中国油菜黑胫病害分布与病原菌鉴定及综合防治技术研究

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分类号：Ｓ４３２．１单化代码：１０３ｂ４密级：学巧：１３０９１６０２００３之宴泼在扯乂学学位论文中国油菜黑腔病害分布与病原菌鉴定及综合防治技术研究ＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｔｈｅＰａｔｈｏｅｎＩｄｅｎ村ｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＣｏｎｔｒｏｌｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＢｌａｃｋｌｅｇＤｉｓｅａｓｅｏｎＣＵｌｓｅｅｄＲａｐｅｉｎＣｈｉｎａ研究生：荣松柏指导教师：潘月敏副教授合作指导教师：李强生研究员申请学位口类级别；农学硕±专业名称：植物保护＇研究方向：真菌学及植物真菌病害所在学院：植保学院答辩委员会主席二零一五年六月 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进巧的硏究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教脊机构的学位或证书而使用过的材料…－。与我间ｘ作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。＂研究生签名■ｉＶ过年（；身和和时间：月关于论文使用授权的说明送木人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，目Ｉ］：学校有权保留交论文的复印件和磁盘，允许论文被蒼閒和借阅，可！心＾采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论义。同意安徽农业大学可用不同方式在不同媒体上发巧、传播学位论文的全部或部分内巧。研究生签名；时间：一（巧項乃３媒．ｒ＾一心第巧师签名：时问：月曰＾＼ 摘要针对目前我国油菜黑胫病病原菌类型、致病力强弱和危害程度不明等问题，基于通过开展油菜黑胫病的调查、鉴定和不同危害程度对植株产量及农艺性状的影响,以及药剂防治效果试验，进而实现明确我国油菜黑胫病病原菌类型、分布特点，了解危害程度和建立防控技术体系的设想。通过对全国各地油菜黑胫病的调查、菌株采集、病原菌分离纯化、形态特征观察、生物学鉴定和致病力评估，分析我国油菜黑胫病病菌的类型、致病力差异和分布特点；利用人工接种的方法获得发病程度不同的病株，对株高、分枝数、角果数、角粒数、千粒重等生物学性状和产量的考察，分析不同危害程度油菜单株各性状间的差异；通过试验比较药剂防治对降低黑胫病发病率、减轻危害程度和减少产量损失的积极作用。2011-2014年，对全国16个省70余县（市）进行了油菜黑胫病的调查，调查结果表明，在我国油菜黑胫病已普遍存在，各地发生危害程度不一，以安徽、湖北、江苏、贵州等地较重，部分田块发病率达90%以上。通过对病害样本进行了实验室DNA分析和病害特征特性观察，病原菌被鉴定为弱侵染型种（Leptosphaeriabiglobosa），尚未发现强侵染型种（Leptosphaeriamaculans）在我国存在。对来自全国11个省市区的22份病原菌材料检测结果显示，病原菌致病力强弱表现出不同差异，其中强致病力材料8份，中等致病力14份，且除一份材料外均较对照波兰菌株致病力强。试验结果充分表明该病害对我国油菜生产具有一定危害性。通过病原菌对产量损失的研究，分析了油菜黑胫病菌不同危害程度对油菜产量损失的影响，结果显示黑胫病害以4-5级危害较重，可造成单株产量损失达50%左右，1-2级病害一般认为不构成严重产量损失，危害相对较轻。病原菌的侵染不仅导致产量损失，而且直接影响植株各项指标变化，其中产量构成指标值如株高、分枝数、角果数、千粒重等均随病害级别加重呈下降趋势。针对油菜黑胫病病原菌传播流行及其特征特性，提出了农业防治、化学防治和生物控制等关键的综合预防防治技术。关键词：油菜，黑胫病，致病力，危害，产量损失-3- AbstractAimedtocontrolthestemcanker/blacklegontheoilseedrape(Brassicanapus)inChina,thepathogenicityandthedamagedegreeofseveralunknownpathogenicbacteriatypeshavebeeninvestigatedandidentified,whichcontributetoanalyzetherelationshipamongyieldsofsingleplantwithdifferentdamagelevelandplantagronomiccharacters,soastoclearanddefinitetheirdistributioninChina.Yieldlosshasbeenevaluatedandthemanagementstrategyhasbeenestablishedinthisstudy.Baseonthegoalabove,diseasesurveying,samplescollecting,pathogenicseparatingandpurifying,morphologicalcharacteristicsobserving,biologicalidentifyingandpathogenicityevaluatingwereconducted.Singleplantwithdifferentdiseaselevelhasbeenobtainedbyartificialinoculation.Theplanthigh,branchnumber,podnumberandpodseedsnumber,thousandseedweight(TKW)andyieldhavebeenrecordedafterharvest,indicatingthatthechemicalcontrolhavepositiveeffectoncontrollingthisdiseasecomparingtothecontrolgroup.Blacklegsurveyofoilseedrapewereconductedin70locationsof16provincesinChina,coveringbothofwinterandspringoilseedrapeproductionregionsduring2011~2014,whichexhibiteduniversalityanddiversityofblackleginthefield.ThediseaselevelinAnhui,HubeietcProvinceswheretheincidencewasupto90%,wasmoreseriousthanother-4- province.BothculturalidentificationandDNAdetectionwereconductedtoidentifytheselectedisolatessamples.ResultsdemonstratedthatLeptosphaeriabiglobosawerelessaggressivewhileL.maculanswerenoaggressive.Pathogenicityof22L.biglobosaisolates(collectedfrom11provinces)wasevaluatedbyinvivocotyledoninoculationmethodusingpycnidiosporesuspension.Resultsillustratedthatallthe22isolateswerepathogenictoB.napus.Almostallthetestedisolatesdisplayedhigherpathogenicitythanthecontrol,PolishL.biglobosaisolatePL-Lb,.Fourteenisolateswereconsideredhighlypathogenicandeightisolatesweremoderatelypathogenic.Yieldlossesamongthedifferentdamagelevelwereevaluatedinthisstudy,whichexhibitedthatthediseasewith4-5gradehaveheavierdamagethanothers,causingyieldlossesuptoabout50%.Infectionsofpathogensnotonlycausedtheyieldloss,butalsodirectlyaffectedtheplant’scharacters,suchasplantheight,branchnumber,podnumberandTKW(ThousandKernelWeight).Accordingtothediseasepropagationprevalenceandtheircharacters,thecomprehensivecontroltechnologyweresuggested.Keyword:oilrapeseed,blackleg,pathogenicity,damage,yieldloss-5- 