资源描述：
《纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
？．＇、Ｉ．、＾：．－轉矜．ＪＶｉ．传兵霉诗女公Ａ：：：＾＾妓荀今ｔ秦、％转謂：‘产’＂？、、－４？＾＇拓、单／Ｖ、：；苗爲巧解足七Ｖ卢Ｖ，‘、足‘＾Ｖ－／；：＾．，；互＿类每：胡５２＞＾给端转＿—＿巧手姜位单檢柄巧０姑４护舞＇、－—：巧蒙‘：＇．．－＇＾？二尸’户＇一：．＇－若，；；ｔ，乃７一＇化口．＂．麵Ｗ。．：＇？：心；，鍊巧＾矣斬作舞一六胸、：畫分＇一－＇…‘－又、－＂．一：■－乂＜谱与．Ｈ、今：呼心：．１＃鴻雖户、＇＇－－？、，？＇＇‘‘如＇Ｖｖ听ｒ＇Ｖ．＇－＇４．Ｖ心Ｖ令：Ｔ；；二瓦姑沾Ｔ＼心兴．，．Ｘ片与＿—ｒ占、一．．＇’‘．．＇＇，．－＇？－‘心心心．＜、‘；；Ｖ＇ｖ＞．，ｒ、■，－ｓ—．＼梯又Ｈ＇－＇；ｉ．．．．－－－－．＇．＜：＇＇、．：一；；Ｖ這＇．＞；．．．乂．．知；．＂與；；巧气；键耗苗、一顏產采農ｆ驚攀缓賴‘達顧Ａｖ＇、ｒ、．，Ｖ，＼祭节芝诲；＞．可．，才芝矿綠亡．、＇＾＂．．■－Ｖ－二－＇乂＞＇一皆？、：；嫌全日制硕±专业学位论Ｓ：議議？？＇＜－？作乂＇；：＇Ｓ’／、＾＇＇—＇———：？苗爲心．．又＾．背，：７．！據、－：三典違公ｖ—月、．．‘＇－‘，－？－．？？－．ｒ：－．—、．一＇．、．．：：■．＊■－＇＇＇■．－－，－＇’＇－■ｖ：；，：，；‘＞－．：－．．．；；：－ＲＮＡＪ亚米重组血纳壳聚糖干抚粒复含物体紳制群禽白质巧自＾Ｗ；巧病病奉复制方．；．一＇＝１■，＇＇、乱记：一＼户－－ｍ－＾ａｔｅｒｆＣｈｉｔｓＰｉＡｖＣｉｈ化ｉｉｎｏｍｅｏｏａｎＲＮｅｎｏｍｌｅｘｎｔｓＡｖａｎ种０令；ｐ与诗－ＬｏｉＶｉｒｕ＾ｏｎｖ：譚ｅｕｋｓｓｕｓＳｂｒｏｕＪＲｅａｔｉｉｎｉｏ毅Ｖ＾ｇｐｐ片’扣一心：ｗ声Ｖ／苗ｆｃ‘ＶＩ；，’’．；－：：占寺．，‘；．．．＇％ｖ．—＇知，一馬鱗砖不声、一、Ｗ．…＇－，一．■与－户＾－＇＇－乃、帮、，：ｒＩ義ｒ＇．ｆ－＂＾心减给＇－＊’一．＇＊＇一：文、；衣‘：＾．＜立护：－ｖｒｃ．豕ｒ＼．１乂－邊占＇＇—－Ａ？占－－＇沪－一＂呼－：．！巧名乎雪莲片碱＾：赛－品＾二琴．：冷六相巧＇．、、子－＾．、＇■：户■：ｒ＾，．！．：景乃听苗藝在－為我．、王．’．硕去．．’＂唯：度善；。冀？趨：二．，聲、１．．．ｉ心嘴｜去ｖｙ終Ｔ浴；．其｜；‘转５．／？？．—、＇；＇、非凌．？麵鑛教捧炭简乃再？＼．：和，為业医专业善菩哨＇．．＾．＞ｎ曲觀能托．接論：也记—軒研病理？；究方向：分子褚如／学禹：技‘学动－巧精科学岭禾．：气，；巧礙雜富鱗：城：＇；—导巧师：成戶遂ｆ讓，，；；萌義￡潘寒蘇鄕气蔡義’■、－－－－’．＇＇＾—）－：二＇。立、－－如■气—、：巧护％＜私棲今诗：ｉ苗冷Ｖ＇＂＊－＾巧．气．ｗ４Ｗｙ０１２６６ＢＪ：；＾－’＇－’＇、卢－．－．、？，－：、＇－、二．．．沁二，方疋■鮮ｔ＾．．ＡＶＶ：．＼婷扣’：户，－．緣．‘相若梦：技知１．．．：：知？，；巧处取４識聲Ｖ满、、．足严，／；．媒品；：．ｉｒ游京芝鑽，霧殘芭眞 论文提交日期：2016.04.28论文答辩日期：2016.06.03学位授予日期：2016.06学位类别：兽医硕士答辩委员会主席：吴家强 关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部口或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名；受寺歲立导师签名：巧詩。。日期（备／：Ｖ戸 英文缩略词对照表英文缩写英文名称中文名称ALVAvianLeukosisVirus禽白血病病毒ALV-JAvianLeukosisVirusSubgroupJ禽白血病病毒J亚群CTSchitosan壳聚糖DMEMDulbecco'sModifiedEagle'smedium达尔伯克必需基本培养基dsRNADoublestrandRNA双链RNAEnzymeLinkedImmunoSorbentELISA酶联免疫吸附反应AssayFBSFetalbovineserum胎牛血清LTRLongTerminalRepeat长末端重复序列MLMyloidLeukosis髓细胞性白血病mRNAMessengerribonucleicacid信使RNAngNanogram纳克ntnucleotide核苷酸ODOpticaldensity光密度值PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应RISCRNA-inducedsilencingcomplexRNA诱导的沉默复合物RdRpRNAdependentRNAPolymeraseRNA依赖多聚酶RNaseribonuclease核糖核酸酶siRNASmallinterferenceRNA小干扰RNASUSurfaceprotein表面糖蛋白TMTransmembraneProtein跨膜糖蛋白TEMTransmissionelectronmicroscope透射电镜TPPPentasodiumtripolyphosphate三聚磷酸钠 目录中文摘要.................................................................................................................................IAbstract....................................................................................................................................IV1前言......................................................................................................................................11.1J亚群禽白血病及其防治研究进展...................................................................................11.1.1J亚群禽白血病病毒........................................................................................................11.1.2J亚群禽白血病的预防与治疗........................................................................................21.2基于RNAi技术的核酸药物及其传递系统研究进展.......................................................31.2.1RNAi核酸药物作用机制................................................................................................31.2.2RNAi药物体内传递系统................................................................................................41.3纳米壳聚糖作为RNAi药物载体综述...............................................................................52材料与方法.............................................................................................................................72.1实验材料..............................................................................................................................72.1.1质粒、细菌和病毒...........................................................................................................72.1.2壳聚糖...............................................................................................................................72.1.3主要实验试剂...................................................................................................................82.1.4主要实验仪器...................................................................................................................82.2实验方法..............................................................................................................................92.2.1P-miR-env重组质粒的转化............................................................................................92.2.2P-miR-env重组质粒去内毒素大提..............................................................................102.2.3空白CTS纳米粒的制备................................................................................................112.2.4载P-miR-env重组质粒CTS纳米粒的制备.................................................................122.2.5纳米粒形态学观察及粒径分布、粒径的测定.............................................................122.2.6纳米粒包封率的测定.....................................................................................................122.2.7纳米粒结合性测定.........................................................................................................132.2.8纳米粒对抗DnaseI保护测定........................................................................................132.2.9纳米粒冻干粉的制备.....................................................................................................132.3纳米制剂对鸡感染J亚群白血病病毒体内实验研究.....................................................142.3.1实验动物接种ALV-J病毒和CTS-p-miR-env纳米制剂以及临床症状观察............142.3.2排毒监测.........................................................................................................................14 