木荷抗稻瘟病菌活性皂甙的分离与鉴定

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分类号学校代号学号学位恰久木荷抗稻瘟病菌活性皂贰的分离与鉴定五占七几加咭勺咤张长伶指导教师姓名霍光华教授江西农业大学张颖君研究员中国科学院昆明植物所申请学位级别硕士学科名称微生物学论文提交日期年月论文答辩日期年月学位授予单位江西农业大学学位授予日期年月江西农业大学二零一一年六月 ThesisforMasterDegreeIsolationandIdentificationoftheSaPoninsfromSchimasuPerbawithResisting对咭儿批广中 独创性声明本人声明,所呈交的学位论文,是在指导教师指导下,通过我的努力取得的成果,并且是自己撰写的。尽我所知,除了文中作了标注和致谢中已经作了答谢的地方外,论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果,也不包含在江西农业大学或其它教育机构获得学位或证书而使用过的材料。与我一同对本研究做出贡献的同志,都在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如被查有严重侵犯他人知识产权的行为,由本人承担应有的责任。学位论文作者亲笔签名叠绘断奋期论文使用授权的说明本人完全了解江西农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即学校有权送交论文的复印件,允一午论文被查阅和借阅学校可以公布论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密,、上年后解密可适用本授权书。了不保秘,本学位论文属于不保密。请在方框内打“寸'学位论文作者亲笔豁髯燕耸日期业勒耳、算价指一趣特日一 摘要摘要从木荷月中寻找抗稻瘟病菌臼勿儿月口弓二活性物质,本文采用琼脂扩散法跟踪,对木荷不同部位、不同季节以及不同有机溶剂提取物级分的抗稻瘟病活性进行差异性分析,结果显示,下半年木荷叶的活性最强,在的浓度下,其抑菌率达。而且其乙醇提取物的水饱和正丁醇级分抑菌活性最强,在的浓度下,其抑制率为。然后对水饱和正丁醇级分依次采用大孔树脂柱层析,硅胶柱层析,一柱层析进行分离纯化,同时各个级分抗稻瘟病活性的。浓度分别为级分的为级分的为级分的。为人在级分的。为级分的。为恤人左级分的为级分的。为最后对级分采用制备式高效液相进行纯化,获得两个齐墩果烷型皂贰,进一步经过,一、质谱、红外和紫外等光谱手段鉴定,并结合化合物酸水解、气相色谱单糖分析,确定两种化合物分别为化合物,一二一。一当归酞基一·玉蕊醇一一一一一口比喃葡萄糖基一一一卜一口比喃半乳糖基一一一〔一一比喃鼠李糖基一一」一一一日比喃葡萄糖酸试。即是,一一一一一一一渭一一一一弓岁一一一一一一【一一一一一〕一一·,命名为木荷皂试化合物,一二一一当归酞基一一玉蕊醇一一岁一一毗喃葡萄糖基一一一刀一一毗喃木糖基一一一「一一毗喃鼠李糖基一一一刀一一口比喃葡萄糖酸贰。即是,一一一一一一一尹一一尹`一弓渭一一,一一一一一,厂一岁一一,命名为木荷皂试经数据库验证,该两种化合物为首次分离得到的新化合物。关键词木荷抗稻瘟病真菌活性皂试分离鉴定齐墩果烷型皂试 AbstraetAbstraCtToin、了·,,、,,,。一一认·'、,,,乞。认一一,一撇认,,、厂、,。