目录1文献综述............................................................11.1黒胫病的基本特征特性..............................................11.1.1概念.............................................................11.1.2培养特征.........................................................11.1.3DNA分子量水平..................................................21.1.4侵染过程......................................................21.1.5危害症状......................................................21.1.6危害条件......................................................31.1.7危害程度......................................................31.2国内外黑胫病发生流行史及研究现状............................41.3.1黑胫病的发生流行史..........................................41.3.2研究现状......................................................51.3存在的问题.......................................................62引言..........................................................73材料与方法........................................................83.1我国油菜黑胫病的鉴定与分布......................................83.1.1油菜茎基溃疡病、黑胫病调查和病株的采集..................83.1.2病原菌的分离、纯化..........................................83.1.3病原菌的培养特征鉴定.....................................83.1.4病原菌基因组DNA的提取.....................................83.1.5病原菌种类的多重PCR鉴定...................................93.1.6病原菌假囊壳的发育和形态观察...............................93.1.7病原菌的致病性和致病力检测.......................................93.2黑胫病对油菜性状及产量的影响........................................93.2.1油菜品种和供试菌株..............................................93.2.2试验方法.......................................................9-6- 3.3药剂防治对黑胫病发病的影响........................................104结果与分析.........................................................114.1我国油菜黑胫病的鉴定与分布.........................................114.1.1油菜黑胫病害的分布与发生情况.............................114.1.2田间油菜黑胫病的症状.......................................134.1.3油菜黑胫病病原菌的假囊壳形态...................................134.1.4病原菌种类的形态学鉴定...................................144.1.5病原菌种类的多重PCR鉴定......................................144.1.6病原菌的致病性和致病力检测....................................154.2黑胫病对油菜性状及产量的影响.....................................174.2.1L.biglobosa对油菜植株性状的影响..................................174.2.2L.biglobosa对油菜产量的影响......................................174.3药剂防治对黑胫病发病的影响.........................................184.3.1不同处理间的发病率和发病指数分析.................................184.3.2处理间产量的比较.................................................195黑胫病的综合防治策略...............................................215.1油菜黑胫病害的预测预报........................................215.2化学防治.........................................................215.3生态控制..........................................................226结论与讨论.....................................................236.1黑胫病在我国的发生及分布情况.......................................236.2黑胫病病原菌对油菜产量及性状的影响...............................236.3黑胫病药剂防治对产量的影响及应用效果...............................236.4黑胫病病原菌变化的预测.............................................23参考文献.............................................................25致谢.................................................................34个人简历.............................................................35-7- 1文献综述油菜黑胫病（Phomastemcanker或blackleg）是世界范围内油菜及其它芸薹属植[1,2,3][4,5]物广泛发生的真菌病害，所造成的油菜产量损失每年在9亿美元以上。澳大利亚在上世纪七十年代初期严重爆发流行的油菜黑胫病几乎完全停滞了该国油菜产业[6]的发展，直到抗病品种的引进油菜产业才得以恢复。欧洲及加拿大、美国等国家也同样遭受黑胫病的威胁，产量损失在10%-30%不等，严重年份超过50%。随着全球气[4,7,8]候变化，油菜黑胫病在世界范围内逐渐加重和扩展。1.1油菜黑胫病害的基本特征特性1.1.1概念油菜黑胫病菌Leptosphaeriabiglobosa(Desm)Ces.&deNot.