2.3.3血液学指标.....................................................................................................................152.3.4大体剖检病变观察.........................................................................................................162.3.5组织病理学观察.............................................................................................................162.4统计学方法........................................................................................................................173结果与分析...........................................................................................................................173.1载P-miR-env重组质粒CTS纳米粒的表征....................................................................173.1.1透射电镜法测定纳米粒粒径.........................................................................................173.1.2粒径测量仪测定纳米粒粒径.........................................................................................183.1.3包封率.............................................................................................................................183.1.4结合性.............................................................................................................................193.1.5对抗DnaseI保护测定....................................................................................................193.1.6冻干粉物理性质.............................................................................................................203.2纳米粒体内实验研究结果................................................................................................213.2.1临床症状.........................................................................................................................213.2.2排毒监测.........................................................................................................................213.2.3血液学指标.....................................................................................................................233.2..4血涂片观察.....................................................................................................................243.2.5大体剖检病变.................................................................................................................243.2.6组织病理学症状.............................................................................................................274.讨论.......................................................................................................................................295.结论.......................................................................................................................................32参考文献............................................................................................................................33研究生期间论文发表情况......................................................................................................36致谢..........................................................................................................................................37 山东农业大学全日制硕士专业学位论文中中中文文文摘摘摘要要要J亚群禽白血病是由反转录病毒科的J亚群禽白血病病毒(avianleukosisvirussubgroupJ)引起的以髓细胞瘤和其他细胞恶性肿瘤为特征的传染性肿瘤性疾病。自1988年从鸡中首次分离以来，ALV-J在世界各地鸡群广泛流行。特别是2009年以来，ALV-J在我国一些蛋鸡群中暴发，发病率高达60%，致鸡死亡率超过30%，该病对我国造成的危害很大。由于亚群间各毒株比较相近，但不同遗传特征的病毒引起的不同肿瘤的潜伏期不同，所以目前尚无有效防治J亚群禽白血病的方法；由于ALV-J的垂直传播性、先天感染的免疫耐受鸡是主要的传染源，目前也无可用的疫苗，当前控制J亚群禽白血病的有效措施是净化淘汰为主，因此，RNAi小分子核酸药物在无疫苗的禽白血病病毒防治中具有广阔的前景。本实验室前期针对ALV-JNX0101毒株的env基因中gp85编码区筛选到了siRNA，将筛选到的siRNA置于miRNA骨架结构TM中，人工合成，再将其克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中，构建了p-miR-env干扰表达质粒，体外实验证实p-miR-env干扰表达质粒可有效抑制ALV-J的复制，但其在体内也是否具有相似的抑制效果？这一问题将在本课题中解决。到目前为止，RNAi的导入系统有病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体虽然体外转染效率高，体内作用时间长。但其存在很严重的安全问题，且目的基因容量小，制备复杂，成本高，不能体内反复使用，所以在临床应用上受到了很大的限制。而以纳米粒子复合体等的非病毒基因传递系统，在保持一定转染效率的同时，对其加以修饰，增加体内作用时间，就可以避开临床安全性障碍，加速siRNA药物进入临床治疗。壳聚糖作为唯一天然存在的正电性高分子聚糖，它还具有细胞毒性低、无免疫原性等优点，在体内酶存在下也稳定，可保护所结合基因，又可根据需要程序性降解，且降解产物无副作用。另外，由于动物细胞的平均直径约为10µm，其细胞核的大小通常要小10倍以上，因此，大体积的外来基因载体复合物细胞导入率低，理想的复合物体积应控制在纳米级。根据壳聚糖分子量，脱乙酰基程度以及壳聚糖与基因的用量比等因素可将壳聚糖基因复合体的尺寸控制在100纳米左右，从而顺畅进入动物细胞。此外，在生理条件下其他非病毒类载体会与血清蛋白作用，导致基因传导效率大大下降，而壳聚糖在血清或体液环境中却保留了很高的基因传导效率。因此，纳米壳聚糖在基因递送系统中的应用备受推崇。I 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制鉴于壳聚糖所具有的良好的生物相容性、生物降解性，我们选择实验室筛选到的抑制ALV-J囊膜蛋白基因的p-miR-env重组干扰表达质粒作为干扰靶位点，通过纳米技术制备壳聚糖纳米粒，包被重组质粒，使p-miR-env缓慢释放，并能有效的转染CEF细胞,抑制病毒复制，有望成为控制ALV-J一种新手段。利用本实验室前期制备的P-miR-env重组质粒进行转化，大量制备去内毒素质粒，采用复凝聚法制备CTS-P-miR-env纳米粒。通过透射电镜负染观察纳米粒的形态及大小；粒径分析测量仪测定纳米粒的粒径；微量紫外分光光度计测定CTS-p-miR-env上清中的游离质粒的含量，计算包封率；凝胶电泳法测定纳米粒的稳定性；凝胶电泳法分析纳米粒在胎牛血清中的稳定性。通过体内试验研究CTS-P-miR-env纳米粒在体内抑制ALV-J效果，利用制备好的CTS-p-miR-env纳米制剂进行动物实验，SPF雏鸡分为8组，其中1组为空白对照组；2组为接毒对照组；3组为阴性对照组；4组为CTS-p-miR-env纳米制剂组；5组为裸质粒对照组；6组为CTS-p-miR-env纳米制剂低剂量组；7组为CTS-p-miR-env纳米制剂中剂量组；8组为CTS-p-miR-env纳米制剂高剂量组；采棉拭子检测ALV-Jp27，对其排毒情况进行监测；通过体重称量对比、血液学检测、大体病变观察和组织学病变观察等评估CTS-p-miR-env纳米制剂在体内的抗ALV-J效果。CTS-P-miR-env纳米粒制备结果：（1）成功制备了CTS-p-miR-env纳米粒，经电镜观察发现纳米粒呈球形，形状一致；（2）粒径分析测量仪测定其90%粒径为102nm，平均粒径为88nm；（3）包封率为86%；（4）电泳结果表明CTS-p-miR-env纳米粒性质稳定，能够阻止胎牛血清中Rnase对siRNA的降解，具有保护siRNA的作用。由此可见离子凝胶法可制备粒度分布均匀，形态规则，具有较高包封率的CTS-p-miR-env纳米粒。CTS-p-miR-env纳米粒对siRNA具有酶解保护作用，适合作为基因递送载体。体内实验结果：（1）p27实验结果可以看出接毒组均呈抗原阳性，空白对照组均呈阴性，裸DNA接毒组在20日龄和24日龄出现排毒，纳米制剂中剂量接毒组在28日龄出现排毒，纳米制剂高剂量接毒组未出现排毒，S/P值一直较低；（2）在本实验过程中，ALV-J接毒组白细胞数减少，说明鸡在接毒后病毒对骨髓造血体统产生的危害作用，导致鸡的造血机能下降，从而使白细胞的总数减少，白细胞数量的减少趋势与淋巴细胞百比例的下降趋势相似。裸DNA接毒对照组以及纳米制剂接毒对照组白细胞数量明显高于接毒组，说明其对骨髓的起到保护作用；同时我们也发现纳米制剂II 山东农业大学全日制硕士专业学位论文接毒组由低剂量到高剂量白细胞数量依次增高，而且均高于裸DNA接毒组，说明纳米制剂对机体的保护作用强于裸质粒；（3）大体剖检病变观察可以看出接毒组心脏、脾脏、肝脏、胸腺、法氏囊出现明显萎缩，纳米制剂接毒组由低剂量到高剂量心脏、脾脏、肝脏、胸腺、法氏囊逐渐趋于正常，而且相比裸质粒组效果更好；（4）通过病理组织学观察可以看出，接毒组心肌明显出血、形成淋巴细胞炎性灶；肝脏出现大量淋巴细胞炎性灶；肾脏出血；肺脏充血，间质增宽；脾脏淋巴细胞流失，数量明显减少。空白对照组各组织均正常。裸质粒组与纳米制剂低剂量接毒组出现轻微病变，纳米制剂中剂量与高剂量接毒组跟正常对照组相似。由此看出本实验成功制备的CTS-P-miR-env纳米粒分布均匀，形态规则，具有较高包封率，对siRNA具有酶解保护作用，可有效传递P-miR-env。通过体内实验CTS-P-miR-env具有抑制ALV-J复制作用，而且纳米制剂抑制白血病病毒复制作用优于裸质粒。本研究解决了siRNA稳定性差、粒径小、不易进入靶细胞等问题，为ALV-J和其它病毒病提供了一种新的有效防治途径。关键词：RNAi;ALV-J；CTS-P-miR-env；纳米颗粒；体内干扰III 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制Nanometerofchitosan-P-miRNA-envcomplexinhibitsavianleukosisvirussubgroupJreplicationinvivoAbstractSubgroupJofavianleukosisisadiseasecausedbytheJsubgroupavianleukemiavirus(ALV-J),whichisbelongtotheretrovirus.Since1988,ALV-Jhasbeenwidelyspreadinchickenflocksintheworld.Especiallysince2009,ALV-Jhasbeeninsomelayersinourcountry,theincidencerateisashighas60%,themortalityrateisover30%,whichisveryharmfultopoultryindustry.Becauseoftherelativelyclosegeneticcharacteristicsofdifferentstrains,differentgeneticcharacteristicsoftheviruscausedbydifferenttumors,sofarthereisnoeffectivemethodtopreventandcontrolALV-J.becauseoftheverticaltransmissionofALV-J,theimmunetoleranceoftheinnateinfectionisthemainsourceofinfection,thereisnovaccine.TheeffectivemeasurestocontrolJsubgroupavianleukemiaaretheeliminationofthemainRNAi,andthesmallmoleculenucleicaciddrugshavebroadprospectsinthepreventionandcontrolofthevaccine.ALV-JintheenvgeneofNX0101gp85strainsiRNA,thesiRNAgenewasclonedintothemiRNAframework.Thep-miR-envgenewasclonedintopcDNATM6.2-GW/EmGFP-miReukaryoticexpressionvector.TheresultsconfirmedthattheRNAigenetherapywaseffective,buttheinvivoefficiencyofRNAiwasagreatchallenge.Sofar,theRNAisystemhasaviralvectorsystemandanonviralvectorsystem.Althoughthevirusvectorhashightransfectionefficiencyandlongtimeinvivo.Butithasaveryserioussecurityproblem,andthepurposeofthegeneissmall,andthepreparationiscomplex.Thecostishigh,anditcan'tbeusedrepeatedly,soitislimitedinclinicalapplication.Thenonviralgenedeliverysystem,suchasnanometerparticles,inthesametime,canbemodifiedtoincreasethetimeofbodyfunction,soastoavoidtheclinicalsafetybarrier,andacceleratetheclinicaltreatmentofsiRNAdrugs.Chitosanastheonlynaturallyoccurringpositivelychargedpolymerchitosan,italsohaslowcelltoxicity,noimmunogenicity,etc.,inthepresenceoftheenzymeinvivoisstable,protectioncombinedwithgene,andaccordingtotheneedsoftheprocessofdegradation,anddegradationproductswithoutsideeffects.Inaddition,becausethediameteroftheanimalcellisaboutthesizeofthenucleusisusuallysmallerthanthatofthelargevolumeofforeigngenevectorcomplexcells,theidealcompoundvolumeshouldbecontrolledatthenanometerlevel.Accordingtothemolecularweightofchitosan,thedegreeofchitosanandtheamountofchitosanandgene,thesizeofthechitosangenecomplexcanbecontrolledtoafewhundrednanometers,andthustheanimalcellissmooth.Besides,underphysiologicalconditions,othernonviralIV 山东农业大学全日制硕士专业学位论文loadsandserumproteins,whichleadtotheefficiencyofgenetransferefficiency,andchitosanintheserumorbodyfluidenvironmenthaskeptaveryhighgenetransductionefficiency.Therefore,theapplicationofchitosaningenedeliverysystemishighlypraised.Inviewofthegoodbiocompatibilityandbiodegradationofchitosan,wechoosethep-miR-envrecombinantplasmidtargetingALV-Jgene,whichcaneffectivelyprotectALV-JfromsiRNAcellsandcaneffectivelyprotecttheCEFcellsandprovideanewexplorationforthetreatmentofavianleukemiavirus.Itcaneffectivelyprotectthevirus.UsingourlaboratorypreparationofP-miR-envrecombinantplasmidtransformation,tolargeendotoxin,adoptingcompoundcondensingpreparedCTS-P-miR-envnanoparticles.Bytransmissionelectronmicroscopy(sem)negativedyeingobservationnanoparticlesmorphologyandsize;Particlesizeanalysismetermeasuringnanoparticlessize;TraceultravioletspectrophotometerdeterminationofCTS-p-miR-envsupernatantofthecontentoffreeplasmidcalculatecoatingrate;Gelelectrophoresismethodfordeterminingthestabilityofnanoparticles;Gelelectrophoresismethodtoanalyzethestabilityofnanoparticlesinfetalbovineserum.ThroughtheexperimentalstudyinCTS-pDNAnanoparticlesinALV-Jvirusinfectionchickenbodyinfluencestheeffectsofviralreplication,usethepreparationofgoodCTS-p-miR-envnanopreparationinanimalexperiments,SPFchicksweredividedinto8groups,onegroupastheblankcontrolgroup;Twogroupstotakepoisoncontrolgroup;Threegroupsofnegativecontrolgroup;FourgroupsofCTS-p-miR-envnanopreparationgroup;5groupsofnakedplasmidcontrolgroup;6forCTS-p-miR-envnanopreparationlowdosegroup;7forCTS-p-miR-dosegroupinenvnanopreparation;8forCTS-p-miR-envnanopreparationhighdosegroup;PickingcottonswabsdetectALV-Jp27,todetoxifytheconditionmonitoring;Throughthecomparisonandhematologydetection,grossweighttoweighdiseaseassessmentsuchasobservationandhistologicalobservationCTS-p-miR-envtheantiviraleffectofnanopreparationinthebody.CTS-P-miR-envnanoparticlepreparationresults:(1)thesuccessfulpreparationoftheCTS-P-miR-envnanoparticles,theelectronmicroscopefoundthatnanoparticlesarespherical,shapeisconsistent;(2)particlesizeanalysismeasuringinstrumenttodeterminetheparticlesizeof90%for102nm,theaverageparticlesizeis88nm;(3)coatingatarateof86%;(4)electrophoresisresultsshowedthattheCTS-p-miR-envnanoparticlesstableproperties,canpreventfetalbovineserumRnasedegradationofsiRNA,protectiveeffectofsiRNA.Thusiongelmethodtothepreparationofuniformparticlesizedistribution,shaperules,hasahigherrateofcoatingCTS-p-miR-envnanoparticles.CTS-p-miR-envprotection,nanoparticlesofsiRNAwithenzymesolutionforgenedeliveryvectors.V 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制Theresultsofvivoexperiment:(1)p27experimentalresultsshowedthegroupofinoculationwereantigen-positive,thecontrolgroupwerenegative,nakedDNAinoculationgroupshowedtheariseofdetoxificationisin20daysand24days,Nanoformulationdoseinoculationgroupsappearedin28daysdetox,high-doseformulationofnano-inoculationgroupdoesnotappeareddetoxification,S/Pvaluehadbeenlow;(2)inthepresentexperiment,thenumberofwhitebloodcelloftheALV-Jinoculationgroupreducedandindicatedthatthevirusmadeharmfuleffectsonthebonemarrowhematopoieticsystemleadingthedecliningofthefunctionofthechickenhematopoietic,therebyreducingthetotalnumberofwhitebloodcells,thedecreasingtrendofwhitebloodcellandthedecreasingtrendofthelymphocyteratioissimilar.thenumberofwhitebloodcellofnakedDNAinoculationcontrolgroupandnanoformulationsinoculationcontrolgroupwassignificantlyhigherthaninoculationgroup,indicatingtheprotectiveeffectonbonemarrow;Wealsofoundthatnano-formulationinoculationgroupconsistingofhighdosetolowdosefollowedbythenumberofleukocytesincreased,andwerehigherthannakedDNAinoculationgroup,indicatingtheprotectiveeffectofnanoformulationsofthebodyisstrongerthannakedplasmid;(3)ltiscanbeseenthattheheart,spleen,liver,thymus,fabriciusofinoculationgroupatrophysignificantlytroughgrossnecropsylesions,theheart,spleen,liver,thymus,bursaofnano-preparationinoculationgroupfromlowdosestohighdosesofgraduallybecomenormal,butbettercomparedtonakedplasmidgroup;(4)itiscanbeseenthatmyocardialofinoculationbleedsobviously,lymphocyteinflammatoryforms,alargenumberoflymphocytesinliverinflammatoryforms;renalhemorrhage;lungcongestion,interstitialwidened;thespleenlymphocytesloss,thenumberreducedsignificantly.Thetissueoftheblankcontrolgroupwasnormal.Itshowedminimalchangeinnakedplasmidgroupandlowdoseinoculationgroupofnanotechnologyformulation,nano-doseandhigh-doseformulationinoculationwithnormalcontrolgroupweresimilar.Fromthat,thisexperimentwassuccessfullycompleted.Morphologyshowedahigherrateofcoating.siRNAhasaprotectiveenzymesolution.Fitforasagenedelivelyvector.Throughtheexperimentinvivop-mir-env,recombinantexpressionplasmidhastheinhibitoryeffortofleukemiavirusreplication.Nanopreparationandinhibitoryreplication.Nanopreparationandinhibitoryeffortofleukemiavirusreplicationisbetterthanthatnakedplasmid.TheresearchsolvedsiRNAtheproblemsuchaspoorstability,particlesizesmall,noteasytoenterthetargetcells,andothervirusforitprovidesaneweffectpreventionandtreatment.VI 山东农业大学全日制硕士专业学位论文Keywords:RNAi;ALV-J;CTS;Nanoparticles;Celltransfection;InvivointerferenceeffectsVII 山东农业大学全日制硕士专业学位论文1前前前言言言1.1J1.1J亚群禽白血病及其防治研究进展1.1J亚群禽白血病及其防治研究进展亚群禽白血病及其防治研究进展亚群禽白血病及其防治研究进展1.1.1J1.1.1J亚群禽白血病病毒1.1.1J亚群禽白血病病毒亚群禽白血病病毒亚群禽白血病病毒禽白血病病毒跟其他反转录病毒科的成员一样，其最主要的特征是病毒粒子中有反转录酶，即含有依赖RNA的DNA多聚酶，它的主要作用为在病毒复制过程中把病毒基因组整合到宿主细胞基因组中的前病毒DNA，从而利用宿主细胞进行病毒的包装复制（Fauquetetal.