、厂认,、,、'入度,、`人理认厂,、,,、入、】人理`·,、、认,入、一,,一人在,马,、,认,,,,、、'认一一一一一一,一一一渭一一,,一岁一一,一一卜【一一今尸一一渭一一,命名为木荷皂试一一一·一一一一渭一一一一渭一一'一升一【一一'一升节一一·」,命名为木荷皂试、,,心,,似,从认一、`、、'产万。·,毋,,·。、、·',、· 目录目录·摘要……”……”……“…………”……”……第一章文献综述……”……,……木荷及同科属植物的生物活性……。……木荷及其同科属植物的化学成分……”…”……“……二”二”…木荷及其同科属植物的生物活性与化学成分的关系……”……本研究的基本思路……“……”……第二章材料与方法……材料试剂和仪器……”……“……”…木荷叶、树枝皮、根茎皮样品……”……供试病原菌株……培养基……分离用固定相材料及主要试剂…………主要仪器……,……方法……木荷抗稻瘟病真菌活性化学成分的提取……大孔吸附树脂初步分离木荷抗稻瘟病真菌活性成分……硅胶柱层析法分离抗稻瘟病真菌活性成分……“……一柱纯化抗稻瘟病真菌活性成分……一柱再次纯化抗稻瘟病真菌活性成分……半制备纯化抗稻瘟病真菌活性成分……'抗稻瘟病菌活性成分的生物和化学检定……抗稻瘟病菌活性成分的波谱分析……“……活性成分的酸水解……皂营元分析……,……`…单糖绝对构型确定……第三章结果与分析…“……”……,,,……获得木荷中抗稻瘟病菌活性成分的取材部位和季节的确定……木荷树叶、树皮、树根皮化学成分的预实验…… 日录木荷三部位乙醇级提取物对植物病原菌的抗菌性……提取木荷抗稻瘟病菌活性成分的技术路线和各步骤技术参数…………大孔吸附树脂初步分离木荷抗稻瘟病菌活性成分的条件选择……树脂型号的选择及装柱…”……“……。一……洗脱的温度和流速……“……”……“……”…”……”……“……洗脱方式和流动相组成……”……,…………上样量和级分收集与判别……,一……硅胶柱层析法分离木荷抗稻瘟病菌活性成分的条件……”…”硅胶颗粒与装柱'……”二…一……“……洗脱条件……”二“……”……上样量和级分收集与判别一……一柱纯化活性成分的条件“……”……”……一柱材料颗粒与装柱………”…久洗脱条件……“……“……上样量和级分收集与判别……“…………一柱再纯化活性成分的条件……、……“…四级分的分析……抑菌率差异性比较…………抑菌图片……,各活性成分度纯度检验……”一………二两皂营的纯度检验…”……“……皂普元的纯度检验…………“…”……“…化合物的结构解析……”…新化合物的结构解析……“……,……化合物理化及波谱数据……………单糖绝对构型的确定……“……“……第四章小结与讨论……参考文献……致谢……,……,……个人简历…………`……`…… 第一章文献综述第一章文献综述木荷及同科属植物的生物活性山茶科录属于植物界被子植物门双子叶植物纲杜鹃花目,多为常绿木本,单叶,互生、革质、无托叶,花两性,少数单性。苞片至多数,脱落或宿存,常具有分类的价值。粤片多数或数,有时与苞片分不开,二者逐渐过渡,组成苞被片。花瓣多数至数,白色、红色或黄色、多少合生。雄蕊通常多数,数位于子房上位,少数半下位。一室,胚珠通常多个。葫果,或不开裂的核果和浆果。山茶科全世界约有属余种,广泛分布于东西两半球的热带和亚热带地区,尤其以亚洲为最集中,我国约有巧属余种',主要产于长江流域以及以南各地,该科植物具有很高的经济价值。茶叶是世界三大饮料之首,因具有多方面的生理活性和保健功能而备受喜爱。云南山茶花大色艳,居云南八大名花之首,为昆明市花。油茶是我国特有种,也是最重要的木本油料作物之一,种子榨的茶油营养丰富,被誉为“东方橄榄油”。此外,山茶科还有大约属种植物被我国中医、少数民族医生以及民间草药医生广泛使用。山茶属刀,植物全世界约有种,我国有种以上,主要分布在西南部和东南部地区,该属植物民间药用品种很多,用途广泛,历史悠久。