菌，是重组疫苗研发重点。随着对结核分枝杆菌致病免疫机制不断深入研究，以及重组DNA技术和蛋白质组学技术的发展，结核病DNA疫苗包括多价DNA疫苗、卡介苗DNA疫苗、DNA与细胞因子联合疫苗，以及融合蛋白疫苗等，因其优势成为未来结核病疫苗研究热点。46 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中英文缩略词对照表英文缩写英文全称中文全称MTBMycobacteriurmturbercurlosis结核分枝杆菌MTCMycobacteriurmturbercurlosiscomplex结核分枝杆菌复合群LTBIlatentturbercurlosisinfection潜伏性结核感染AuNRsgoldnanorods金纳米棒Ampampicillin氨苄青霉素Kankanamycin卡那霉素BCGBacillursCalmette-Gurérin卡介苗IPTGisopropy-β-D-thiogalactoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷PBSphosphate-burfferedsaline磷酸盐缓冲液Tristris-hydroxymethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链反应PEGpolyethyleneglycol聚乙二醇SPRsurrfaceplasmonresonance表面等离子体共振TBTurbercurlosis肺结核BSABovineserurmalburmin牛血清白蛋白ELISAenzymelinkedimmurnosorbentassay酶联免疫吸附试验DAB3,3,-diaminobenzidine二氨基联苯胺TMB3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine四甲基联苯胺HRPHorseradishPeroxidase辣根过氧化物酶IgGImmurnogloburlinG免疫球蛋白GCTABHexadecyltrimethylammoniurmBromide十六烷基三甲基溴化铵EDC1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)1-乙基（-3-二甲基氨基丙carbodiimide基）碳二亚胺盐酸盐LPPlongiturdinalplasmonpeak纵向等离子体吸收峰LPWwavelengthoflongiturdinalplasmonpeak纵向等离子体吸收峰波长LSPRlocalizedsurrfaceplasmonresonance局域表面等离子体共振URLSPRmurlti-throurghpurtlocalizedsurrface多通量局域表面等离子plasmonresonancebiosensor体共振生物传感器MURA11-mercaptourndecanoicacid十一巯基十一烷酸NaBH4Sodiurmborohydride硼氢化钠NHSN-hydroxysurccinimideN-羟基琥珀酰亚胺ODopticaldensity光密度TPPtransverseplasmonpeak横向等离子体吸收峰TPWwavelengthoftransverseplasmonpeak横向等离子体吸收峰波长Vis-NIRvisible-nearinfrared可见近红外光51 在校期间发表的主要学术论文[1]蒋华科,袁仕善,谢琳,等.重组结核分枝杆菌MPT64的克隆与表达[J].湖南师范大学学报（医学版）,2016,13(2):9-11.53 致谢时光飞逝，岁月如梭，三年的硕士生涯将敲响结束的钟声，学校生活也将告一段落。站在人生的又一个转折点上，我思绪万千，在这里，我要向所有关心、帮助过我的人表达最真诚的谢意和感恩之情。首先，衷心感谢我的指导老师袁仕善教授，这篇论文是在袁老师的悉心指导与鼓励下完成的。袁老师为我提供了良好的实验条件，给了我很多学习实验技术的机会，在开展项目、撰写论文等方面提供了很多专业性的指导。袁老师渊博的学术知识、严谨的科研态度、精细的工作作风将深深激励着我。在三年的实验室时光里，袁老师不仅在学业上给我以悉心指导，同时还在思想和生活上给我以无私的帮助，在此谨向袁老师致以诚挚的感谢！衷心感谢刘如石老师、王庆林老师、唐小异老师、张冉老师、彭飞老师、刘年猛老师等在实验中对我的指导和帮助。衷心感谢湖南省结核病防治所检验科谭云洪老师和郭靖玮师姐为本研究提供结核杆菌和结核病血清标本。衷心感谢湖南省人民医院检验科和医学院检验系老师们对我的教导与帮助。非常感谢医学院郭铭伟老师、张坚松教授在研究生期间给予的关心和帮助。特别感谢我的父母，我的家人，有了他们的支持，我才能一路前行。54