，2005）。根据病毒囊膜糖蛋白特性、基因组特征、宿主范围以及交叉中和实验等，常见禽白血病病毒分为A-J十个亚群（ALV-A~J）（SaifY.M.，2012）。其中A-E、J亚群六个亚群来源于鸡，E亚群为内源性病毒，不产生感染性病毒粒子，其他5个亚群为外源性病毒。感染鸡的6个亚群病毒都不是复制缺陷型病毒，即病毒基因组中都不携带致癌基因。五个亚群的外源性禽白血病病毒（ALV-A、B、C、D、J）能够诱发肿瘤，内源性禽白血病病毒病毒（ALV-E）则没有致瘤性。J亚群禽白血病病毒主要诱发淋巴细胞性白血病和髓细胞性白血病，其他外源性的病毒主要诱发淋巴细胞性白血病。在自然病例中A、B、J三个亚群的病毒常见，较少见到感染C、D亚群禽白血病病毒的报道（赵振华等，2005）。其中ALV-J是发现最晚的一个病毒亚群，是由Payne等在1991年报道发现的新病毒（PayneLNetal.，1991），针对分离的J亚群原型株HPRS-103做了深入研究，奠定了ALV-J的研究基础（Payne，1999；PayneLN，GillespieAMetal.，1992）。其中我国首先由赵振华、杜岩于1999年分别在内蒙古和江苏的肉鸡群中发现髓细胞性白血病（赵振华等，1999；杜岩等，1999），随后刘思当、婓鸣等分别在山东、宁夏等地区也发现该病（刘思当，2001；斐鸣，2001）。崔治中、杜岩等首先报道从宁夏肉鸡髓细胞白血病病例中分离到ALV-J（杜岩等，1999），开始了对病毒的研究。最初发现ALV-J时主要感染肉种鸡，后续报道中显示也可感染蛋鸡和我国的地方种鸡（徐镔蕊，2002；成子强，2005），不仅引起髓细胞瘤，还引起血管瘤淋、纤维肉瘤和巴细胞瘤等多种肿瘤（成子强等，2009；VenugopalK，2000），同时也造成机体严重的生长抑制、免疫抑制，成为危害养禽业重要疫病之一。近几年，我国J亚群禽白血病的报道较多，是危害我国养禽业的主要禽白血病亚群（崔治中，2015；柴家前等，2009）。1 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制1.1.2J1.1.2J亚群禽白血病的预防与治疗1.1.2J亚群禽白血病的预防与治疗亚群禽白血病的预防与治疗亚群禽白血病的预防与治疗J亚群禽白血病病毒自发现以来，宿主范围不断的扩大，不仅感染肉鸡，而且逐渐感染蛋鸡群甚至是地方种鸡群（成子强等，2005）；致瘤性增强、致瘤谱扩展，不仅引起髓细胞瘤，还可以引起成红细胞瘤、淋巴细胞瘤（姜艳萍等，2011）；除了肝脏、肾脏、脾脏等主要脏器肿瘤外，还有血管瘤、骨癌、纤维肉瘤、肠系膜肿瘤、卵巢癌等新发现肿瘤灶（蔡黎明，2013）。而且，ALV-J攻击机体的免疫系统，造成免疫能力降低，混合感染、继发感染的鸡群病例报道屡见不鲜，加上ALV-J本身具有高度变异的特性，给疾病的诊断防控带来了极大的难度。在疾病的诊断治疗方面，为了增加判断的准确性，常采用多种方式结合综合确诊。对于发病病例，首先根据发病情况，结合ALV-J的临床表现和流行病学可以做出初步的判断，然后结合病原学和血清学实验、病理组织学、基因组测序以及病毒的分离鉴定等实验室检测手段进行确诊。同时，注意与其他肿瘤性疾病进行区别，如鸡马立克氏病、网状内皮组织增生症的鉴别；注意继发感染、混合感染的病例，伴发其他疾病时，注意ALV-J会攻击宿主免疫器官的主因，从而采取有效的防控措施。血清学检测同样有针对亚群特异性区域gp85片段的商品化的试剂盒（IDEXX）甚至是胶体金快速检测试纸条（王言明，2014），极大的方便了临床检测。对于病原学检测，一般采用商品化的试剂盒（IDEXX），利用棉拭子检测病毒群特异性抗原p27。对于病毒的分离和鉴定，常采用ELISA实验、间接免疫荧光实验、补体结合实验或者免疫细胞化学技术等，基于病毒核酸基因组进行PCR扩增测序和检测的核酸杂交等检测。禽白血病在世界和我国历史已久，自20世纪90年代以来，ALV-J的发现和传播给我国养禽业，特别是蛋种鸡、肉种鸡以及地方种鸡造成了严重的危害。到目前为止，众多专家致力于ALV-J的研究，但尚无有效治疗禽白血病的药物，也没有研制出有效预防的疫苗，给ALV-J的防控带来了很大的难度，引起了有关部门及畜牧兽医行业的高度重视。鉴于疾病的流行发生情况，需采取切实科学的综合措施控制本病，主要采取种禽种鸡厂的净化，大型企业选择引进没有禽白血病病毒感染并且具有遗传抵抗力的种蛋、种鸡（种公鸡、种母鸡），全面提高种鸡的免疫抵抗力，强化孵化场、养殖场的卫生管理制度，还要加大研发力度，继续开展防治ALV-J的药物或者疫苗的研究（赵振华，2005）。目前，国内外主要采取控制传染源、切断传播途径等方面净化种鸡厂，建立无白血病的“SPF”级健康鸡群。借鉴国外净化禽白血病的主要两个途径：第一种途径是2 山东农业大学全日制硕士专业学位论文针对种母鸡，挑选ALV抗体、抗原均阴性或者抗体阳性、抗原阴性的母鸡，挑选健康无白血病病毒感染的鸡群，降低病毒感染的可能。一些种禽公司仅采用这种方式，虽然一定程度上降低了鸡群的感染率，但效果不够理想（SaifY.M.，2012）。第二种途径是全面考虑净化病毒，不仅从母鸡，还要从雏鸡、种蛋、鸡胚几个方面入手（赵振华，2005），主要检测蛋蛋清、棉拭子等群特异性抗原。Spencer等先后建立了一系列禽白血病病毒的根除计划，取得了较好效果。一般采用多种检测方法综合检测，可以有效提高ALV阳性检测率。我国主要都采用羽-琼法进行检测(吴彤等，1991)。生产中通过检测净化鸡群后，有效降低了ALV-J的死淘率。1.21.2基于1.2基于基于RNAi基于RNAiRNAi技术的核酸药物及其传递系统研究进展RNAi技术的核酸药物及其传递系统研究进展技术的核酸药物及其传递系统研究进展技术的核酸药物及其传递系统研究进展RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是通过内源性或者外源性双链RNA(doublestrandRNA，dsRNA)的介导，和与其序列互补的mRNA特异性结合，使mRNA降解或终止mRNA的表达，造成基因功能的缺失，因此过程发生在转录后，所以是一种转录后引起基因沉默(post-transcritionalgenesilencing，PTGS)的现象（吴锦银，2006）。其中RNAi广泛存在于生物中，是生物抵抗外来DNA的一种保护机制，帮助细胞抵抗病毒的修复损伤、感染及高效、特异的调节基因的表达（袁克华，2009）。目前，RNAi是一种简单有效的分子生物学工具，多用于基因功能的研究，在基因敲除、基因表达、肿瘤治疗调控等的研究中被广泛应用，而dsRNA也可以通过化学合成、病毒载体或质粒的表达等方法获得，进一步利用RNAi工具研究基因功能的和治疗疾病。1.2.1RNAi1.2.1RNAi核酸药物作用机制1.2.1RNAi核酸药物作用机制核酸药物作用机制核酸药物作用机制随着RNAi研究不断深入，且在多种物种中都有RNAi的出现，现已基本阐明其大致的模型，这也是近年来研究人员普遍认为，最有可能的作用机制，分为三个过程：起始阶段、效应阶段和扩增和扩散阶段。(1)起始阶段在这一阶段，靶mRNA在细胞质中被特异性切割。dsRNA通过转基因、外源导入或者病毒感染等方式进入细胞，进入细胞后与RNAi核酸酶一种ATP依赖酶结合，在酶的催化作用下及一系列蛋白复合物介导作用下，逐步剪切dsRNA成长约21-23bp的小片段dsRNA，在转录、翻译水平对与之具有相同序列同源性的基因的表达进行调控。dsDNA在被切割成siRNA时，还有RNaseⅢ的参与，称其为Dicer。Dicer是具有高度保守性，分子量为220kD，特异性识别外源导入或转基因等以各种方式进入到细胞内的dsRNA，并将其切割成19－21bp的siRNA，其有一个3 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制dsRNA结合区域和两个催化RNAseⅢ的区域和一个piwi-ar-gonaute-Zwille(PAZ)交互作用区域(Kettingetal,2003)。BernsteinE于2003年在烟草、线虫、果蝇的细胞中发现种属dsRNA被加工成特定长度的siRNA(Bernsteinetal,2003)。(2)效应阶段RNAi核酸酶的复合体与生成的siRNA结合形成复合物，并称其为RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)(Bensteinetal,2001)。在ATP作用下，siRNA开始解旋，250kDa的前体RISC转变为l00kDa的RISC活体形式，siRNA识别与其同源的mRNA，通过碱基互补配对的原则，与其特异性结合，与mRNA特异性结合的一段dsRNA切割下来，然后内源性mRNA以复合物siRNA为模板，反义链与同源mRNA结合，解离有义链，降解mRNA，RNAi核酸酶被释放，并且这一过程不断重复，特异性降解另一个对应的mRNA(Kamathetal,2001)。(3)扩增和扩散阶段在研究dsRNA对秀丽新小杆线虫的作用时发现，微量的dsRNA也会使RNAi的作用遍及整个机体，且对下一代也有此效应，这种现象也会在植物中发生。通过对RNAi的不断研究发现，细胞内RNA依赖多聚酶(RNAdependentRNAPolymerase，RdRp)以siRNA为引物，以靶mRNA为模板，首先延伸生成dsRNA，在Dicer酶的辅助下被切割，降解生成次级siRNA，次级siRNA又可进人合成、切割的循环过程，由此便放大了siRNA的作用，这种循环过程被称为“随机降解性PCR”(randomdegradativePCR)（Lipardietal,2001）。线虫和植物中传递性RNAi(transitiveRNAi)的发现也证明了RdRp扩增RNAi的信号。当某一个siRNA与mRNA的某一位点特定结合后，还会检测该mRNA的其他siRNA靶向位点，产生其他靶向其它序列的siRNA，放大RNAi的范围和影响。在植物中，除了有RNAi的放大现象外，还存在系统性的传递过程，即RNAi的效应可由细胞传递到组织间。dsRNA和siRNA是通过细胞桥传递沉默信号在细胞间可能是，通过脉管系统使沉默信号可以长距离的传送。Fein-beri在研究秀丽新小杆线虫细胞中的RNA干扰效应时，在其细胞膜上发现了SID-1跨膜蛋白，其可以介导dsRNA从细胞里转运出来，这种现象也从一方面说明了体现了RNAi系统性的传递过程。介导RNAi传递的编码Sid穿膜蛋白的相关基因也在哺乳动物的细胞中表达，这种现象的出现，也可以说明这种机制在哺乳动物中可能存在。1.2.2RNAi1.2.2RNAi药物体内传递系统1.2.2RNAi药物体内传递系统药物体内传递系统药物体内传递系统目前，研究表明，可以采用直接注射的办法，比如将裸质粒DNA直接注射到机体的肌肉、皮肉、皮下、粘膜、静脉内等，该方法简单易行。使用裸DNA是目前认4 山东农业大学全日制硕士专业学位论文为最为安全简单的基因治疗方法，常用的输送方式有电穿孔和快速大容量注射。电穿孔常用于局部组织的DNA输送，以骨骼肌稍多(付爱玲，2009)。快速大容量注射是首次由Liu等进行研究报道的，其通过快速大容量注射向小鼠体内输送裸DNA(LiuF，1999)。虽然裸DNA输送己经能够得到较好的表达效果，但是仍存在着表达效率低和维持时间短的缺点。有动物实验研究表明，通过注射裸DNA在肝实质细胞中高效表达，1个小时后便出现肝细胞恢复现象，6个小时后受破坏的细胞被清除，24小时后肝脏结构和功能己恢复正常（DavidP.，2006)。为了进一步提高DNA的表达效率，可以通过使用载体来包裹或者结合基因药物形成复合体系，再将它们一起注射到静脉内，由血液循环运输至靶组织。基因载体有非病毒载体和病毒载体两种，虽然病毒载体转染效率高，但存在着极大的潜在危险，因此，人们把目光集中于非病毒载体，非病毒载体是一种良好的基因载体材料，具有良好的生物相容性，以及对基因有一定的保护作用。天然多糖类材料由于具有生物相容性好、毒性低，并具有良好的表面修饰结构，可明显延长质粒在体内的保留时间，减少被吞噬细胞吞噬，增加药物疗效，因而越来越得到人们的青睐。近几年来，利用壳聚糖、海藻酸盐、普鲁兰多糖、透明质酸等天然高分子多糖及其衍生物作为纳米基因载体的研究得到广泛关注，其中尤以壳聚糖形成的纳米基因载体的研究最为热点(赵雪等，2006)1.31.3纳米壳聚糖作为1.3纳米壳聚糖作为纳米壳聚糖作为RNAi纳米壳聚糖作为RNAiRNAi药物载体综述RNAi药物载体综述药物载体综述药物载体综述核酸干扰作为一种简便有效的研究工具正得以广泛应用，而其对靶向药物研发的影响更是前景广阔。核酸干扰在分子生物学中扮演多重角色，其中，研究最为深入的是通过信使RNA分子的靶向识别和剪切而达到抑制基因表达。而我国目前核酸干扰药物的研发仍然处于临床前阶段。壳聚糖是自然界中唯一的碱性多糖，不溶于水，可溶于醋酸和无机酸等稀酸溶液。其化学名称为聚葡萄糖胺，是由线性聚合物甲壳质经脱乙酞反应后的产物。甲壳素是一种天然高分子化合物，自然界中，甲壳质广泛存在于低等生物菌类，藻类的细胞，节支动物虾、蟹、昆虫的外壳，软体动物(如鱿鱼、鸟贼)的内壳和软骨，高等植物的细胞壁等，甲壳素每年生命合成资源可达2000亿吨，是地球上仅次于植物纤维的第二大生物资源，是人类取之不竭的生物资源（金征宇，顾正彪，童群义等.2008）。