属真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，座囊菌纲(Dothideomycetes)，格孢腔菌目(Pleosporales)，格孢腔菌科(Pleosporaceae)，小球腔菌属(Leptosphaeria)；无性态属茎点霉属Phomalingam。主要有强侵染型的Leptosphaeriamaculans([Desm.]Ces.etdeNot.)和弱侵染型的Leptosphaeriabiglobosa两个种，无性世代为茎点霉属Phoma[9,10,11]lingam。我国将由L.maculans引起的油菜病害命名为油菜茎基溃疡病（oilseedrapestemcanker），由L.biglobosa引起的油菜病害命名为油菜黑胫病（oilseedrapeblackleg)。1.1.2培养特征黑胫病L.maculans可以非常容易地在多种营养基质上生长，通过对黑胫病原菌进行的离体培养，研究人员发现不同菌株之间在培养特征上的多样性。当采用病原菌子囊孢子进行培养时，弱侵染型（L.biglobosa）子囊孢子萌发通常由两端细胞开始，而强侵染型菌的子囊孢子通常由中间细胞开始，中部细胞萌发形成的萌发管较两端细胞形成的萌发管短。强侵染型（L.maculans）的子囊孢子、分生孢子或菌丝在营养基质上的生长速度较慢，在CzapexDox液体培养基上不产生水溶性的黄色色素，培养后基质pH值较高。弱侵染型（L.biglobosa）菌株的孢子一般则倾向于产生较长的萌发管，生长速度较快，液体培养基上释放黄色至深棕色的色素，培养后的pH值较低。两种菌丝在固体培养基质上的生长速度相差明显，当分别接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基、培养在25℃黑暗条件下，弱侵染型L.maculans菌落扩展速度约为4.9-6.8mm/天，而强侵染型菌落的扩展速度约为1.7-3.9mm/天。弱侵染型L.maculans培养时产生绒毛状白色菌丝，菌落规则，显微镜下观察可以发现菌丝呈直线式生长，只产生很少一些短的分枝；这些菌落通常会在菌丝的气生部分形成黄色或褐色液体小滴，分生孢子器主要形成于菌落中央。强侵染型（L.maculans）则形成白色平坦的菌落、气生-1- 菌丝短小，培养产物表面呈陈旧状；形成的分生孢子器相对较少、显微镜观察可见较多的分枝菌丝。1.1.3DNA分子量水平Leptosphaeriamaculans和Leptosphaeriabiglobosa基因存在差异，选用特定引物[12]经PCR扩增后其产物的分子量大小也相应存在区别。基于物种遗传构成差异的分子证据是鉴别生物种的有力手段。现代分子生物学的发展为区分油菜黑胫病致病真菌类型提供了可靠的途径，DNA分子的多态性被广泛应用于病原菌种的分类鉴定。1.1.4侵染过程黒胫病主要在苗期开始侵染油菜，油菜出苗后，在条件（如温度、湿度）合适时，残留在田块中成熟的假囊壳就会开口释放大量子囊孢子，子囊孢子随流动的空气传播，当落到油菜叶片上便开始侵染，形成病斑，随着油菜的生长，病原菌由叶片向茎秆侵染，一般在油菜成熟前，植株茎秆上的病斑十分明显，并在病斑处会有假囊壳生成，适当的时期释放孢子形成有性世代循环。在病原菌侵染叶片形成病斑时，通常会有分生孢子形成，分生孢子会再次侵染其他叶片形成新的侵染途径(图1)。图1.黑胫病侵染循环示意图1.1.5危害症状-2- 被侵染油菜子叶或叶片处有黑色坏死斑点（由致病力弱的菌株造成）；或灰白色病斑（由致病力强的菌株造成），病斑易破裂，有黑色小粒点（为分生孢子器）。茎杆表面症状：早期染病茎秆部位呈灰色，病斑处有黑色的边界。后期茎秆干枯时，病斑呈灰白色，有时灰白色病斑处有小黑点（分生孢子器）生成。茎秆横截面症状：感染组织横切面有黑色部分，为茎髓组织溃疡，面积因病菌侵染程度而不同，严重时染病植株茎基部受侵染形成腐烂。1.1.6危害条件植株年龄油菜植株的年龄是影响黑胫病害侵染的重要因素之一，植物通常在幼龄时期对黑胫病病原菌最为敏感。幼龄植株对病原菌敏感可能是由于植株较小，其天然保护机制还没有很好的建立起来，并且真菌从叶片侵染到达茎秆或茎基部的距离相[13,14]对较短，易于造成茎基部感染，从而导致后期严重病发和产量损失。研究表明：油菜六叶期以前被病菌侵染可能会造成巨大的产量损失，若感染发生时期植株已经越[13,15]过此时期则造成的病害程度将会减轻。因此在建立油菜黑胫病的综合防治体系时，人们通常将调整播期作为一项建议措施，使油菜敏感期避开病原菌孢子释放高峰期。[16]温度湿度油菜黑胫病发需要一定温度湿度条件。气候条件对油菜黑胫病的影响可分为两个阶段：第一阶段是在病原物感染前，气候条件主要影响作物秸秆上病原物假囊壳和子囊孢子的形成与释放；第二阶段是在油菜幼苗期，气候条件主要影响到子囊孢子的侵染和病斑形成。报道称不同地区病原物假囊壳的发育最适温度也有一定差异，一般15-20℃最有利于其发育。温度还影响子囊孢子的释放量及孢子释放持续时间。湿度是影响假囊壳释放孢子的重要因数，干燥可推迟假囊壳成熟，但当假囊壳[17]成熟后，只需少量雨水或露水便可诱使孢子释放。温度湿度也同样影响病原菌孢子萌发和侵染速度。侵染物剂量自然释放的侵染物孢子数量会影响感染发生的概率和强度。侵染物剂量与感染强度并非是简单的线性关系，只在一定的范围内，随着感染病原孢子数量的[18,19]增加病害严重程度加重，但当孢子数量超过该阈值以后，再多的孢子释放并不能继续增加发病。机械损伤自然条件下，子囊孢子和分生孢子都很难侵染完整健康的植株茎秆。[20,21]但是在植株受到伤害的情况下感染则有可能发生。待伤口的植株被子囊孢子或分生孢子侵染后发病率和病害程度均会增加。1.1.7危害程度病害危害程度通用的病害级别来衡量，判定主要根据病害病原菌侵染植株茎秆截面积的程度进行等级划分。利用受侵染部分占截面积的比例将病害级别划分为0-5级6个级别，其中0级为正常植株，级别对应的截面侵染面积积为：0-5%、6%-25%、-3- [22]26%-50%、51%-75%、76%以上，级别越高侵染程度越严重。这种方法主要是在植株收获前的一段时间进行，有较好的可重复性和准确性。由于外部病可见病斑与茎内部感染之间可能存在一定的关系，环茎秆表面病斑比例和茎横截面病斑比例参数之间存[23]在明显正相关性，因此茎秆病斑的大小也被作为病害危害的判断依据。病害指数[19]（APDI）被用作反应病害危害严重程度的指标。1.2国内外黑胫病发生流行史及研究现状1.2.1黑胫病的发生流行史黑胫病的相关文献记载大约在100多年前，人们从被感染的瑞典油菜获得最早认识，后来的相关记载并不多见。据报道资料记载，19世纪末至20世纪初，黑胫病在澳大利亚、北美、和欧洲一些油菜、白菜等生产区域时有发生，并造成危害。随后[1,14]随着国际贸易的频繁，黑胫病在多数油菜生产国被发现证实，并导致病害的发生。德国油菜黑胫病发展的历史非常久远，造成的产量损失也比较大，一些年份田间植株的感染率可高达70%以上；在1997～2000年间进行的调查中，仍显示黑胫病是德国油菜的重要病害，而典型的菌核病感染却处于一个较低水平，最高发病率为8%，病情指数仅为0.3。据文献记载，早在1977年以前，黑胫病在英国油菜田中就已经被发现，但对油[24]菜生产造成的危害不大。然而随着油菜种植面积的扩大，病害也出现了快速增长的[25,26][24]趋势，黑胫病发病率甚至达到100%，产量损失超50%。依靠抗性品种选育与推[25]广，有效的抑制了黑胫病病原菌的进一步流行和蔓延。自20世纪80年代中期，英国油菜开始施行双低化，在生产上大量双低油菜品种的使用，使优质与抗病的矛盾在黑胫病病害上表现尤为突出。90年代，广泛而严重的油菜黑胫病流行再次爆发，继而黑胫病逐渐成为英国冬油菜生产毁坏性的病害。随后几年的调查显示，如1993年个别田块曾获得高达93%的植株感染率；在英格兰东部地区，1995年和1996年油菜收获前的田间取样调查结果显示，分别有84%和77%的植株被黑胫病原菌感染，造成敏感或中度敏感品种10%～20%的产量损失。目前，英国油菜黑胫病蔓延的局面仍在继续。波兰也是欧洲重要的油菜生产国之一，目前的油菜种植面积大约50万公顷。20世纪70年代后期，黑胫病从田间油菜植株上被发现,随后病害逐年加重，于80年代[27]初期流行达到了十分严重程度。早期油菜黑胫病爆发流行发生在波兰西北部，但到[28,29]了90年代该病已经在全国范围内普遍存在。在90年代中期以前，波兰主要种植地方油菜品种，黑胫病的危害并不十分严重。从90年代中期起，开始大量引进德国和法国的品种，几年之后，发现黑胫病发病率及严重程度迅速增加。油菜于1968年作为一种小麦的替换作物被引进到澳大利亚。该国最早的商业化油菜种植在1969年，主要分布在西澳地区。自油菜产业形成以来，澳大利亚油菜生-4- 产先后经历了两轮黑胫病害的严重冲击。第一轮是在20世纪70年代早期，黑胫病的严重流行曾一度停滞了该国油菜产业的发展；第二轮是在本世纪之初，由于油菜抗病品种的抗性不断被新的病原菌所突破而使得推广应用的抗病品种面临新的病害压力，造成显著的产量损失。黑胫病是澳大利亚最严重的油菜病害，同时该国也成为世界上[30]受黑胫病影响最为严重的国家。北美州加拿大是世界第二大油菜生产国和第一大油菜产品出口国（FAO统计数据）。1957年加拿大首次发现黑胫病致病菌，随后陆续在全国其他油菜生产区被发现鉴定。病原菌主要流行在加拿大Saskatchewan、Alberta、Manitoba及Ontario等油菜生产省份。病原菌L.maculans和L.biglobosa共同存在。各地区发病率和危害程度年[31]度之间存在差异，一般会造成20%左右的产量损失。在Saskatchewan省，1982年[32]黑胫病大爆发，个别田块产量损失达56%。资料显示，1994年因黑胫病危害给加拿[33]大带来的经济损失高达5,000万美元。美国油菜生产发展较晚，生产面积不大。但随着中北部和东南部面积的推广和扩[34][35,36]大，同样也受到了黑胫病的危害。1972年首次报道发现黑胫病菌，而到了1989[37]年，病害造成部分田块产量损失达80%。同样,除上述国家外，在世界的另一些国家地区也有黑胫病发生的报道。如墨西哥最早于上世纪80年代在花椰菜上发现黑胫病；阿根廷1995年在油菜试验小区内首次发现；匈牙利1996年在油菜田间发现；瑞典、丹麦、伊朗等国也在上世纪九十年代前后报道发现黑胫病，但相对而言，病害对产量的影响都不大。我国黑胫病最早报道于1999年，其后，类似黑胫病感染的症状在我国的油菜产区不断被发现，并分离获得一批致病菌株，所有菌株被鉴定均为弱侵染型[38]（L.biglobosa），尚未发现强侵染型（L.maculans）菌株存在。但根据国际上该病病原的演化规律，也预示着强侵染型的油菜黑胫病可能在我国出现并快速流行。目前，作者的相关试验结果显示黑胫病的弱侵染型也会对我国油菜造成一定的产量损失。1.2.2研究现状随着黑胫病害在世界各国的流行和危害的加剧，对黑胫病的科学研究也变得迫切和必要。自1957年黑胫病的有性阶段首次被发现后，很多学者对该病原菌的形态结构、寄主习性等进行了观察研究和描述。学者们依据病原菌的培养特征、形态特点、[39,40,41]生理生化等差异将病原菌区分为不同类型，即强侵染A型(Leptosphaeriamaculans)和弱侵染B型(Leptosphaeriabiglobosia)。在对油菜致病性及对产量损失研究上，先后有学者研究认为强致病菌株在接种油菜植株后,可以造成明显的叶部及茎秆感染症状，形成叶部和茎秆部的典型病斑，同时在茎秆上形成黑色条状病斑，有时在角果上也会有被侵染的病斑出现。研究认为油菜早期被强侵染型L.maculans侵染[42]后，通常会造成较大的产量损失，而感染弱侵染病菌的植株，一般后期才会有明显-5- [14]的症状表现，但病斑较小，造成的油菜产量损失也相对较小。黑胫病为气传性真菌病害，成熟的假囊壳在潮湿或雨滴条件下，孔口张开并释放出大量的子囊孢子，随空气流动或风力作用远距离传播。孢子量的多少与发病率和发病程度有极显著的正相关性。加拿大马尼托巴大学科研组研究通过观测田间孢子量与降雨量及传播距离之间的[43]关系，建立了黑胫病发生规律预测模型，为田间早期病害预测预报提供了科学依据。随着现代科学技术的防治，分子生物学技术逐渐成熟并用于各行各业，黑胫病研究也不例外。英国RothamstedResearch研究所利用油菜黑胫病原菌ITS序列特征设计多重PCR引物，获得强侵染型L.maculans和弱侵染型L.biglobosa特异扩增产物大小分[44]别为334bp和440bp。黑胫病毒力基因的发现和抗性基因克隆的研究对病害的控制起到了积极作用。先后有包括AvrLm4-7在内的11种毒力基因AvrLm1-AvrLm11在L.maculans上被确定，与此相应的抗性基因Rlm1-Rlm11在芸薹属的甘蓝、芥蓝、[45,46,47,48,49,50]拟南芥和油菜上被发现和应用，其中有4种抗性基因LepR1、LepR2、LepR3[51,52,53]和LepR4被证实存在于加拿大的油菜品种中。不同毒力基因的菌株对不同芸薹属材料致病也不尽相同，每一致病基因都相应的在不同作物上表现不同的致病性，这也是黑胫病菌生理小种区分的依据。最近,一篇研究文献称黑胫病菌基因AvrLmJ1对芸薹属芥菜表现无毒，不构成致病能力，而用作对照的AvrLm6却表现出较强的致病[54]力。与此相对应，SNF1（LmSNF1）基因被证明在黑胫病侵染表达过程中是需要的,该基因被敲除后，病原菌的产孢子量、孢子萌发以及附着植物表面能力都受到影响，[55]基因被敲除的病原菌接种侵染植株不表现任何感病症状。弱侵染型黑胫病自1999年首次报道在中国湖北安徽等地发现以来，国内有学者开始了相关调查研究，但由于该病对油菜产量影响不大，没有得到政府相关部门的重视，研究进展不大。近几年，随着国际贸易的频繁，该病对我国油菜生产的威胁日益加剧，黑胫病的危害受到了政府有关部门的重视，科研工作也逐步跟进。1.3存在的问题综上所述，黑胫病是国外油菜主产国发生频繁且危害严重的病害，而该病害在我国的发生情况仍没有相关报道，而且对病原菌类型、发生规律和防控措施等方面均无较多研究。尤其是在病原菌类型确立上，我国已将该病害的强侵染型种作为菜籽进口的检疫性病害，目前我国油菜产区是否存在强侵染性型种，这在国际贸易活动中仍是争论和关注的焦点。另外，对病害的地理分布，弱侵染型病害的致病性及危害性还没有深入了解和研究，如何有效预防防治病害的流行发生发展还有待进一步研究。-6- 2引言油菜是我国油料第一大作物，我国常年油菜种植面积750万公顷，在农业生产中的地位不容忽视。油菜黑胫病是在世界范围内普遍发生的，气传性真菌病害。属真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，座囊菌纲(Dothideomycetes)，格孢腔菌目(Pleosporales)，格孢腔菌科(Pleosporaceae)，小球腔菌属(Leptosphaeria)；无性态属茎点霉属Phomalingam。根据其致病性的强弱分为强侵染型（Leptosphaeriamaculans([Desm.]Ces.etdeNot.)）和弱侵染型（Leptosphaeriabiglobosa）两种，无性世代为茎点霉属Phomalingam，而多数情况下两种类型共同存在。上个世纪来，该病害给世界油菜生产带来了沉重打击。澳大利亚在上世纪七十年代初期严重爆发流行的油菜黑胫病几乎完全停滞了该国油菜产业的发展，直到抗病品种的引进油菜产业才得以恢复。随着全球气候变化，油菜黑胫病在世界范围内逐渐加重和扩展。近年来，有外国学者在中国发现疑似黑胫病病株并做出鉴定，认为我国存在油菜弱侵染型黑胫病，但对于是否存在强侵染型种存在争议。由于该病害的危害巨大，且未有证据表明我国存在强侵染型种，2007年5月28日我国发布执行的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中将十字花科蔬菜黑胫病菌L.maculans列为检疫对象。从油菜中鉴定出弱侵染型病原菌L.biglobosa后，类似黑胫病感染的症状在我国的油菜产区不断被发现，并分离获得一批致病菌株，但系统的研究工作尚未得到足够重视，对我国油菜黑胫病发生现状、致病菌的类型及分布范围、对油菜的产量损失以及预防防治技术等，仍缺乏科学的认识。在国家油菜产业技术体系项目的资助下，结合我国农业生态和耕作制度特点，从全国黑胫病病原菌的调查与鉴定着手，对病原菌进行形态学、生物学鉴定，开展致病力、致病性评价，结合当前我国油菜生产状况，进行抗性资源材料的筛选与鉴定。研究病害不同发病程度对单株产量及农艺性状的影响，开展病害药剂防治及综合防治策略和相关技术研究。从而全面了解黑胫病在我国的发生发展规律，流行趋势和对产量构成损失的评估。为在不同生态区域和耕种模式情况下，建立长期的监测监控体系，提出科学的抗病品种分布以及防治技术路线，为进一步深入研究和保障我国油菜产业健康稳定发展提供科学依据和技术保障。-7- 3材料与方法3.1我国油菜黑胫病的鉴定与分布3.1.1油菜茎基溃疡病、黑胫病调查和病株的采集2008-2012年间，在油菜终花期至收获前，选择包括种植冬、春油菜的16个省（市、自治区）60个市（县）的油菜田块，每一田块随机选取3个调查取样点，每2点面积为5ｍ左右，3个点共调查150～220个油菜单株，根据黑胫病在茎秆、基部[11,56,,57,58]造成的典型症状，调查病株率，采集部分病株（及疑似病株）样品带回实验室做进一步的病原菌分离、培养和鉴定。3.1.2病原菌的分离、纯化从感染油菜秸秆的病斑处切取大小约0.2×0.2cm的植物组织，70%酒精浸泡约1min，无菌水清洗2次，再放入10%的次氯酸钠溶液中表面消毒约2min，无菌水清洗数次，用无菌滤纸吸干表面多余水分。