药用收载的有山茶厂哪,'的花,即山茶花,其味辛苦,性凉,无毒,具有凉血、止血、散癖、消肿之功能,用于治疗吐血,屺血,血崩,肠风,血痢,血淋,跌扑损伤,烫伤油茶的种子称为茶子心,其味苦,性平,有毒。具有行气疏滞之功能,用于治疗气滞腹痛泄泻油茶种子的脂肪油,即茶油,其味甘,凉,具有清热化湿,杀·虫解毒之功能,用于治疗疹气腹痛,急性蛔虫阻塞肠梗阻,疥癣,烫火伤油茶压榨出去脂肪油的残渣,称为茶子饼其味辛,苦,涩,有小毒。具有收湿杀虫之功能,用于治疗阴囊、湿疹、跌打损伤,茶,为二。的嫩叶称为茶叶,其味甘苦,性凉,具有清目提神、除烦渴、化痰、消食、利尿、解毒之功能,用于治疗头痛、目昏、多睡善寐、心烦口渴、食积痰滞、疟疾茶的果实称为茶子,其味苦、性寒、有毒,治喘急咳嗽,去痰垢。茶的根称为茶树根,其味苦,性平,有小毒。具有散癖活血,接骨消肿之功能,用于治疗骨折,扭挫伤,腹痛,皮肤痉痒,烫火伤皋芦,玲二印勿,的叶,其味苦涩用于治疗头痛、烦热、喉痛、淋病。该品种目前研究很少,据说取其叶做宵煮饮,即通夜不睡。其中茶油被中华人民共和国药典所收夕 木荷抗稻瘟病菌活性皂试的分离与鉴定载。山茶属于山茶属植物,具有凉血止血,散疲消肿之功效,现代研究证明其具有抗癌、抗〕及抑制乙醇吸收等作用,`油茶同属于山茶树植物,药理研究表明其具有抗菌“】、抗突变、抗癌、抑制心脑血管疾病幻及杀软体动物和鱼等作用,山茶科植物中皂营的研究开始于世纪末,其中以茶树中的皂试研究最为深入,年由日本学者青山新次郎首次从茶树种子中分离出来,被命名为`·'。这是世界上首次分离获得茶皂素'“,但他当时所得到的还不是茶皂素的纯结晶,之后,又有许多的学者开展了大量的相关研究。年,盯田佐一从茶叶中分离出了茶叶皂素结晶,'。年,日本东京大学的石馆守三和上田阳第一次从茶籽中提取获得了茶皂素的结晶',并确定了茶皂素的分子式为,茶皂素是山茶科山茶属植物皂素的总称,是一类结构及其相近的齐墩果烷型五环三菇类皂贰的混合物,习惯上称这种混合物为茶皂素,而把茶皂素单体结构称作茶皂贰。近三十年的研究表明,发现茶皂试具有抗菌、抗病毒、保护肠胃功能、降血脂等多种生物学活性。茶皂素的抗菌作用已在茶籽饼作为防治某些皮肤病的应用中得到体现。金继曙等'研究表明,茶皂素有较好的抗菌作用,对浅表真菌感染具有治疗效果。也有报道,茶皂素对多种皮肤病瘤痒有抑制作用。金继曙等汇”对油茶饼抗菌成分的研究表明,气茶皂素结构类似的油茶皂素,经体外和临床预试验均证明有较强的抗菌活性,对红色毛癣菌、石膏样癣菌、断发癣菌、黄色癣菌、紫色癣菌、絮状表皮癣菌的为一,对白色念珠菌的抗菌活性最强,人“为一。临床试用例皮肤癣菌病,取得了较好的疗效,痊愈率为,有效率为。在植物病害防治方面,山茶叶的抗菌皂试川',。具有抑制茶炭疽病或轮斑病菌的分生抱子发芽的作用,还使稻瘟病菌、水稻胡麻斑病菌、柑桔黑斑病菌、茶叶灰色霉菌、茶叶枯病菌、苹果轮斑病菌、梨黑斑病菌等的袍子产生异常发芽【'。茶皂素对植病的抗菌作用研究较少。针对茶树易受炭疽病侵害的现象,安藤康雄【'等研究发现,茶皂素对茶炭疽病的分生袍子发芽无抑制作用。山茶叶皂素作为生物农药己有专利报道'】。油茶皂素在油茶抗炭疽病中也起特殊的作用'。丫对从茶树中提取的混合茶叶皂素的抗微生物和炎症作用作了研究,证明茶叶皂素对皮肤致病真菌表现出良好的抑制活性,其对小抱霉属病菌的值为叩。丫和'等试验了茶皂素对六种不同种酵母的抑菌作用,证明茶皂素有很强的抑制酵母生长的活性。特别是近年来的药理活性研究发现,茶皂素粗提物对食品腐败细菌、 第一章文献综述真菌以及植物病原真菌的抗菌实验结果表明,茶皂素的抗菌作用已在茶籽饼作为防治某些皮肤病的应用中得到体现。