甲壳素结构式中糖基上的N一乙酞基大部分被去掉的话，就是甲壳素的最为重要的衍生物一一壳聚糖，脱乙酰度是用来表征壳聚糖大分子链中伯氨基含量5 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制的，脱乙酰度大于85%的壳聚糖称为高脱乙酰度壳聚糖，含有大量的伯氨基。伯氨基在偏酸性条件带正电荷，能够很好地吸附DNA或RNA，而且伯氨基具有结合氢离子的能力，因此壳聚糖具有一定的缓冲能力，能够帮助壳聚糖逃离内小体（乌通恩;王萍亚;夏森.2003）（高娴;马世坤;陈斌.2008）（Koping-HoggardM;TubulekasI;GuanHetal.2001）Ishii等研究了壳聚糖//DNA传递系统进入细胞的机制，他们认为是壳聚糖/DNA传递系统先吸附在细胞表面后通过内吞作用被细胞所吸收，由于溶酶体及复合物膨胀使内涵体裂解而逃离了酶的消化，然后转移至细胞核参与表达（IshiiT;OkahataY;SatoT.2001）关于壳聚糖的性质对传递系统性能的影响的研究也有所涉及。Gao等分别选用了145kDa和21kDa两种不同分子量的壳聚糖作为DNA载体，发现要达到阻滞DNA电泳的相同效果，低分子量壳聚糖(HMWC)比高分子量壳聚糖(LMWC)需要更大的N/P摩尔比(壳聚糖的氨基和DNA的磷酸基之比)，认为原因是HMWC具有更高的电荷密度，对DNA的浓缩效率更高（GaoS.Y;ChenJ.G;XuX.R.2003）。Kim等为了提高壳聚糖在水溶液中的稳定性，以水溶性壳聚糖作为研究对象，发现在壳聚糖浓度较低(N/P摩尔比较小)时DNA容易发生自我聚集，在壳聚糖浓度较高(N/P摩尔比较大)时容易发生壳聚糖的自我聚集（KinT.H;ParkLK.2004）。近年来，随着纳米技术的发展，由于纳米颗粒具有特殊的表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应，由此而建立的非病毒纳米基因载体系统利于实现靶向输送、控制释放、保护和稳定被输送物质，并且还具有不易被机体网状内皮细胞清除，通过增加渗透和滞留效应增强靶组织累积等优势，进一步拓宽非病毒载体介导的DNA传递系统在基因治疗方面的临床应用。基于纳米颗粒的基因载体相对于传统的载体所具有的优越性是由于当聚合物微粒达到纳米级数量后，分子的特性会发生很大的变化，主要表现在表面效应和体积效应方面，表面效应指超细微粒的表面原子数和总原子数之比随着粒径变小而急剧增大，表面原子的晶场环境与结合能与内部原子不同，因缺少相邻原子而呈现不饱和状态，具有很大的活性，表面能大大增加，易与其他原子结合变稳定，体积效应是由于超微粒子包含的原子数减少而使带电能级间歇加大，能级间歇的不连续而发生异常，因此，纳米载体比表面积激增，粒子上的官能团密度和选择性吸附能力变大，达到吸附平衡的时间缩短，载体胶体稳定性显著提高，这样，一个纳米颗粒载体可以包含大量6 山东农业大学全日制硕士专业学位论文的DNA或RNA,而且，稳定性高，提高了基因进入受体细胞的几率（肖苏尧.2007）（毛建平;毛秉智.2004）（付桂英.2005）。纳米颗粒的性能主要受载体材料和制备工艺的影响，壳聚糖是一类能够静电吸附DNA的天然多糖物质，其作为基因载体材料除了本身带有正电荷外，还能够进行反应调控得到不同的分子量和水溶性。而基于壳聚糖的纳米系统的制备工艺主要包括壳聚糖溶液的pH值，壳聚糖所带正电荷和DNA所带负电荷之间的摩尔配比，即N/P摩尔比。壳聚糖与DNA进行静电吸附后的颗粒控制在医学纳米级别己经不成问题，在目前的研究中，壳聚糖/DNA传递系统的平均颗粒粒径范围主要在100-300nm（JayaKumarR.2010），基本上可以满足体外细胞转染的要求，但是进行体内的组织细胞转染还需进一步的研究，特别是有关材料的性质与制备工艺对DNA传递系统的粒径和稳定性能的影响。尽管针对RNAi技术的载体给药途径的研究取得了一定的突破和进展，但要使得siRNA分子成功应用于生物体内，并成为常规途径，仍有一些关键性问题需要解决，今后研究的重点仍是发展可被临床广泛应用的siRNA制剂及方便、高效、靶向性强的给药途径。2材料与方法2.12.1实验材2.1实验材实验材料实验材料料料2.1.2.1.12.1.111质粒质粒质粒、质粒、、、细菌和病毒细菌和病毒细菌和病毒细菌和病毒重组质粒P-miR-env（带壮观霉素抗性和EGFP增强性绿色荧光蛋白表达基因）实验室前期构建；感受态大肠杆菌DH5α购自于北京华越洋科技公司；DH-1细胞由扬州大学秦爱建教授馈赠；ALV-J宁夏分离株NX0101为山东农业大学崔治中教授馈赠，为2002年分离自宁夏的患髓细胞瘤病的肉鸡群。2.1.2.1.22.1.222壳聚糖壳聚糖壳聚糖壳聚糖壳聚糖(mediummolecularweight,deacetulationdegree>80%，CN:448877)购于美国Sigma-Aldrich公司。7 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制2.1.2.1.32.1.333主要实验试剂主要实验试剂主要实验试剂主要实验试剂表1主要实验试剂Table1mainexperimentalreagents中文名称英文名称来源ResistanceofALV-j抗ALV-J单克隆抗体本实验室研制monoclonalantibodies壳聚糖ChitosanSigma公司Pentasodium三聚磷酸钠国药集团化学试剂tripolyphosphate（TPP）冰醋酸Glacialaceticacid国药集团化学试剂Fetalbovineserum胎牛血清（FBS）去离子水Deioniaedwater实验室自配Phosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液实验室自配（PBS）重组质粒P-miR-env实验室构建ELISA试剂盒ELISAkits美国IDEXX公司脂质体转染试剂Lipofectamine2000Invitrogen公司低熔点琼脂糖LowmeltingpointagaroseTaKaRa公司DNA标记DNAMarkerDL2000TaKaRa公司SYBRGREENI荧光定量Fluorescencequantitative杭州博日生物技术有PCR试剂盒PCRkit限公司Toendotoxinplasmid去内毒素质粒大提试剂盒Omega公司extractionkit壮观霉素spectinomycinSigma公司2.1.2.1.42.1.444主要实验仪器主要实验仪器主要实验仪器主要实验仪器8 山东农业大学全日制硕士专业学位论文表2主要实验仪器Table2Mainexperimentalinstrument仪器名称生产厂家恒温磁力搅拌器金坛市杰瑞尔电器三洋超低温保存箱日本三洋电器集团HealForce二氧化碳培养箱力康发展有限公司高速台式冷冻离心机长沙湘仪离心机微量紫外分光光度计天根生化科技公司MK3型酶标仪赛默飞世尔Thermo恒温摇床上海申能博彩公司恒温恒湿箱上海博迅公司超净工作台上海博迅公司立式压力蒸汽灭菌器上海博迅公司PCR仪太仓华利达实验设备移液枪太仓华利达实验设备凝胶成像系统北京君意公司核酸电泳仪北京六一仪器数显超纯水机上海摩勒科学仪器数显恒温水浴锅国华电器有限公司电热恒温鼓风干燥箱上海圣科仪器设备PH计赛多利斯（Sartorius）透射电镜济南微亚粒度分析仪济南微纳颗粒仪器2.22.2实验方法2.2实验方法实验方法实验方法2.2.1P2.2.1P-2.2.1P---miRmiRmiR-miR---envenvenv重组质粒的转化env重组质粒的转化重组质粒的转化重组质粒的转化（1）取出DH5α，置于冰水中，在超净台中，每管中加1-2µL(10µL或体积中所含量应不超过50ng)重组质粒DNA，混匀，冰浴中放30-40min；（2）将转化管放42°水浴，严格计时90s（不要摇动）；（3）之后迅速将管转移到冰上，放置2-3min；（4）拿至超净台，加入900μLLB液体培养基，37°振荡45-60min，9 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制（5）3000r离心2min，（拿至超净台）弃去500μL，剩余重悬，然后涂布于壮观霉素抗性的平板上，37°培养40分钟后，倒置培养16h；（6）次日，超净台挑取单菌落，（先画出单个的菌落，取2个试管，每管加5ml液体LB培养基+5μL的壮观霉素，用镊子夹最小号针头挑菌，放入试管中）置于试管中，37°摇菌6-10h，（浑浊即可）（7）小摇6-10h后，转入锥形瓶中大摇（1:50）约14-16小时即可大提质粒。2.2.2P2.2.2P-2.2.2P---miRmiRmiR-miR---envenvenv重组质粒去内毒素大提env重组质粒去内毒素大提重组质粒去内毒素大提重组质粒去内毒素大提（1）柱平衡步骤：向吸附柱CP6中(吸附柱放入50m1收集管中)加入2.5ml的平衡液BL，8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(用平衡液处理过的柱子最好立即使用)。（2）取100ml(根据培养菌体的浓度选择合适的量，低拷贝推荐用200ml)过夜培养的菌液加入离心管，室温8000rpm离心3min收集细菌，尽量吸除上清。注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，菌液量以能够充分裂解为佳，菌液过多会导致裂解不充分从而降低质粒的提取效率。（3）尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。（4）向留有菌体沉淀的离心管中加入8ml溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解效果，导致提取量和纯度偏低。对于低拷贝质粒，加大菌体用量的同时按比例增加P1，P2，P4的用量。（5）向离心管中加入8ml溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，室温放置5min注意：温和地混匀，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。（6）向离心管中加入8ml溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min左右。8000rpm离心5-10min，使白色沉淀离至管底(可适当增加离心时间)，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中(请避免倒入大量沉淀而阻塞过滤器)，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50ml的管中。10 山东农业大学全日制硕士专业学位论文注意：加入溶液P4后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果离心后倒入过滤器CS1中的溶液有白色沉淀也不会影响过滤。如果菌体过多(>100m1)，推荐延长离心时间至20-30min（7）向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇(加入异丙醇过多容易导致RNA污染)，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中(吸附柱放入50ml收集管中)。注意：过滤后滤液会损失，根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇。吸附柱CP6的最大容积为15ml，所以需要分2次过柱。（8）室温8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中。注意：将第7步中所得溶液分2次过柱，每次均按以上条件操作。（9）向吸附柱CP6中加入10ml漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，8000rpm离心2min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（10）重复操作步骤9。(11)向吸附柱CP6中加入3ml无水乙醇，室温8000rpm离心2min，倒掉废液。(12)将吸附柱CP6重新放回收集管中，8000rpm离心5min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP6开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。（13）将吸附柱CP6置于一个干净的50ml收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2ml洗脱缓冲液TB，室温放置5min，然后室温8,000rpm离心2min。将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5ml离心管，-20℃保存。（14）检测质粒浓度以及OD值并做好记录。2.2.32.2.3空白2.2.3空白空白CTS空白CTSCTS纳米粒的制备CTS纳米粒的制备纳米粒的制备纳米粒的制备首先用复凝聚法制备CTS纳米粒子（1）1mg/mLTPP溶液的配制:取TPP100mg，溶于100mL蒸馏水，液体充分溶解后，用0.22μm微孔滤膜一次性针头式滤器过滤后，置于无菌小瓶，4℃冷藏保存。11 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制（2）2mg/mL壳聚糖醋酸盐溶液的配制:由于壳聚糖的难溶解性，先将0.2g壳聚糖溶于0.1mol/L的冰醋酸溶液50mL中，常温搅拌12小时，观察待壳聚糖完全溶解后，用0.1mol/L的醋酸钠溶液调节pH值至5.5，两液体总量为100mL。用0.22μm微孔滤膜一次性针头式滤器过滤后，置于无菌瓶中，常温储存。（3）50mL0.1mol/L的冰醋酸溶液配制:0.3g冰醋酸稀释至刻度（在烧杯中加入少量水，以免挥发）。（4）0.1mol/L的醋酸钠配制：8.2g乙酸钠定容至1L既得。(5)空白CTS纳米粒的制备:持续磁力搅拌下，将3mL三聚磷酸钠溶液(1mg/mL,w/v)用5号针头点滴状滴入9mL壳聚糖醋酸钠溶液(2mg/mL,w/v)中，滴加速度为40d-50d/min，滴入后持续搅拌2min；室温孵育30min。