将表面消毒后的植物组织样品置水琼脂（琼脂2g+100mLdH2O）培养基上，20°C黑暗条件下培养3-5d，样品边缘有真菌菌丝生成。无菌条件下挑取少量菌丝体，转移至添加抗生素的PDA培养基（potatodextrosebroth,Sigma-AldrichInc.,Germany，添加100mg/L链霉素和50mg/L青霉素，上海生工生物公司产品）上，20°C培养5~7d后，挑取菌丝体边缘少量菌丝转移至不含抗生素的PDA培养基上，培养3~6d后，再次挑取边缘菌丝接种至PDA培养基，直至纯化。3.1.3病原菌的培养特征鉴定真菌L.maculans和L.biglobosa具有生长速度、培养特征和色素产生的形态学[59]差异，该差异可用于两者的初步鉴定。挑取少量纯化菌株边缘快速生长的菌丝接种到培养基为PDA的直径11cm培养皿中，20°C培养2~4周，观察真菌生长速度、菌丝体和色素产生情况，以澳大利亚、英国、加拿大的强侵染型L.maculans菌株和波兰的弱侵染型L.biglobosa菌株做对照，进行初步的致病菌种类鉴定。其中生长速度较快、生成黄色至棕色或红棕色色素的为L.biglobosa，生长速度慢、无色素生成的为L.maculans。3.1.4病原菌基因组DNA的提取[31,33]采用SDS法从油菜染病组织中直接提取真菌，在文献基础上略加修改。SDS提取缓冲液（每500mL）含：6.06gTrisbase,0.37gEDTA，8.77gNaCl，pH7.2，并含2%SDS、1%β-巯基乙醇，2%的聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）和5mmol/L的林菲罗琳(PM)。从纯化的菌丝体中提取DNA方法如下：将形态鉴定出的疑似L.maculans或L.biglobosa菌株接种至PDB（potatodextrosebroth,Sigma-AldrichInc.,USA）液体培养-8- 基中，水平振荡培养（23°C，180r/min）10d，提取菌丝体DNA。3.1.5病原菌种类的多重PCR鉴定根据L.maculans/L.biglobosa基因组中ITS序列上的差异，设计了多重PCR引物：LmacA（L.maculansforwardprimer）:5’-CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA-3;LmacB（L.biglobosaforwardprimer）:5’-ATCAGGGGATTGGTGTCAGCAGTTGA-3’;LmacR（Reverseprimerforboth）:5’-GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG-3’。LmacR为共同反向引物。上述引物可以扩增出L.maculans和L.biglobosa不同的PCR产物，其中L.maculans获得大小为334bp的特异性扩增产物，L.biglobosa获得大小为440bp的特异性扩增产物。20μL的PCR反应体系为：40ngDNA模板，正向引物各100ng，反向引物200ng，4μmoldNTPs，1U的Taq酶，30mmolMgCl2，1×MastermixPCR[60]缓冲液，加ddH2O调至反应体积。引物PCR反应为常规SCAR反应程序，65°C退火。3.1.6病原菌假囊壳的发育和形态观察试验在合肥试验田进行。5月下旬油菜收获后，留下距地面50~60cm的带病斑的秸秆，免耕播种绿豆。在田间自然条件下，观察油菜病残体上病原菌假囊壳的发育进程。3.1.7病原菌的致病性和致病力检测[61]采用分生孢子悬浮液子叶接种的方法，检测病原菌的致病性。试验在温室条件下进行，16h光照，20~26℃，8h黑暗，12~20℃。供试病原菌株：从分离、纯化、培养特性和PCR鉴定确定为L.biglobosa的菌株中选取22个进行对油菜致病力的测定，这些菌株分别来自全国11个省（市、自治区）。来自波兰的中等致病力的L.biglobosa菌株PL-Lb做对照。分生孢子在V8果汁琼脂7[62,63]培养基上培养获得，用无菌水配置成浓度为10/mL分生孢子悬浮液。甘蓝型冬油菜品种中油821(Zhongyou821,ZY821)和国外品种Hearty、Bristol、Courage。播种12d后的子叶进行分生孢子接种，每个品种接种10株，3次重复，每[64,65]株接种一个子叶。在接种后第14d，采用0~9级鉴定标准调查子叶发病等级，[66]用Williams和Delwiche方法，计算病原菌株的致病力等级（DI）。3.2黑胫病对油菜性状及产量的影响3.2.1油菜品种和供试菌株接种品种：农业部主导品种“中双11”和国家区试病害对照品种“中油821”，从育种单位征集经过加代繁殖。大田调查品种为华中农业大学选育的“阳光2009”。接种供试菌株：2011年合肥试验地采集，经常规分离纯化和多重PCR鉴定后备用。编号为HF-8。3.2.2试验方法-9- （1）接种试验于2012年9月-2013年6月在合肥试验基地进行。在油菜苗期3叶和6叶期、苔期、初花期选取长势较一致的植株用消毒过的接种针小心刺破子叶或茎秆，2取适量大小（约9mm）着生菌丝的培养基附在破口处，用封口膜包裹固定。每份材料每期接种30株，每株1点，3次重复，1组对照。全生育期不喷施杀菌剂。（2)大田调查于2014年5月10日油菜收获前7天在湖北襄阳宜城进行。取样参照相关研究按照病害田间调查取样标准采用对角线5点取样，每点取样200株，进行病害级别鉴定、植株性状[22]指标统计和计产。（3）病害级别鉴定参考Aubertot等学者所采用的0-5级鉴定标准(表1，图2)。表1油菜黑胫病病情分级标准病级症状（侵染部分占横截面比例）0无可见症状1轻微侵染，侵染面积<5%2侵染面积＜25%3侵染面积25%-50%4侵染面积50%-75%5植株枯死，侵染面积>75%图2L.biglobosa0-5级侵染截面示意图3.3药剂防治对黑胫病发病的影响试验地选在安徽皖南山区黑胫病发病较重的田块。试验选用了农艺性状不同的15组材料作为供试品种。黑胫病病源物为上年度油菜收获后的带病残留秸秆。试验与2012-2014年进行，采用药剂杀菌处理和非处理两组，每组14个品种，三次重复，2小区面积为2*10m,随机区组设计。试验与当年10月1日前后播种，播种后3日将收集的带菌秸秆均匀洒于试验田内。油菜3-5叶期对药剂处理组进行第一次药剂喷施，7日后进行第二次喷施，抽薹期、初花期分别进行1次。药剂选用百菌清粉剂。油菜正常收获前3日进行黑胫病发病情况调查，每品种每小区调查50株，统计发病率，并进行测产。-10- 4结果与分析4.1我国油菜黑胫病的鉴定与分布4.1.1油菜黑胫病害的分布与发生情况2008-2012年调查结果发现，16个省市自治区被调查的油菜田块中，除西藏和陕西没有发现油菜黑胫病株外，其余14个省（市、自治区）中的42市（县）均有发生。注：■有黑胫病发生的市（县）Note:Citiesandcountieswhereblacklegwereidentifiedshownbyblacksquare图3油菜黑胫病在我国的分布Fig.3DistributionofblacklegcausedbyL.biglobosaonoilseedrapeinChina调查结果显示黑胫病害发生程度在地区和田块间存在差异。发病田块约占调查田块的10%，其发病田块黑胫病的发病率由零星发病到92%的植株发病。在少量发病严重的田块，发现有高达5%的病死株（表2）。