木荷加'亦称荷木、荷树,山茶科木荷属常见植物。与山茶属同属于山茶科,全世界约种,我国有种。具有药用价值的有三种木荷月或原植物木荷、银木荷。,烤和西南木荷。,。,或毛木树。木荷树干高达米,嫩枝通常无毛,叶革质或薄革质,椭圆形长一厘米,宽一厘米,先端尖锐,有时略钝基部楔形,上面干后发亮,下面无毛,侧脉一对,两面明显,边缘有钝齿叶柄长一厘米,细长,无毛,苞片贴近粤片,长一毫米,早落,尊片半圆形,长一毫米,外面无毛,内面有绢毛花瓣长一厘米,最外一片风帽状,边缘多数有毛,子房无毛,直径一厘米,花期一月。分布于浙江、福建、台湾、江西、湖南、广东、广西、贵州等地。根皮和叶均可入药,味辛,性温,有大毒,攻毒消肿,杀虫催吐,主治疗疮,无名肿毒等古代常用于杀鱼,制作毒器、暗器的原药,已经有悠久的使用历史。浙江民间曾用茎皮与草乌共煮,熬汁涂抹箭头,猎杀老虎等野兽。银木荷嫩枝有柔毛,老枝有白色皮孔,叶厚革质,长圆形或长圆状披针形,长一厘米,先端尖锐,基部阔楔形,上面发亮,下面有银白的蜡被,有柔毛或者秃亮,侧脉一对,两面明显,全缘叶柄长一厘米。花数朵生枝顶,直径一厘米,花柄长一厘米,有毛苞片两卵形,长一毫米有毛粤片圆形,长一毫米,外面有绢毛花瓣长一厘米,最外片较短,有绢毛雄蕊长厘米子房有毛,花柱长毫米,茹果直径一厘米,花期一月。分布于云南、广西、广东、江西、湖南、贵州、四川等地。茎皮入药,味苦,性凉,有毒,清热解毒,杀虫。主治痢疾、蛔虫或绦虫病等。西南木荷高米,嫩枝有柔毛,老枝多白色皮孔,叶薄革质或纸质,椭圆形,长一厘米,宽一厘米,先端尖锐,基部阔楔形,上面干后暗绿色,不发光,下面灰白色,有柔毛。侧脉一对,靠近叶边常有分叉,网脉不明显,全缘,叶柄长一厘米,有柔毛,花数朵生于枝顶叶腋出,直径一厘米,花柄长一厘米,有柔毛苞片位于粤片下,早落,尊片半圆形,长毫米,宽毫米,背面有柔毛,内面有长绢毛花瓣厘米,外面基部有毛,子房有毛,葫果直径一厘米,果柄有皮孔,花期一月。分布于云南、贵州、广西等地区。树皮与叶入药。树皮,味苦、涩,性平,有小毒。解毒止痢、驱虫截疟、收敛止血。主治痢疾、肠炎、蛔虫症、消化不良、疟疾、子宫脱垂、鼻出血等。树叶,味涩,性平,消肿止血生肌, 木荷抗稻瘟病菌活性皂试的分离与鉴定主治外伤出血,蛇虫咬伤。近年来对木荷的研究报道中,研究内容仅涉及木荷防火性能及其机制、种群结构和动态、涵养水源功能、土壤肥力、造林技术以及呼吸特性等方面,但是有关木荷在医学及生物农药上的研究却很少。目前有苏小青,林思祖,曹光球等在木荷叶,及根生化物质对闽楠种子的化感效应研究中通过有机溶剂浸提和水浸提两种方式分别提取木荷叶、根的生化物质,并用闽楠种子发芽试验评价木荷对闽楠的化感作用。分析结果表明两种方式浸提的木荷叶和根的生化物质对闽楠种子的各项发芽指标均表现为一定程度的抑制作用就不同浸提方式而言,有机溶剂浸提的木荷叶和根生化物质对闽楠种子的发芽率、鲜物质量和干物质量的抑制作用强于水浸提的生化物质就不同木荷器官的生化物质而言,木荷根生化物质对闽楠种子发芽的抑制作用强于木荷叶生化物质。同时邓志勇,邓业成,刘艳华等在木荷加、心提取物对小菜蛾和菜青虫的拒食活性的研究中室内测定了木荷甲醇提取物对小菜蛾、菜青虫龄幼虫的拒食活性。结果表明,木荷树皮甲醇提取物对小菜蛾、菜青虫龄幼虫的拒食活性最高。木荷树皮甲醇提取物在的质量浓度下,对小菜蛾龄幼虫和的拒食率分别为和,拒食中浓度,分别为和对菜青虫龄幼虫,在的质量浓度下,和的拒食率均达到,拒食中浓度分别为和。木荷及其同科属植物的化学成分从现有的研究结构看,高等植物中抗菌的有效成分主要为丹宁、黄酮类、菇类化合物、有机酸,另外还有香精油,辑质等。