2.2.42.2.4载2.2.4载载载PPPP----miRmiRmiR-miR---envenvenv重组质粒env重组质粒重组质粒CTS重组质粒CTSCTS纳米粒的制备CTS纳米粒的制备纳米粒的制备纳米粒的制备CTS纳米粒的制备：采用复凝聚法制备CTS-P-miR-env纳米粒，将180μg无RNase的P-miR-env(210ug/mL)加入3mLTPP溶液中，混合均匀；持续磁力搅拌下，将P-miR-env-TPP溶液用5号针头点滴状滴入9mL壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为40d-50d/min滴入后持续搅拌2min，室温孵育30min。收集纳米粒混悬液于无RNAse、无DNase的EP管中。2.2.52.2.5纳米粒形态学观察及粒径分布2.2.5纳米粒形态学观察及粒径分布纳米粒形态学观察及粒径分布、纳米粒形态学观察及粒径分布、、、粒径的测定粒径的测定粒径的测定粒径的测定（1）透射电镜观察取制备好的CTS-P-miR-env纳米粒一滴至贴附碳纤维膜的铜网上，静置2分钟，用滤纸吸干混悬液，再滴加2%磷钨酸复染色5min，放置空气中，干燥后于投射电子显微镜下观察纳米粒形态并拍照。（2）粒径测量仪分析加少量CTS-P-miR-env纳米粒溶液于分析仪进样孔中，分析测定纳米粒粒径。2.2.62.2.6纳米粒包封率的测定2.2.6纳米粒包封率的测定纳米粒包封率的测定纳米粒包封率的测定以空白CTS纳米粒为对照，精密量取CTS-P-miR-env纳米粒0.5ml，紫外分光光度计检测OD260，此代表DNA总量；取适量CTS-P-miR-env纳米粒，4°C条件下，13000×g固定离心20min，精密量取上清液0.5ml，紫外分光光度计检测上清液中260纳米处的吸光值，此代表游离的DNA量，再通过以下公式计算包封率:包封率G%=[(W总-W游)/W总]×100%，式中W总为DNA的总量；W游为上清液中游离的DNA的量。检测五个样品，计算包封率的平均值。12 山东农业大学全日制硕士专业学位论文2.2.72.2.7纳米粒结合性测定2.2.7纳米粒结合性测定纳米粒结合性测定纳米粒结合性测定带负电荷的裸P-miR-env重组质粒在电场中由负极向正极移动，在凝胶板上显示重组质粒的条带，CTS-P-miR-env纳米粒因荷正电而停止向正极的移动，滞留于加样孔中。用凝胶阻滞分析法验证CTS-P-miR-env纳米复合物的形成及电荷性质。分别取裸重组质粒P-miR-env、CTS-P-miR-env纳米粒、CTS空白纳米粒，经1%琼脂糖凝胶100V电泳60min,凝胶成像仪照相分析壳聚糖与重组质粒的结合能力。2.2.82.2.8纳米粒对抗2.2.8纳米粒对抗纳米粒对抗D纳米粒对抗DDDnnnnaseIaseIaseI保护测定aseI保护测定保护测定保护测定CTS与DNA形成纳米复合物后，能够增加DNA的稳定性，防止DNA被酶降解，在多篇文献中，DNaseI被用于检测基因载体对DNA的保护性降解作用。实验步骤：（1）取45μL（相当于裸质粒10μg）以及制备好的含10μgCTS-P-miR-env重组质粒的纳米复合物，分别加入2.6μL的DnaseI（3.75U/μL），37℃，反应10分钟，100℃终止反应，（2）进行2%琼脂糖凝胶电泳，70V，65min，观察降解情况。22.2.9纳米粒冻干粉的制备2.2.9.2.9纳米粒冻干粉的制备纳米粒冻干粉的制备纳米粒冻干粉的制备（1）甘露醇水溶液的制备称取一定量的甘露醇于烧杯中，根据选定的浓度加入适量的二次蒸馏水，玻璃棒搅拌溶解。用0.45μm滤膜过滤上述澄清液，转移到容量瓶中，二次蒸馏水定容，得到所需的甘露醇溶液，避光保存，备用。（2）纳米冻干粉的制备以甘露醇为保护剂，按照以下方法，制备CTS-P-miR-env纳米冻干粉。量取CTS-P-miR-env水分散体系6mL，向其中加入等体积浓度为8%的甘露醇，轻轻振荡，混合均匀，置于15mL西林瓶中，将西林瓶敞口，在-28℃条件下冷冻24h后，迅速置于冷冻干燥机进行干燥，时间为24h。样品冻干后，盖好瓶塞，备用。释放率的计算取含10μg重组质粒的CTS-P-miR-env纳米复合物12000g高速离心30min；后沉淀重新分散在100μLPBS中，40℃孵育，在6h、12h、24h、36、48、60h时，12000g高速离心30min，紫外分光光度法测量上清液的吸光值A260，计算不同时间点上清液中游离的重组质粒数，按照公式：上清液中PDNA量/纳米粒中PDNA总量（10μg）×100%计算释放率。13 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制2.32.32.3纳米制剂对鸡感染纳米制剂对鸡感染纳米制剂对鸡感染J纳米制剂对鸡感染JJJ亚群白血病病毒体内实验研究亚群白血病病毒体内实验研究用制备好的CTS-p-miR-env纳米制剂进行鸡人工攻毒感染J亚群白血病病毒实验，研究系统给药途径对CTS-p-miR-env纳米制剂抑制J亚群禽白血病复制作用的影响；观察CTS-pDNA纳米粒在感染ALV-J病毒的鸡体内影响病毒复制的作用效果。2.3.12.3.12.3.1实验动物接种实验动物接种实验动物接种ALV实验动物接种ALVALV-ALV---JJJJ病毒和病毒和病毒和CTS病毒和CTSCTS-CTS---pppp----miRmiRmiR-miR---envenvenv纳米制剂以及临床症状观察env纳米制剂以及临床症状观察纳米制剂以及临床症状观察纳米制剂以及临床症状观察1日龄SPF雏鸡100只，购自济南，随机分为8组饲养，对照组每组10只，实验组每组15只，1-5日龄保持室温30±2℃，相对湿度60%~65%，24小时照明，自由进食进水，记录每日采食饮水量。实验动物随机分为8组：采用腹腔注射法，根据纳米复合物不同转染条件以及体外释药特点决定给药量以及重复时间。即质粒DNA含量为5μg、10μg、20μg，并经注射用无菌生理盐水稀释至500μL。因为体外释药曲线显示最长时间7天，故采用7天重复给药一次。见表1。严格饲养管理，饲养周期为30d。雏鸡在1日龄腹腔接种相同剂量的病毒和药物，接种病毒和药物后，严格隔离饲养，观察并记录雏鸡体重、精神状况、采食量、饮水量等临床表现（表3）。表3雏鸡的分组情况Table3Groupeddataofchicks组别类型处理方式数量给药/毒剂量时间1空白对照------10只-----------2接毒对照只接毒10只毒：200μL/只4日龄3阴性对照只注射NS10只NS：500μL/只4日龄4纳米制剂对照只给予制剂10只PDNA：20μg4日龄5裸DNA接毒对照接毒、给予裸DNA10只200μL毒+20μg/只4日龄毒+17日给药6纳米制剂低剂量组接毒、给予制剂15只5μgC-p-env4日龄毒+17日给药7纳米制剂中剂量组接毒、给予制剂15只10μgC-p-env4日龄毒+17日给药8纳米制剂高剂量组接毒、给予制剂10只20μgC-p-env4日龄毒+17日给药2.3.22.3.2排毒监测2.3.2排毒监测排毒监测排毒监测雏鸡自接种病毒和纳米制剂后，每两天采一次泄殖腔棉拭子，用ALV抗原检测试剂盒对其进行抗原检测，以监测其排毒情况。该试剂盒是将抗p27抗体包被在96孔酶联免疫检测板中，加入样品后，样品中的p27与包被的抗体便形成抗原抗体复合物，用四蒸水清洗洗掉未结合的物质后加入辣根过氧化物酶标记的抗p27抗体，它可14 山东农业大学全日制硕士专业学位论文以与结合在孔中的p27结合，再次用四蒸水清洗洗掉未结合的标记物，然后加入底物显色液，则生成的颜色与检测样品中的p27含量有关。具体检测步骤如下：取出抗体包被板，标记样品的位置。在适当的两孔中加入100μL阳性对照和阴性对照。在剩余的孔中加入100μL被检测样品，无需稀释。盖好反应板，在18-26℃的条件下孵育60分钟（±5分钟）。用大约300μL的双蒸水或去离子水洗涤板孔，重复3-5次，最后一次洗板后将液体拍干。毎孔加入100μL酶标抗体。盖好反应板，在18-26℃的条件下孵育60分钟（±5分钟）。用大约350μL的双蒸水或去离子水洗涤板孔，重复3-5次，最后一次洗板后将液体拍干。毎孔加入100μL的TMB底物液。盖好反应板，在18-26℃的条件下孵育15分钟（±1分钟）。毎孔加入100μL终止液终止反应。测量并且记录样品和对照于650nm波长的吸光值A（650）。只有阳性对照和阴性对照值的差大于0.200，阴性对照的平均值小于或等于0.150，检测结果才为有效。被检样品中含有的p27抗原与A（650）和阳性对照值的比值有关，标准化处理阳性对照，代表抗原水平显著（大约10ng/mL）,被检样品中抗原的相对含量是通过样品与阳性对照比值（S/P）来确定，大于0.2，样品为阳性，小于或等于0.2,样品为阴性。S/P值的计算方法如下：1阴性对照的平均值[NC1A(650)+NC21A(650)]/2=NCx2阳性对照的平均值[PC1A(650)+PC21A(650)]/2=PCx3S/P值（样品平均值-NCx)/(PCx-NCx)=S/P2.3.32.3.3血液学指标2.3.3血液学指标血液学指标血液学指标2.4.4.12.4.4.1白细胞数量检测2.4.4.1白细胞数量检测白细胞数量检测白细胞数量检测雏鸡分别在15日龄和27日龄时剖杀，抽取200μL血液，加入抗凝剂，利用全血分析仪对其进行全血分析后检测其白细胞的数量变化。2.4.4.22.4.4.2血涂片的制作方法2.4.4.2血涂片的制作方法血涂片的制作方法(血涂片的制作方法(((瑞氏瑞氏瑞氏-瑞氏---吉姆萨染色吉姆萨染色吉姆萨染色)吉姆萨染色)))血涂片自然晾干。15 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制固定：血涂片在甲醇中浸泡2-3分钟。染色：瑞士-吉姆萨混合液覆盖血涂片10-15分钟，每张血涂片大约需要500μL瑞士-吉姆萨混合液。分色：血涂片于95%乙醇中浸泡10-30s，一般为20s。脱水：血涂片于无水乙醇中浸泡1-2分钟。透明：血涂片于二甲苯中浸泡10分钟。（7）封片：血涂片取出后滴加中性树胶后盖片，在光学显微镜观察。2.3.42.3.4大体剖检病变观察2.3.4大体剖检病变观察大体剖检病变观察大体剖检病变观察在15日龄和27日龄时对鸡进行剖杀，观察心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、气管、肠管、腺胃、胸腺等器官的解剖症状。2.3.52.3.5组织病理学观察2.3.5组织病理学观察组织病理学观察组织病理学观察在15日龄和27日龄时对鸡进行剖杀，取心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、法氏囊、胸腺等器官置于10%中性福尔马林中固定，制作常规石蜡切片于光学显微镜下观察。石蜡切片的制作方法：（1）固定：将取材的组织块立即放入10％的中性福尔马林中进行固定，放置时间应该在24h以上。（2）脱水及透明：修固定好的组织块，流水冲洗过夜，70％酒精（过夜）、80％酒精（2小时）、95％酒精Ⅰ（30分钟）、95％酒精Ⅱ(30分钟)、100％酒精Ⅰ（20分钟）、100％酒精（20分钟），二甲苯Ⅰ（10分钟）、二甲苯Ⅱ（10分钟）。（3）浸蜡与包埋：将透明好的组织块置于石蜡中放置1h以上，将组织放入包埋框内，加入溶化的石蜡，使组织块被包埋在石蜡中。（4）切片：将包埋好的组织蜡块用切片机切成薄片（一般为5-7um）。（5）展片和烤片：将用切片机切下的切片放入展片水槽内，展片水温45℃，在水面上使其自然伸展，然后取一洁净的载玻片于切片附近的水中垂直插入，慢慢上提载玻片，切片便可以自动贴在载玻片上，将切片置于37℃中过夜烘干或60℃30分钟，37℃两个小时。（6）脱腊、浸水、染色和封藏：将组织切片按照如下的方法进行染色，二甲苯Ⅰ（10分钟）、二甲苯Ⅱ（10分钟）、无水酒精（2分钟）、90％酒精（2分钟）80％酒精（2分钟）、70％酒精（2分钟）、蒸馏水（3分钟），苏木素染色液（5-7分16 山东农业大学全日制硕士专业学位论文钟），在常水冲洗到切片不脱色为止，然1％盐酸酒精迅速分化，蓝化（15～30分钟）。然后依次85％酒精（迅速）、1％伊红染色液（0.5-1分钟）、95％酒精Ⅰ（迅速）、95％酒精Ⅱ（2分钟）、无水酒精Ⅰ（2分钟）、无水酒精Ⅱ（2分钟）、二甲苯Ⅰ（5分钟）、二甲苯Ⅱ（5分钟），将完成染色的切片取出，在组织表面滴加中性树胶后用盖玻片盖片，,用光学显微镜下进行观察。2.4统计学方法Real-timePCR对病核酸水平的相对含量进行检验，所得Ct数值数据利用SPSS软件进行统计学分析，对各组的数据相对比进行T检验，P＜0.05代表差异显著。对棉拭子排毒情况进行P27检测，计算S/P值，并计算各组数据的平均值，观察排毒规律。3结果与分析3.13.1载3.1载载载PPPP----miRmiRmiR-miR---envenvenv重组质粒env重组质粒CTS纳米粒的表征3.1.13.1.13.1.1透射电镜法测定纳米粒粒径透射电镜法测定纳米粒粒径透射电镜法测定纳米粒粒径透射电镜法测定纳米粒粒径将CTS-P-miR-env纳米粒用磷钨酸复染色后，利用电子显微镜下观察到CTS-P-miR-env纳米粒分布相对均匀，呈球形或者是类球形，平均粒径100纳米左右（如图1）。图1:透射电镜观察结果Figure1Transmissionelectronmicroscope(TEM)observationresult17 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制3.1.23.1.2粒径测量仪测定3.1.2粒径测量仪测定粒径测量仪测定纳米粒粒径粒径测量仪测定纳米粒粒径纳米粒粒径纳米粒粒径利用粒径测量仪分析测定纳米粒粒径，结果显示CTS-P-miR-env纳米粒90%粒径为102nm，平均粒径为88nm，和用透射电镜法检测到的结果是一致的（表4、图2）。表4粒径分析仪结果Table4Resultsofparticlesizeanalyzer分析结果X10=0.074µmX50=0.087µmX90=0.102µmXav=0.088µmS/V=663783.200cm^2/cm^3X[3,2]=0.090µmX[4,3]=0.092µm拟和误差：0.144图2粒径分析仪结果Figure2Resultsofparticlesizeanalyzer3.1.33.1.3包封率3.1.3包封率包封率包封率随机选取5个样品利用紫外分光光度计检测OD260，通过计算最终得到平均包封率为87%，说明在此制备条件下大部分重组质粒被包裹于纳米粒体系中，达到包封的目的（表5）。