-11- 表2我国油菜黑胫病/茎基溃疡病发病情况调查（2008-2012）Table2Prevalenceanddistributionblacklegonspring/winteroilseedrape（OSR）during2008to2012调查地点油菜类型调查田病原菌鉴定发病率SiteofSurveyRapeseed块数目PathogenDiseaseincidencetypeNo.identificationplots安徽Anhui合肥HefeiW35L.biglobosa3%~75.1%芜湖WuhuW8L.biglobosa﹤9%巢湖ChaohuW6L.biglobosa1%~33%肥东FeidongW13L.biglobosa﹤11%含山HanshanW12L.biglobosa﹤33%阜南FunanW5L.biglobosa﹤1%黟县YixianW22L.biglobosa1.6%~87%歙县ShexianW13L.biglobosa1.2%~90%休宁XiuningW9L.biglobosa﹤17%石台ShitaiW6L.biglobosa﹤8%郎溪LangxiW3L.biglobosa﹤1%江苏Jiangsu南京NanjingW9L.biglobosa11%~30%镇江ZhenjiangW5L.biglobosa﹤21%句容JurongW7L.biglobosa4%-12%扬州YangzhouW5L.biglobosa﹤7%兴化XinghuaW6L.biglobosa﹤16%江宁JiangningW3L.biglobosa21%~55%上海上海ShanghaiW---L.biglobosa---Shanghai湖南Hunan常德ChangdeW8L.biglobosa﹤92%，1%整株死亡1%Plantdeath桃源TaoyuanW5L.biglobosa3%~23%湖北Hubai荆州JingzhouW9L.biglobosa﹤39%黄冈HuanggangW7L.biglobosa﹤40%襄阳XiangyangW---L.biglobosa---江西Jiangxi九江JiujiangW7L.biglobosa2%~30%宜春YichunW5L.biglobosa﹤19%上饶ShangraoW6L.biglobosa﹤11%河南Henan罗山LuoshanW---L.biglobosa---固始GushiW11L.biglobosa1%~70%，5%整株死亡5%Plantdeath四川Sichuan成都ChengduW9L.biglobosa﹤13%绵阳MianyangW7L.biglobosa﹤1%南充NanchongW1L.biglobosa60%，5%整株死亡5%Plantdeath浙江安吉AnjiW9L.biglobosa3%~17%Zhejiang开化KaihuaW7L.biglobosa﹤15%常山ChangshanW8L.biglobosa﹤13%贵州Guizhou绥阳SuiyangW4L.biglobosa12%~45%金沙JinshanW5L.biglobosa8%~35%遵义ZunyiW6L.biglobosa﹤21%L.biglobosa内蒙古Inner海拉尔HailarS13L.biglobosa﹤5%Mongolia牙克石YakeshiS3L.biglobosa﹤1%青海Qinghai西宁XiningS---L.biglobosa---甘肃Gansu和政HezhengS---L.biglobosa---新疆昭苏ZhaosuS7L.biglobosa---Xinjiang注：W冬油菜；S春油菜。本表中不包括发病率为0的调查田块。“---”在田间采到受黑胫病侵染的植株或病残体，并从中分离鉴定-12- 出L.biglobosa，但没有统计发病率Note：W,winterrapeseed;S,springrapeseed.0%diseaseincidenceplotswerenotincludedinthetable.“---”Diseasedplantsordebriswerecollected,fromwhichL.biglobosawasisolatedandidentified,butdiseaseincidencewasnotrecorded4.1.2田间油菜黑胫病的症状从感染部位的症状表现判断，我国冬、春性油菜茎部、基部黑胫病斑与欧洲、北美油菜黑胫病（L.biglobosa）病斑相似。早期染病茎秆部位病斑呈灰色，有黑色的边界（图4a）。茎秆干枯时病斑呈灰白色，有时可以从灰白色病斑中发现小黑点，即无性生殖世代（Phomalingam）的子实体-分生孢子器，（图4b）；在感染组织的横切面可以观察到茎髓组织溃疡呈黑色（图4c）。调查中还发现一些染病植株茎基部受侵染形成腐烂。（图4d）。注：a:早期茎秆部位病斑呈灰色，有黑色的边界；b茎秆干枯时病斑呈灰白色，灰白色病斑中可见小黑点-分生孢子器；c：病斑部位横切面可见组织患病呈黑色；d：染病植株茎基部溃疡Note:a:Earlydiseasesymptomsonstemsaregrey-whitelesionswithdarkborders;b:Thestemdriesoutandpycnidiabecomevisibleonthelesions;c:Internalnecrosisoncross-sections;d:Stemcankerinstembaseofinfectedplant图4油菜黑胫病症状Fig.4SymptomsofblacklegcausedbyL.biglobosaonoilseedrape4.1.3油菜黑胫病病原菌的假囊壳形态8月下旬，从感染油菜秸秆的病斑中开始观察到假囊壳的出现，9月中旬假囊壳数量较多，10月上旬，假囊壳成熟，显微观察可见部分假囊壳上端孔口张开，成熟子囊孢子已释放（图5a）。显微镜下压破假囊壳，观察到的子囊和成熟的子囊孢子（图5.b），其形态特征均符合本文中对L.biglobosa的描述。注：a：在自然条件下感染黑胫病的油菜茎秆上产生的假囊壳；b：显微镜下观察假囊壳中成熟的子囊（每个子囊含8个子囊孢子）放出-13- 的子囊孢子Note:a:PseudotheciaofL.biglobosaproducedonwinteroilseedrapestemdebrisunderthenaturecondition;b:MaturedasciwitheightascosporesreleasedfromPseudotheciaofL.biglobosaundermicroscope图5假囊壳和假囊壳中的子囊孢子Fig.5PseudotheciaandascosporesreleasedfromPseudotheciaofL.biglobosa4.1.4病原菌种类的形态学鉴定从14个省（市、自治区）的冬、春油菜田间获得的疑似感染病斑中分离、纯化出550个菌株，对其进行的培养形态学鉴定结果显示，中国分离菌株的菌丝成长速度快，菌落相对较大，20℃条件下培养14d，菌落直径5.2~7.8cm，与对照L.biglobosa菌株（PL-Lb）生长速度相当（5.7cm），菌丝体表面呈绒毛状，菌丝分枝较少，在色素形成上亦与对照的L.biglobosa菌株相似，都产生黄色至黄棕色或棕红色色素。继续培养一段时间后，可在气生菌丝上观察到黄色（或黄棕色、红棕色）液珠，且菌株间存在色素水平上的变异，同时在衰老菌丝体上可观察到黑色的小粒点（即分生孢子器）。与来自澳大利亚、英国和加拿大L.maculans菌株形成的菌落相比，后者在20℃条件下培养14d后，菌落直径在3.7~4.9cm，菌丝分枝较多，菌丝体呈白色，未见色素形成,在衰老菌丝体上可观察到黑色的小粒点（即分生孢子器）。形态鉴定结果显示，分离自我国的多个油菜产区的黑胫病原真菌与L.biglobosa相似，而与L.maculans存在明显差异（图6）。注：a：为L.maculans，在PDA基质上产生黑色的小粒点（即分生孢子器），没有色素产生；b、c、d：为L.biglobosa，在PDA基质上产生黑色的小粒点（即分生孢子器），有黄色至黄棕色、红棕色的色素产生Note：a：L.maculanproducesblackgranules-pycnidiaandnocolorpigmentinthecultureofPDA；b、c、d：L.biglobosaproducesblackgranules-pycnidiaandyellowtobrowncolorpigmentinthecultureofPDA图6L.maculans/L.biglobosa在PDA基质上培养特征Fig6CharacteristicofL.maculans/L.biglobosaculturedonPDA4.1.5病原菌种类的多重PCR鉴定从分离、纯化、并经过形态学鉴定的550个菌株中选取348份病原菌株提取基因组DNA，与从疑似茎基溃疡病和黑胫病感染的油菜组织中提取的468份真菌基因组DNA样品一起，选择特异性引物进行多重PCR鉴定。鉴定结果显示，仅从上述样品基因组DNA中扩增出大小为440bp的扩增产物（显示为L.biglobosa），而未获得与L.maculans-14- 对应的大小为334bp的谱带（图7）。注：M为DL2000DNAladdermaker，泳道1-21为待检样品，22为L.biglobosa对照，分子量大小为440bp，23为L.maculans对照，分子量大小为334bp。检测结果未出现强侵染型种L.maculansNote:MisDL2000DNAladdermaker.Fromlane1to21weresamples,andlane22wasL.biglobosacontrol,whichMol.wt.was440bp;lane23wasL.maculanscontrol,whichMol.wt.was334bp.L.maculanshasnotbeenfoundintheresults图7样品PCR检测电泳图Fig.7PCRamplifiedresultsofsuspectedsamples4.1.6病原菌的致病性和致病力检测供试的来自全国11个省（市、自治区）的22个L.biglobosa菌株对接种的4个油菜品种均表现出一定的致病性。