在整个山茶科植物的研究中,研究比较多,生物活性及功效比较突出的是皂营和黄酮类物质,年等从山茶种子中分离到,,即。,,,、、、、、,继之又于年中分离到个新的皂普山茶皂素和到。其中所含的三菇皂普山茶皂普、、、均能有效地抑制大鼠对乙醇的吸收,大鼠口服即抑制酒精的吸收,其中山茶皂普活性最高,而去酸基山茶皂普的抑制作用很低,说明寡糖普的酸基结构中的当归酞是抑制乙醇吸收的必要部位。年罗永明等对茶子饼进行了初步的化学研究中发现,茶子饼中含有一油茶皂营,其含量达,接下来朱恒英等选用几种常造成皮肤浅表感染的真菌,用油茶皂普做体外抗菌试验,证明油茶皂普的抑菌作用较好,对玫瑰色毛癣菌作用最强,与克癣吟药水的抑制作用相近,最低抑菌浓度为,对红 第一章文献综述色毛癣菌和铁锈色小抱菌为。陈永培等采用了和标准试验菌株检测油茶皂普的抗突变作用发现,油茶总皂营具有较强的抗突变作用,其抗突变力与三种民间常用的抗突变中药紫草根、夏枯草和凤尾草相当。其中皂普类茶皂素物质在抗菌等方面表现出很强的生物活性。在山茶科中有毒植物的种类并不多,重要的有油茶和木荷等。在我们进行筛选实验时,发现油茶叶对稻瘟病真菌也有较强的抑制作用,于木荷相比较而言防治效果要弱点,油茶属山茶科植物,对其成分了解也相对较多,主要就是皂营、黄酮等物质。茶皂素,又称茶皂试、茶皂角普、茶皂普,其不仅具备有表面活性,而且具有生物活性。他所具有的生理功效,许多方面与瓜参素,海参素、、,七叶素等植物皂素的功能相近,包括了抗菌、杀菌、抗渗透和消炎、祛痰止渴、解酒等多种功效,对某些细胞生物合成也有明显影响。木荷为山茶科木荷属的常绿乔木,与油茶同属于山茶科,江西中医学院的罗永明等在对油茶枯饼进行了较系统的化学成分研究后,分离出种皂若。作为同科植物可以提供我们分离纯化木荷抗稻瘟病真菌成分时一些经验、依据和技术。在对木荷抗稻瘟病真菌活性成分进行初步的化学鉴识和研究发现,活性物质部分物理化学性质和茶皂试显示出很多相似性。相关的研究有银木荷岁'树皮和西南木荷反,,树皮成分的研究。陈维新哪〕从木荷属的银木荷苔'树皮中提取的皂试,经酸水解,分离鉴定了其皂贰元为一一一。等从同属植物中的西南木荷加,、中分离鉴定了一口一一和一。在云南民间用西南木荷力,。,乃的树皮和根皮杀虫和灭钉螺,兽医用其作驱虫药的应用,陈昌祥,叶海亚,申永乐等从西南木荷树皮中分离出个化学成分,经光谱解析和化学降解,分别被鉴定为一菠踢醇,一菠带醇葡萄糖试,表儿茶素和一新的三菇皂贰一。一当归酞酷一币一一。一「一鼠李毗喃糖基工一一葡萄毗喃糖基、升一一半乳毗喃糖基卜一一葡萄糖醛酸试。本实验室对木荷叶、叩进行乙醇的水溶液粗提取液经氯仿和水饱和的正丁醇萃取后处理,在木荷和乙醇提取液的水饱和正丁醇层中,该层主要含有的成分是三菇类化合物、黄酮、酚类。在对常见的水稻稻瘟病原菌进行抗性测定中,发现水饱和正丁醇层对所提供的稻瘟病真菌的抑制效果由为突出,具有很强的抗菌效果。 木荷抗稻瘟病菌活性皂贰的分离与鉴定木荷及其同科属植物的生物活性与化学成分的关系六七十年代时,南方水稻地区有将茶籽饼作为`、土农药'`用于防治水稻纹枯病和白叶枯病等病害的实践。茶籽饼中的有效成分就是茶皂素,茶皂素是一种五环三菇类皂试,由配基、糖体和有机酸三部分组成。皂试活性的强弱与其化学结构密切相关,且其组成中的各个部分都会对其活性产生一定的影响。就配基而言,若、环上存在极性基团如糖链、一定数目的轻基,将导致失活。环上极性基团较强,、环上取代基极性较弱,则溶血作用强。溶血活性较大的皂试,其配基还需要有一和邓一,且两者之间的空间距离有特殊意义,两者之一的轻基酸化将失去活性'〕。