表5包封率结果Table5ResultsofencapsulationefficiencyCTS-pDNA上清液包封率平均样品OD260OD260%%11.3050.18385.9821.2650.14688.4631.2880.15388.1286.9941.2680.17486.2851.2810.17886.1018 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3.1.43.1.4结合性3.1.4结合性结合性结合性利用凝胶阻滞分析法分析壳聚糖与重组质粒的结合能力，结果显示1泳道上C-PP空白纳米粒未出孔，2泳道的裸质粒跑出点样孔，3泳道上C-PP-DNA未出孔，可见壳聚糖纳米粒能通过静电作用有效结合质粒，阻滞重组质粒移动而滞留于加样孔中（图3）。图3壳聚糖-PDNA纳米粒凝胶阻滞电泳结果Figure3Electrophoresisphotosofchitosan-plasmidnanoparticlesM:DNAMaker;1:C-PP空白;2:裸质粒；3:C-PP-DNA3.1.53.1.5对抗3.1.5对抗对抗D对抗DDDnnnnaseIaseIaseI保护测定aseI保护测定保护测定保护测定利用琼脂糖凝胶电泳对抗DnaseI保护测定，结果显示1、2泳道裸质粒被完全降解，加样孔内以及条带完全消失；3、4、5泳道CTS-pp-DNA复合物被完全阻滞于与加样孔中，均能有效地对质粒DNA有保护核酸酶降解的作用（图4）。19 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制图4壳聚糖纳米粒对DNA保护作用凝胶电泳结果Figure4ProtectiveeffectofchitosannanoparticlesonDNAgelelectrophoresisM：DNAMaker；1、2：裸质粒；3、4、5：纳米复合物C-PP-DNA3.1.63.1.6冻干粉物理性质3.1.6冻干粉物理性质冻干粉物理性质冻干粉物理性质利用紫外分光光度法测量A260吸光值，按照公式：上清液中PDNA量/纳米粒中PDNA总量（10μg）×100%计算释放率，结果显示在第7天释放率达到97%，说明冻干粉具有良好的释放性质（图5）。图5冻干粉体外释放曲线图Fig5thecurveoftheinvitroreleaseoffreeze-driedpowder20 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3.2纳米粒体内实验研究结果3.2.13.2.13.2.1临床症状临床症状临床症状临床症状正常对照组鸡群生长发育情况良好，采食量正常，精神状态良好，羽毛光亮，个体大小基本一致。接毒对照组鸡群发育迟缓，采食量减少，精神沉郁，羽毛粗乱无光，鸡体瘦弱，个别鸡出现贫血现象。纳米制剂组鸡群，生长发育情况较接毒对照组良好，采食量正常，精神状态较佳，食欲正常。体重检测结果显示正常对照组鸡群体重明显高于接毒组，纳米制剂组鸡群体重高于接毒组，与正常对照组体重接近，同时裸DNA接毒对照组与纳米制剂低剂量接毒组体重接近，均低于纳米制剂中剂量与高剂量接毒组体重。（如图6）图6体重增长折线图Fig6Weightgrowthlinechart3.2.23.2.2排毒监测3.2.2排毒监测排毒监测排毒监测从鸡泄殖腔采取棉拭子，用ALV抗原检测试剂盒对进行抗原检测，以监测其排毒情况。结果如下：21 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制表6不同日龄鸡的抗原检测结果（S/P值）Table6Antigendetectionresultschickensindifferentday-old组别组别组别（组别（（（10只只只/2d2d2d4d4d4d6d6d6d8d8d8d10d10d12d12d16d16d20d20d22d22d24d24d28d28d组组组）组）））空白对照0.04±±±0.080.0444±0.150.03±±±0.060.02±±±0.090.03±±±0.120.02±±±0.060.03±±±0.080.01±±±0.040.08±±±0.050.04±±±0.090.04±±±0.06ALV-J接毒对照0.51±±±0.091.03±±±0.050.97±±±0.300.79±±±0.101.41±±±0.140.25±±±0.050.55±±±0.181.22±±±0.301.06±±±0.180.34±±±0.101.76±±±0.41生理盐水对照0.03±±±0.080.09±±±0.100.08±±±0.220.04±±±0.060.05±±±0.070.05±±±0.090.16±±±0.100.03±±±0.070.10±±±0.070.05±±±0.070.43±±±0.15纳米制剂未接毒0.06±±±0.080.09±±±0.100.11±±±0.120.05±±±0.060.03±±±0.070.08±±±0.070.16±±±0.100.05±±±0.070.17±±±0.050.04±±±0.030.83±±±0.05对照裸DNA接毒对照0.11±±±0.040.12±±±0.000.06±±±0.030.13±±±0.000.06±±±0.040.04±±±0.070.13±±±0.080.21±±±0.080.12±±±0.050.28±±±0.060.19±±±0.04纳米制剂低剂量0.07±±±0.000.07±±±0.050.08±±±0.040.02±±±0.010.05±±±0.010.07±±±0.030.11±±±0.010.13±±±0.040.08±±±0.020.17±±±0.170.08±±±0.10接毒组纳米制剂中剂量0.04±±±0.020.06±±±0.000.06±±±0.040.07±±±0.010.13±±±0.000.11±±±0.040.08±±±0.040.12±±±0.060.05±±±0.080.05±±±0.060.39±±±0.13接毒组纳米制剂高剂量0.01±±±0.020.04±±±0.000.02±±±0.000.01±±±0.010.03±±±0.000.05±±±0.010.06±±±0.040.01±±±0.060.04±±±0.050.02±±±0.010.10±±±0.07接毒组同日龄鸡的抗原检测结果Fig.7AntigendetectionresultschickensinDifferentday-old从图中可以看出接毒组均呈抗原阳性，空白对照组均呈阴性，裸DNA接毒组在20日龄和24日龄出现排毒，纳米制剂中剂量接毒组在28日龄出现排毒，纳米制剂高剂量接毒组未出现排毒，S/P值一直较低。说明纳米制剂抑制白血病病毒复制作用优于裸质粒（表6、图7）。22 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3.2.33.2.3血液学指标3.2.3血液学指标血液学指标血液学指标3.2.3.1白细胞数量的检测雏鸡分别在15日龄和27日龄利用全血分析仪对其进行全血分析后检测其白细胞的数量变化。ALV-J接毒组白细胞数减少，说明鸡在接毒后病毒对骨髓造血体统产生的危害作用，导致鸡的造血机能下降，从而使白细胞的总数减少，白细胞数量的减少趋势与淋巴细胞百比例的下降趋势相似。裸DNA接毒对照组以及纳米制剂接毒租白细胞数量明显高于接毒组，说明其对骨髓的起到保护作用；同时我们也发现纳米制剂接毒组由低剂量到高剂量白细胞数量依次增高，而且均高于裸DNA接毒组，说明纳米制剂对机体的保护作用强于裸质粒（图8、图9）。图8白细胞数量变化Fig.8Numberchangeofleucocyte图9淋巴细胞比例Fig.9Rationoflymphocytes23 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制3.2.3.2..血涂片观察.血涂片观察血涂片观察血涂片观察图10血涂片观察(400X)Fig.10Bloodsmearobservation由于病毒侵害机体骨髓造血系统，使得ALV-J接毒组血液中的淋巴细胞减少，而裸DNA接毒对照组以及纳米制剂接毒组的血液中，淋巴细胞数量明显高于ALV-J接毒组，说明siRNA降解了ALV-J，减少了病毒对机体骨髓造血系统的伤害。同时可以观察到纳米制剂接毒组由低剂量到高剂量白细胞数量依次增高，而且均高于裸DNA接毒组，说明纳米制剂对机体的保护作用强于裸质粒，与全血分析仪得到的结果一致。说明p-miR-env重组表达质粒具有抑制白血病病毒复制作用，而且纳米制剂抑制白血病病毒复制作用优于裸质粒（图10）。3.2.43.2.4大体剖检病变3.2.4大体剖检病变大体剖检病变大体剖检病变实验动物分别在15日龄、27日龄、35日龄进行剖杀，对比观察可以看出接毒组心脏、脾脏、肝脏、胸腺、法氏囊出现明显萎缩，纳米制剂接毒组由低剂量到高剂量心脏、脾脏、肝脏、胸腺、法氏囊逐渐趋于正常，而且相比裸质粒组效果更好。说明p-miR-env重组表达质粒具有抑制白血病病毒复制作用，而且纳米制剂抑制白血病病毒复制作用优于裸质粒（图11）。24 山东农业大学全日制硕士专业学位论文25 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制26 山东农业大学全日制硕士专业学位论文图11解剖学病变Fig.11AnatomiclesionsA：空白对照，B：ALV-J接毒对照，C：生理盐水对照，D：纳米制剂未接毒对照，E：裸DNA接毒对照，F：纳米制剂低剂量接毒组，G：纳米制剂中剂量接毒组，H：纳米制剂高剂量接毒组3.2.53.2.5组织病理学症状3.2.5组织病理学症状组织病理学症状组织病理学症状通过病理组织学观察可以看出，接毒组心肌明显出血、形成淋巴细胞炎性灶；肝脏出现大量淋巴细胞炎性灶；肾脏出血；肺脏充血，间质增宽；脾脏淋巴细胞流失，数量明显减少。空白对照组各组织均正常。裸质粒组与纳米制剂低剂量接毒组出现轻微病变，纳米制剂中剂量与高剂量接毒组跟正常对照组相似，说明p-miR-env重组表达质粒具有抑制白血病病毒复制作用，而且纳米制剂抑制白血病病毒复制作用优于裸质粒（图12）。27 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制28 山东农业大学全日制硕士专业学位论文图12病理组织学观察Fig.12ThepathologicalhistologyobservationA：空白对照，B：ALV-J接毒对照，C：生理盐水对照，D：纳米制剂未接毒对照，E：裸DNA接毒对照，F：纳米制剂低剂量接毒组，G：纳米制剂中剂量接毒组，H：纳米制剂高剂量接毒组4.讨论J亚群禽白血病(ALV-J）是由反转录病毒科的J亚群禽白血病病毒引起的一种传染性致骨髓细胞瘤疾病或成髓性白血病，对鸡造血系统、免疫系统、生殖系统以及肝、脾、肾、心等主要脏器有很大的危害，给养禽业带来了极大的损失，最早是20世纪90年代初从肉鸡中分离到的。ALV-J可以垂直传播，并可诱发肿瘤、造成免疫抑制，该病毒迅速蔓延，几乎波及到所有养鸡国家，给世界养禽业造成了巨大的经济损失，因为其致瘤性的多样性，目前尚无有效防止J亚群禽白血病的方法，而且，由于ALV-J的垂直传播性、先天感染的免疫耐受鸡是主要的传染源，目前也无有可用的疫苗。靶向病毒的RNA干扰药物成为抑制ALV-J病毒蛋白复制的一个研究热点，小干扰在抑制J亚群禽白血病病毒复制方面一个非常有前景的课题。小分子干扰RNA构建完成后，若能有效地进入细胞进行转染表达，就能干扰ALV-J病毒囊膜蛋白的合成，从而抑制肿瘤细胞的复制，最终达到治疗禽白血病的目的。ALV-J基因主要含有gag、pol、env三个基因及结构基因两侧的长末端序列(longterminalrepeats,LTR)。gag基因主要编码衣壳蛋白CA、病毒基质蛋白MA、核衣壳蛋白NA以及env基因转录后加工过程运用到的蛋白酶PR等内部非糖基化结构蛋白，为病毒群特异性抗原，所有亚群ALVs内都含有。Pol基因主要影响细胞基因信29 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制息表达前的病毒RNA的反转录，是反转录RNA病毒由RNA反转录为DNA分子的过程中所必须的，影响病毒基因组在细胞染色体上的插入，随宿主细胞的分裂便可转录出病毒DNA，从而产生病毒蛋白质，env基因上的遗传信息主要参与合成表面膜蛋白，编码病毒囊膜糖基化蛋白，包括膜表面糖蛋白亚单位（SurfaceglycoproteinUnit，SU）gp85和跨膜糖蛋白亚单位（Transmembraneprotein，TM）gp37。J亚群禽白血病病毒是与宿主细胞膜融合的方式入侵细胞的（刘青，2008），即病毒表面糖蛋白与宿主细胞的受体结合后，病毒融合蛋白构象发生变化，病毒粒子便在宿主细胞内释放，而编码融合肽这种构象可以发生变化的蛋白位于TM基因上，因此TM在ALV-J感染宿主细胞过程中起着重要作用，LTR含有病毒的复制、翻译、RNA的加工及病毒整合宿主基因的多种序列，主要影响病毒RNA的复制与翻译（RuddellA，1995）。经过本实验室前期研究，所设计合成的p-miR-gag、p-miR-pol、p-miR-env和p-miR-LTR4种重组干扰质粒对ALV-J的单独干扰在体外细胞和体内都有效的抑制了病毒的增殖与表达，其中p-miR-env对病毒的抑制效果最好，因此本实验选用p-miR-env重组表达质粒为靶向药物。然而，这种裸的小RNA容易被核酸酶等破坏，且很容易变性，这就使得siRNA不被破坏地进入细胞成为一个关键，所以基因递送系统就显得尤为重要。以纳米颗粒作为小干扰质粒的载体，属于非病毒基因递送载体，就是将DNA,RNA,dsRNA(双链RNA)等基因治疗分子包裹在纳米颗粒中或吸附在其表面，在细胞作用下纳米颗粒进入细胞内，释放小干扰并发挥RNAi治疗效能，本课题主要针对小干扰制剂研制及其临床抗ALV-J复制效果进行了研究，选择壳聚糖纳米粒作为重组表达干扰质粒的载体，这是因为除了它本身具有的抑制肿瘤生长作用外，壳聚糖纳米粒可以注射，无毒、稳定、无抗载体免疫反应；可以生物降解，与生物有机体的相容性良好；可以保护基因药物，防止被血清中核酸酶破坏；可以装载多种基因药物，可以控制基因释放，提高DNA的半衰期，增加疗效；可制成冻干粉针剂，容易保存，基因药物活性不受影响；具有独特的跨细胞膜功能，这就使重组表达干扰质粒可以顺利地进入动物细胞进行转染，并且提高转染效率，为有效抑制ALV-J病毒复制提供一种可能。