接种14d后，子叶受侵染症状的主要特征表现为：中等侵染力的菌株接种油菜子叶后，在子叶上造成直径不大于5mm的病斑（图8a），没有黑色小粒点（即分生孢子器）生成。强侵染力的菌株接种油菜子叶，子叶被侵染后，初现不规则的淡褐色病斑，后呈灰白色，稍凹陷、易破裂，有黑色小粒点（即分生孢子器）生成，侵染严重时导致子叶枯死(图8b、c)。注：a：直径不大于5mm的病斑，没有黑色小粒点（即分生孢子器）生成；b：淡褐色斑，稍凹陷、易破裂，有黑色小粒点（即分生孢子器）生成；c：灰白色病斑，上有黑色小粒点（即分生孢子器）生成，子叶枯死Note：a:Lesion≤5mmindiameter,withoutpycnidiaformation;b:Lightbrown,sunkenandbrokenlesionwithpycnidiaformation;c:Offwhitelesionwithpycnidiaformation,cotylendonwilt图8接种第14d子叶受侵染症状Fig.8Symptomsoflesionsoncotylendonatday14afterinoculation供试L.biglobosa菌株对接种油菜品种表现出致病力差异。来自上海的菌株CN-14平均致病力最高，为7.4；来自内蒙古海拉尔的菌株CN-21平均致病力最低，为4.6。强致病力菌株（致病力≥6）有14个，中等致病力菌株（即4≤致病力＜6）有8个，强、中、弱致病力菌株分别占63.6%、36.4%、0%。分离自春油菜区（内蒙古、甘肃）的L.biglobosa菌株表现出中等致病力；分离自冬油菜区的上海、江西、四川、湖南、河南省的菌株均表现出强致病力，而贵州、安徽和江苏的菌株致病力表现出较大的分-15- 化。除内蒙古海拉尔的菌株CN-21外，所有供试的中国其它21个菌株均较波兰中等致病力的L.biglobosa菌株（PL-Lb）致病力强。（表3）表3不同地区油菜黑胫病Leptosphaeribiglobosa菌株致病力差异Table3PathogenicityofLeptosphaeribiglobosaisolatescollectedfromdifferentregionsinChinaondifferentoilseedrapevarietiesmeasuredbyinvivocotyledoninoculation接种后第14天病原菌株对油菜品种的致病等病原小种代级（DI）平均致病号病原菌小种来源地Diseaseindexof14dayspost-inoculationon致病力等级CodeoftheOriginoftheisolatetestedcultivarsPathogenicityMeanDIisolateZS821HeartyBristolCourage安徽黟县Yixian,CN-15.87.46.56.66.6HAnhuiCN-2安徽合肥Hefei,Anhui7.07.36.57.27.0HCN-3安徽合肥Hefei,Anhui5.56.55.16.05.8M安徽含山Hanshan,CN-45.85.75.06.15.7MAnhui江西宜春Yichun,CN-56.36.66.36.06.3HJiangxi江西九江Jiujiang,CN-66.46.86.36.06.4HJiangxi四川成都Chengdu,CN-76.16.46.26.76.4HSichuan四川南充Nanchong,CN-87.17.66.76.67.0HSichuan湖南常德Changde,CN-96.55.66.86.66.4HHunan河南固始Gushi,CN-106.06.35.66.26.0HHenan河南固始Gushi,CN-117.47.36.06.16.7HHenan浙江常山Changshan,CN-126.46.26.15.96.2HZhejiang浙江安吉Anji,CN-137.06.65.96.66.5HZhejiangCN-14上海Shanghai7.87.07.27.57.4H江苏南京Nanjing,CN-156.37.16.46.86.7HJiangsu江苏南京Nanjing,CN-165.84.85.25.95.4MJiangsu贵州金沙县Jinsha,CN-175.75.35.14.75.2MGuizhou贵州绥阳县Suiyang,CN-185.75.96.05.45.8MGuizhou贵州贵阳Guiyang,CN-197.05.06.06.66.2HGuizhou甘肃和政Hezheng,CN-206.55.75.65.55.8MGansu内蒙海拉尔Hailaer,CN-214.55.64.23.94.6MInnerMongolia内蒙海拉尔Hailaer,CN-226.45.75.65.15.7MInnerMongoliaPL-Lb波兰Poland5.14.75.14.84.9M注：分生孢子悬浮液子叶接种的方法，检测病原菌的致病性。W：弱致病力DI＜4；M：中等致病力4≤DI＜6；H：强致病力DI≥6Note:PathogenicityofsomeselectedL.biglobosaisolateswasmeasuredbyinoculatinginvivocotyledonsoffouroilseedrapevarietiesona0-9scale.W:Weakpathogenicity:DI＜4，M:Moderatepathogenicity:4≤DI＜6，H:Highpathogenicity:DI≥6-16- 4.2黑胫病对油菜性状及产量的影响4.2.1L.biglobosa对油菜植株性状的影响试验对大田“阳光2009”油菜植株的株高、分枝数、角果数、每角粒数和粒重5项指标进行了统计分析。5项调查指标均随病害级别的升高呈整体下降趋势（图9）。与对照0级健康植株相比，1-2级病害植株5项指标差别不大，数值波动幅度在2%-8%之间，仅角果数为15%。当发病级别达到4-5级时，所有指标值均大幅下降，其中角果数和每角粒数值分别下降41.2%和41.7%。此病害级别的植株特征多表现为植株矮小，分枝少、角果稀瘪，干枯状。由于采样的人为原因可能会导致低病害级别间数值异常波动，但这不影响试验整体结果。图9不同病害级别的油菜植株性状指标变化趋势图4.2.2L.biglobosa对油菜产量的影响-17- 表4不同病害级别对油菜单株产量的影响（单位：g）级别中油821中双11阳光2009平均032.0623.6813.4123.05128.5922.1412.0820.94225.2019.3111.4918.67324.2819.7510.4018.14420.9417.098.2315.42518.05*4.7811.42注：*没有获得样本试验以人工接种(诱发)和大田取样（自然）两种不同方式获得L.biglobosa不同级别的油菜植株产量数据（表4）。试验数据显示：3品种单株平均产量均随病害危害程度的加重而减少（图10），与植株性状指标变化趋势相对应。1-2级病害可造成小于20%的产量损失；4-5级减产超过33%,以5级为重达50.5%。接种试验数据分析，不同级别间产量存在差异，差异达极显著水平（图11）。40.0**36.032.028.0**24.020.016.012.08.04.0012345012345中油821中双11图11产量差异显著性分析4.3药剂防治对黑胫病发病的影响4.3.1不同处理间的发病率和发病指数分析-18- 试验黑胫病发病率调差显示在同处理间不同品种材料的发病情况差异较大，两处理最高发病率为供试1号材料分别为91.28%和89.39%；最低为11号材料分别为14.50%和11.26%。两处理间比较，药剂处理组（X）较未处理组（D）发病率和发病指数均有较大幅度的降低，平均降幅达10.16和3.05（表5）表5药剂处理试验黑胫病发病率及发病指数统计表黒胫病发病率(%)黒胫病发病指数(APDI)品名/处理DXDX191.2889.3926.0727.03264.5052.0820.0810.64371.9359.0523.8918.26443.2553.969.9012.93533.1821.918.154.86652.3337.8812.329.02725.1726.806.326.13869.8157.4918.8815.28945.0620.6010.945.241027.3212.756.973.181114.5011.263.522.951218.466.283.941.421317.739.794.232.621442.8029.5011.496.921533.309.547.552.07注：数据均为试验3次重复数据的平均值4.3.2处理间产量的比较药剂处理较未处理组15份材料的平均产量有较大幅度的提高。从图12看品种间两处的产量差异显著，其中1、2、4和5号材料增幅较大，以2号最大，折合亩产达54kg，增幅50%。