利用本实验室先前制备的P-miR-env重组质粒进行转化，去内毒素大提，采用复凝聚法制备CTS-P-miR-env纳米粒。通过透射电镜负染观察到CTS-P-miR-env纳米粒分布相对均匀，呈球形或者是类球形，平均粒径100纳米左右；粒径分析测量仪测定TS-P-miR-env纳米粒平均粒径100纳米左右，，和用透射电镜法检测到的结果是一致30 山东农业大学全日制硕士专业学位论文的；微量紫外分光光度计测定CTS-p-miR-env上清中的游离质粒的含量，计算包封率，通过计算最终得到平均包封率为87%，说明在此制备条件下大部分重组质粒被包裹于纳米粒体系中，达到包封的目的；凝胶电泳法测定纳米粒的稳定性，结果为壳聚糖纳米粒能通过静电作用有效结合质粒；凝胶电泳法分析纳米粒在胎牛血清中的稳定性，结果显示壳聚糖能有效地对质粒DNA有保护核酸酶降解的作用；经过实验证明，制备的纳米粒冻干粉具有良好的释放特性。经过本实验室先前研究p-miR-env重组表达质粒体外实验中获得成功，所以在此的基础上在动物体内实验，将p-miR-env重组表达质粒和纳米制剂注射于机体体内进行体内抗病毒的研究。体内实验中，重组表达干扰质粒进入细胞的方式与体外实验相同，都是采用脂质体转染的方法，采用腹腔注射法注射于动物体，这种方法吸收较快，有利于重组表达干扰载体迅速进入体内细胞，然后通过血液循环等途径扩散的到机体的其它组织。当病毒感染机体后，病毒在会迅速在体内增殖，并且可以随粪便排出体外，因此可以通过对泄殖腔内棉拭子的采集，去检测鸡的排毒情况，棉拭子上带有鸡排出的粪便，将其置于PBS中冷冻后，病毒便会释放到PBS中，PBS缓冲液就可作为检测病原的样品，通过ALV-J抗原检测试剂盒的检测，生成的颜色与检测样品中的p27含量正相关，用酶标仪在650nm的波长下测其吸光度，就可以间接反映出病毒量的情况。通过对雏鸡1-30日龄棉拭子抗原的检测结果可知，鸡在接种病毒后并不是持续不断的排毒，而是呈现一种周期性的规律，基本上以4天为一个周期，排毒量从高到低再升高。实验结果可以看出接毒组均呈抗原阳性，空白对照组均呈阴性，裸DNA接毒组在20日龄和24日龄出现排毒，纳米制剂中剂量接毒组在28日龄出现排毒，纳米制剂高剂量接毒组未出现排毒，S/P值一直较低。说明p-miR-env重组表达质粒具有抑制白血病病毒复制作用，而且纳米制剂抑制白血病病毒复制作用优于裸质粒。白细胞是具有多样的形态结构和生理功能，在机体的防护、免疫过程中相互协作、共同作用。白细胞在机体防御中起着重要作用，它主要是通过吞噬细胞的吞噬作用、诱导B淋巴细胞产生抗体和刺激T淋巴细胞启动细胞免疫的方式对进入机体的病原微生物进行抵御和消灭，在治愈机体的损伤、抵御病原的入侵等方面起着重要的作用。当机体有炎症的发生或引起其他疾病时，白细胞的总数及各种白细胞的比例便会发生变化，因此可以通过对白细胞总数和不同白细胞的比例来作为诊断的辅助方法。在本实验过程中，ALV-J接毒组白细胞数减少，说明鸡在接毒后病毒对骨髓造血体统31 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制产生的危害作用，导致鸡的造血机能下降，从而使白细胞的总数减少，白细胞数量的减少趋势与淋巴细胞百比例的下降趋势相似。裸DNA接毒对照组以及纳米制剂接毒对照组白细胞数量明显高于接毒组，说明其对骨髓的起到保护作用；同时我们也发现纳米制剂接毒组由低剂量到高剂量白细胞数量依次增高，而且均高于裸DNA接毒组，说明纳米制剂对机体的保护作用强于裸质粒。大体剖检病变观察可以看出接毒组心脏、脾脏、肝脏、胸腺、法氏囊出现明显萎缩，纳米制剂接毒组由低剂量到高剂量心脏、脾脏、肝脏、胸腺、法氏囊逐渐趋于正常，而且相比裸质粒组效果更好。通过病理组织学观察可以看出，接毒组心肌明显出血、形成淋巴细胞炎性灶；肝脏出现大量淋巴细胞炎性灶；肾脏出血；肺脏充血，间质增宽；脾脏淋巴细胞流失，数量明显减少。空白对照组各组织均正常。裸质粒组与纳米制剂低剂量接毒组出现轻微病变，纳米制剂中剂量与高剂量接毒组跟正常对照组相似，说明p-miR-env重组表达质粒具有抑制白血病病毒复制作用，而且纳米制剂抑制白血病病毒复制作用优于裸质粒。由此看出本实验成功制备的P-miR-env重组质粒分布均匀，形态规则，具有较高包封率，对siRNA具有酶解保护作用。通过体内实验p-miR-env重组表达质粒具有抑制白血病病毒复制作用，而且纳米制剂抑制白血病病毒复制作用优于裸质粒。本研究解决了siRNA稳定性差、粒径小、不易进入靶细胞等问题，为ALV-J和其它病毒病提供了一种新的有效的防治和治疗途径。5.结论5.1成功制备了分布均匀，形态规则，具有较高包封率，对siRNA具有酶解保护作用的P-miR-env重组质粒。5.2通过体内实验证明CST-P-miR-env具有抑制ALV-J复制作用，而且纳米制剂抑制白血病病毒复制作用优于裸质粒，具有良好的治疗效果。32 山东农业大学全日制硕士专业学位论文参参参考考考文文文献献献蔡黎明.蛋鸡禽白血病J亚群流行病学调查及致病性研究[D].山东农业大学，2013.柴家前，王贵强，孙淑红，郭慧君，崔治中.J亚群禽白血病病毒分子流行病学研究进展[J].山东畜牧兽医，2009，30(1)：40-42.成子强，张利，刘思当，张玲娟，崔治中.中国麻鸡中发现J亚群白血病.微生物学报[J].2005，45(40)：584~587.崔治中.我国鸡群J亚群白血病流行的过去，现在和将来及其防控--对我国动物疫病防控的启示[J].现代畜牧兽医，2015(1).杜岩，崔治中，秦爱建.从市场商品肉鸡中检测出亚群白血病病毒[J].中国家禽学报，1999，1：1-4.斐鸣.肉种鸡J亚群禽白血病的诊断.中国畜牧兽医学会兽医病理分会第十一次兽医病理学、第十次动物病理生理学学术研讨会论文集.杭州：2001，8：201-202.付爱玲.裸DNA治疗研究[J].生命化学，2009,29(3):327-330.付桂英.药物制剂技术在基因药物研制中的应用[J].生物技术通讯，2005，16(5):589-590.高娴;马世坤;陈斌.离子凝胶法制备壳聚糖载药微囊[J].天津医科大学学报，2008，14(4):463-465.姜艳萍，王玥，于琳琳，蔡黎明，王真真，徐晴晴，成子强.ALV-J诱发鸡成红细胞白血病的临床病例分析[J].畜牧兽医学报，2012，43(8)：1317-1323.金征宇，顾正彪，童群义等.碳水化合物一原理与应用[M].北京:化学工业出版社2008:212-228,306-322.刘思当.J亚群禽白血病的病理诊断[J].中国兽医杂志，2002，38(3)：26-27.毛建平;毛秉智.基因药物研究现状和对策[J].中国生物化学与分子生物学报，2004,20(2):143-148.童淑梅，赵振华，杨玉莹.J亚群禽白血病的研究进展[J].中国家禽，2008(1)：45-47.王言明.J亚群禽白血病病毒抗原/抗体检测体系的建立[D].山东农业大学，2014.吴锦银.RNAi技术综述[J].现代医院，2006，6(12)：6-7.乌通恩;王萍亚;夏森.论壳聚糖及脱乙酰度的测定[J].浙江海洋学院学报(自然科学版)，2003，22(1):77-82.33 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制肖苏尧.淀粉纳米颗粒的制备及其作为抗癌药物/基因载体的研究「D].湖南:湖南大学，2007.徐镔蕊，董卫星，何召庆，冯晓宇，余春明，张丽，任艳丽.间接荧光抗体法快速诊断海兰褐蛋鸡J亚群禽白血病的研究[J].中国兽医杂志，2002，38(9)：7-9.袁克华，冯仁军，程萍.RNA干扰的研究进展.安徽农业科学，2009，37(8)：3471-3473.赵雪;任慧霞.壳聚糖及其衍生物作为基因递送载体的研究进展[J].食品与药物,2006,8（02A）；1-5.赵振华，顾玉芳，王凤龙，郝永清，佟程浩，王海燕，曹鸿国，赵满达.禽骨髓细胞瘤病的病理学研究(初报).动物医学进展，1999.(03)：85-86.BernsteinE,CaudyAA,HammondSM,HanonGJ.RoleforabidentaleribonucleascintheinitiationstepofRNAinterference[J].Nature,2001(409):363-366.BernsteinE,KimSY,CarmellMA.Dicerisessentialformousedevelopment.NatGenet.2003,35,215-217.DavidP.Polymersforgenedeliveryacrosslengthscales[J].NatureMaterials,2006，5:439-451Fauquet，C.M.，M.A.Mayo，J.Maniloff，U.Desselberger，andL.A.Ball.2005.VirusTaxonomy：VIIIthReportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses.Elsevier-AcademicPress.GaoS.Y;ChenJ.G;XuX.R.GalactosylatedlowmolecularweightchitosanasDNAcarrierforhepatocyte-targeting[J].InternationalJournalofPharmaceutics,2003,255:57-68IshiiT;OkahataY;SatoT.Mechanismofcelltransfectionwithplasmid/chitosancomplexes[J].BiochimBiophysActa,2001，1514(1):51一64.JayaKumarR;ChennazhiK.P;MuzzarelliR.A.Aetal.ChitosanconjugatedDNAnano-particlesingenetherapy[J].CarbohydratePolymers,2010,79:1一8.KamathRS,Martinez,CamposM.EffectivenessofspecificRNA-mediatedinterferencethroughingesteddouble-strandedRNAincaenorhabditiselegans[J].GenomeBiol,2001,2(1):RESEARCH0002.KettingRF.DicerfunctioninRNAinterferenceandsynthesisofsmallRNAinvolvedindevelopmenttiminginC.elegans[J].GeneDev,2001,15:2654-2659.KinT.H;ParkLK;NahJ.W.Galactosylatedchitosan/DNANanoparticlespreparedusingwater-solublechitosanasagenecarrier[J].Biomaterials,2004,25:3783-3792.Koping-HoggardM;TubulekasI;GuanHetal.Chitosanasanonviralgenedeliverysystem.Structure-propertyrelationshipsandcharacteristicscomparedwithpolyethylenimine34 山东农业大学全日制硕士专业学位论文invitroandafterlungadministrationinvivo[J].GeneTherapy,2001,8:1108一1121.LipardiC,WeiQ,PatersonBM.RNAiasrandomdegradativePCR:siRNAprimersconvertmRNAintodsRNAsthataredegradedtogeneratenewsiRNAs[J].Cell,2001,107:297.LiuF;SongY;LiuD.Hydrodynamics-basedtransfectioninanimalsbysystemicadministrationofplasmidDNA[J].Genetherapy,1999,6(7):1258一1266.PayneL.，Brown，S.，Bumstead，N.，Howes，K.，Frazir，J.A.ThouLLess，M.E.Anovelsubgroupofexogenousavianleukosisvirusinchickens.TheJournalofgeneralvirology，1991a，72，801-807.PayneL.Developmentsinavianleukosisresearch.Leukemia1992，6suppl3，150S-152S.PayneL.N.Theemergenceofmyeloidleukosisinmeat-typechickens.99InternationalConferencesandExhibitiononVeterinaryPoultryProceedings，1999，1-10.VenugopalK，HowesK，FlanneryDM，etal.IsolationofacutelytransformationsubgroupJavianleueosisvirusesthatinduceerythroblastosisandmyelocytosis.AvianPatho，2000，29(4)：327-332.35 纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制研究生期间论文发表情况1、基于壳聚糖包裹的ALV-JP-miRNA-env重组质粒纳米复合物制备技术及应用，201610068971.9，发明专利，第二发明人。36 山东农业大学全日制硕士专业学位论文致谢时光如白驹过隙般从指边匆匆而过，研究生的两年时光马上就要走到尽头，在这段时间里，喜怒哀乐都已尝遍，有做出实验结果的喜悦，有得到老师鼓励后的满足，有实验瓶颈中的懊恼，从懵懵懂懂、跌跌撞撞一路终于走到开阔，感恩的心一直都在，很感谢成老师在研究生之路上的给予我的指导与帮助，如同黑夜里的明灯、航线中的导航，还要感谢张老师和王老师在生活中的关心和已经毕业的师兄师姐们在实验中的帮助和实验经验的传授，还有众师弟师妹们冯卫国、廉立慧、周德方、庄萍萍、孟微、李根、朱明君、张吉、赵国梁、王化茹、杜旭升、王晓宇、崔熙尧、王小满的帮忙，有了你们，生活中多了姿彩，实验中多了力量，帮助过我的，我永远都不会忘记，我会铭记于心，历久弥新。37