增产效果显著。-19- 图12两处理的产量比较-20- 5黑胫病的综合防治策略5.1油菜黑胫病害的预测预报病害的预测预报对病害的防治工作至关重要。病害流行是一复杂的动态过程，可根据其流行规律和相关气象资料、调查经验以及电脑模拟等方法，来预测判断病害在特定时间的发生危害情况，病害预测预报是最有效最环保最经济的防治技术之一。油菜黑胫病由初侵染源病原菌气传孢子侵染开始，由叶片逐渐向茎秆内部侵染造成的。一般认为田间油菜10-20%的植株存在叶片感染，有病版出现时需进行药剂防[67,68]治，并且清除已感染植株或叶片，避免二次侵染。黑胫病的发生严重程度在一定程度上取决于病原菌孢子量释放的多少和侵染条件的好坏。雨水即降雨量影响孢子释放，因此降雨天数和降雨量亦可作为病害发生的预测依据。假囊壳的成熟程度、空气中孢子数量同样也是预测病害的重要依据。5.2化学防治黑胫病的化学防治是减少农作物产量损失最常用的最为有效的手段，但避免不了给环境带来污染。虽然化学药剂防治不能彻底控制病害发展，但在一定程度上可减少作物面临危害的高压力。主要有一下几种处理方法：种子处理在播种以前对种子进行处理对于减少种子带菌传播危害是一种十分有用的措施，可以根除种子的病原菌残留、避免将染病植株带到新的未感染田块，同时还可以防治其他一些土传病害的发生。种子处理不仅可以减少病原菌的传播，还可以使植株获得较长时间的抗性，如种子包衣可以明显减低幼苗的发病率、减轻黑胫病[69,70]的发生程度和提高油菜产量。采用苯并咪挫、二甲酰亚胺等真菌杀菌剂可有效消除种子的病原菌。种子药剂处理方法只适宜于防止病害进入新的无病害区，对于已经受到病原菌侵染的区域，该方法表现无效。叶面喷施叶面使用化学杀菌剂是对抗植株叶部病害的最常用方式，世界许多油[67]菜产区的种植农户均采用叶面喷施药剂来阻止叶片的黑胫病感染。叶面使用杀菌剂[71]在减少植株感染、增加产量方面具有较好的表现。由于黑胫病病原菌子囊孢子和分生孢子主要以空气为媒介进行传播，在整个油菜生育期都有可能侵染植株，因此叶面喷施时期很难把握，同时，在侵染最初的一段时间内，病原菌可能以潜伏状态存在于植株体内。所以，一般认为田间出现感染植株比例20%左右时进行药剂喷施，未获得较好的防治效果，喷施杀菌剂应每5-7天进行一次，2-3次以上。药剂选用高效真菌杀菌剂。秸秆处理残留在秸秆上黑胫病病原菌逐渐发育成熟并释放大量的子囊孢子侵染-21- 下一茬油菜。通过秸秆的化学处理来阻碍孢子的形成或直接杀死病原物可有效降低下[72]茬作物的病害危险。除了真菌杀菌剂多菌灵、苯菌灵以外，还有一些除草剂如草甘膦等也可使黑胫病的假囊壳发育推迟，从而减少子囊孢子释放量。5.3生态控制轮作轮作可能是做适合生产者使用的最经济、最简便易行的预防油菜黑胫病的方法。土壤是多种病虫害生长和栖息的场所，农田长期单一种植模式为相应的病虫害提供了稳定的生态环境，轮作是打破这种稳定环境的积极手段之一。通过轮作提供充[73]足的时间使黑胫病子囊孢子源源不断的从病残体上释放直到秸秆全部降解，减少侵[74]染源数量，达到控制病害发生的效果。黑胫病病原菌在秸秆上一般可成活5年以上，但孢子的释放通常发生在收获后的下一季。轮作时间的长短和气象条件适宜直接影响病原菌降解效果。高温高湿有利于促进秸秆的降解和假囊壳的发育，植株病残体一般[75]会在两年时间内被降解。轮作控制油菜黑胫病应注意其周边田块的轮作情况，常年风向等避免孢子远距离风媒传播而影响轮作效果。隔离黑胫病的的子囊孢子在风力的作用下，可以传播数公里以外。孢子量随着距离的增加呈逐渐减少趋势，因此合适的作物隔离距离可以减少新田块田间病原物的水平，从而可以达到减低病害发生的风险。深耕灭茬清除病残体秸秆是控制黑胫病害流行的有效措施。焚烧秸秆在过去农耕生产控制病害加重中发挥着积极作用。虽然焚烧秸秆的做法比较极端，但可以迅速[76]减少病原物的数量。通常此法处理后的第二年的孢子释放量减少90%以上。焚烧虽可以减少病原物，但也带来了诸多负面影响，不仅造成大气环境污染，也浪费了大量的有机质，因此将病残体秸秆深埋，促使其降解，减少孢子释放，从而达到控制病害[77,78]流行发生的目的。研究表明，秸秆在地表以下比暴露在地表更易被降解。随深埋时间的延长，带菌秸秆上的假囊壳数量会大大减少。调整播期病原菌子囊孢子的释放受时间和自然条件的影响，成熟的假囊壳在雨水湿度合适的条件下会大量释放形成释放高峰期。油菜苗期被认为是最易受病原物侵染的敏感时期。调整播期，避开孢子释放的高峰期，从而达到减少病原物的侵染。但因降雨促进假囊壳子囊孢子的释放与种子萌发通常是同步的，并且由于调整播期而带来的其他不利因数如如推迟播期会影响越冬前壮苗的形成，抗寒能力降低，会造成植株伤害影响产量，也由于假囊壳的成熟时期不一致，在整个油菜生育期都会有子囊孢子的释放，因此调整播期来减少病害侵染效果并不理想。-22- 6结论与讨论6.1黑胫病在我国的发生及分布情况黑胫病是危害世界油菜生产的重要真菌性病害。目前，通过长期的调查发现，黑胫病若侵染性在我国已普遍发生，发生情况因不同地区不同耕作条件而异，发病较高的达到了90%以上，有些发病程度较重，出现一定的病死植株，造成一定的产量损失。通过对采集样本的分离纯化、菌落的形态观察和分子生物学鉴定，明确了我国黑胫病病害的类型为弱侵染性。这与加拿大、澳大利亚等国家的强侵染类型有一定差别，也是我国油菜籽进出口检疫重要对象。致病评估试验显示，不同地区的菌株致病力存在差异，来自不同省份地区的22份菌株有8份表现为高致病力，比例达63.6%。虽然较强侵染型种致病力弱，但仍然具有一定的致病性，这也是在调查病害过程中，部分田块出现病死和危害较重植株的重要原因。6.2黑胫病病原菌对油菜产量及性状的影响通过对黑胫病与油菜性状及产量的研究，进一步分析了不同病害级别植株的产量构成性状表现及产量损失程度，结果显示，角果数、分枝数、角粒数、千粒重和产量均随病害程度的加重而呈现下降趋势。尤其是当病害级别达到4级以上时，植株维管束，纤维组织等均被病菌侵染。植株病斑处茎秆截面约75%以上面积感染变黑，植株水分和矿物质运输受阻，造成各项性状指标大幅减少。相比较而言，病害级别较低的植株则受影响不大，运输系统仍能够提供一定的物质供植株生长，故角果数、角粒数、产量等性状变化不大，这与外国学者的研究结果一致。6.3黑胫病药剂防治对产量的影响及应用效果黑胫病为真菌病害，通过苗期的真菌剂防治，可有效控制病原菌的侵染，减低发病率和危害程度，减少产量损失。但由于黑胫病为气传性病害，病原菌孢子随空气可进行远距离传播。我国采用药剂防治往往是小范围，单户进行的，加上在油菜整个生育期假囊壳都会释放子囊孢子，一旦孢子进入叶片和组织体内，单一的药剂就很难杀灭病原菌。随着农资和劳动力成本的增加，依靠药剂防治黑胫病应用前景不容乐观。6.4黑胫病病原菌变化的预测黑胫病是危害油菜生产的世界性真菌病害。由于其生理小种的多样性，毒力基因的复合和复杂性决定了该病害的危害性。从病害的流行以及小种的变化分析，很多油菜生产国或地区，如波兰，在强侵染型种被发现证实前仅存在该病害的弱侵染型，对油菜的生产影响不大，但随后陆续发现强侵染型种的存在，这一情况与我国目前的状况极为相似，因此加强油菜产区的监测监控，掌握病害的流行趋势，提前做好抗性资-23- 源的储备，耕作栽培、药剂综合防控技术的研究，以及积极防治当前弱侵染型病原菌的扩展流行是预防黑胫病发生的有效措施。-24- 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个人简历荣松柏，男，汉族，1978年10月出生，籍贯，安徽省枞阳县。2001年7月毕业于安徽农业大学农学系。2001年7月在安徽农业科学院作物所参加工作，2006年11月被评聘为助理研究员。现任油料课题组副主任，国家油料改良中心合肥油菜分中心副主任。2001年至2008年，从事农作物品种推广、杂交油菜生产和企业管理工作；2008年参加油菜课题组从事油菜病虫害调查和研究、杂交油菜制种与示范，油菜遗传育种工作等，重点工作油菜黑胫病研究。主要主持与参加的课题有：1、国家油菜产业技术体系病虫害岗位（参与）2、国家油料改良中心合肥油菜分中心（参与）3、油菜减灾避灾关键技术集成与示范（参与）4、863油菜杂种优势利用（参与）5、小卫星和微卫星标记研究油菜菌核病病原菌种群间分子关系（参加）6、高产抗病双低杂交油菜核优56中试与示范（参加）7、油菜根肿病黑胫病综合防治技术研究（参加）8、中国油菜黑胫病菌的鉴定与分布（主持）9、油菜黑胫病菌致病性差异与遗传多样性分析（主持）获2007年度国家技术发明“甘蓝型油菜隐性上位互作核不育三系选育及制种方法”二等奖二级证书；“优质杂交油菜新品种皖油14选育及应用研究”安徽省科学技术一等奖二级证书。发表第一作者论文4篇,撰写安徽省地方标准1套。多次出国访问，学术交流；2014年加拿大阿尔伯特省农业研究中心学习交流6个月。-35-