己有的研究表明,茶皂素的配基种组分表,其区别在于环和、环上的取代基不同,而这些取代基的极性有很大差异。可以推测,不同配基构成的各单体皂试的活性存在着差异。糖体部分对皂试活性也有较大影响。单皂试的溶血作用明显,酞化糖、吠喃瑙醇双皂试和中性三菇双皂试的作用较弱,甚至无作用,皂试元与糖体部分呈酸性的单皂试和双皂试的溶血活性呈中等。双皂试也无灭螺活性。己有研究表明,茶皂素的糖体部分均在配基环以试键一形式相结合,属单皂试,尚未发现双皂试存在。溶血活性的大小,还取决于配基环相连的糖体中的单糖数目,克分子糖的皂试活性强于克分子和克分子糖的皂试,一般以一克分子糖的皂试活性最强。且所连糖的种类也影响活性,配基环位连接葡萄糖一阿拉伯糖链的单皂试溶血活性较强。茶皂素虽属克分子糖组成的搪试,但已发现有两种糖链形式,两种糖链对茶皂素活性的影响有待研究。茶皂素中有机酸部分的构效关系也很明显。当归酸与惕各酸为顺反异构体,连接当归酸的山茶皂试,其抑制乙醇吸收的活性强于连接惕各酸的山茶皂试。茶皂素是多种单体皂贰组成的混合物,其组成在茶树品种间也存在着差异,如不同产地的茶皂素其灭螺活性存在着明显的差异。目前,对茶皂素生物活性的机理还缺乏足够的认识,除对鱼毒及溶血活性外。例如有报道认为皂试可影响肝脏乙醇脱氢酶及`】,而有的认为茶皂素并没有直接抑制乙醇脱氢酶曰在茶皂贰抗菌作用机理中,盛书强等从茶皂素对杀菌剂的增效作用及机理的研究中得出,茶皂素对稻瘟病真菌、黄瓜灰霉菌、香蕉叶斑病菌、水稻恶苗病菌、花生褐斑病菌等多种植物病原菌具有较高生物活性,表现为抑制病菌菌丝的生长和抱子的萌发。同时通过实验得出茶皂素的抑菌活性机理主要表现为以下几个方面抑制菌体蛋白质的合成。茶皂素对稻瘟真菌蛋白 第一章文献综述质合成的抑制活性较高,林的抑制率就达以上,从而表现出抑制稻瘟菌菌丝生长和抱子萌发的较高活性。提高菌体的超氧化物歧化酶活性,促进菌体细胞内的一氧化成分子,的积累对细胞造成伤害,破坏细胞内的新陈代谢组分,从而表现出对病原菌的生物活性,茶皂素对稻瘟病真菌和黄瓜灰霉菌的活性均与这两个方面的作用机理相关。茶皂素能降低稻瘟病真菌的过氧化物酶活性,使菌体细胞内的酚类、芳香胺和抗坏血酸等还原性物质的氧化受到抑制,影响菌体细胞的正常代谢过程,同时,另一方面,由于过氧化物酶活性降低,导致了有害物质玩的过量积累,使酶蛋白分子等细胞内组分受到破坏,干扰新陈代谢,表现出茶皂素对水稻瘟菌真菌抑制的高活性。木荷与山茶属同属于山茶科,据研究证明有人从树皮中分离得到与茶皂素及其相似的齐墩果烷型皂贰,在生物活性方面表现出于茶皂素相似的生物活性,关于木荷属植物相同类皂营活性物质对细菌、真菌和植物致病菌的作用方式是否与茶皂普相同仍未清楚,是否具有抑制其它能量和物质合成作用仍需进一步研究。表茶皂素的配基组成配基一一一茶皂素的糖链日日争毛黔日呈二二呈黔惕各酸反一一甲基一一丁烯酸当归酸顺一一甲基一丁烯酸茶皂素的部分有机酸结构茶皂素的标准分子结构式图茶皂素分子组成图' 木荷抗稻瘟病菌活性皂试的分离与鉴定本研究的基本思路水稻作为全世界最重要的粮食作物,也是因遭受真菌病害而损失严重的粮食作物之一,稻瘟病是其中引起严重损失真菌病害之一,也是一种分布最广泛的植物病害。利用化学农药对稻瘟病防治比较广泛。同时近年来的各方面的研究都表明,化学农药的大量使用使得很多病菌抗药性增强,同时也很容易造成环境污染和破坏生态平衡,土壤的变质,直接或间接地危害到人类的健康。随着人们对农业的可持续发展和人类与生存环境的协调,各国对于农药的安全标准越加严格。因此,开发对人体毒性低、安全性高、残留量低、无公害、生物活性高,选择性强的生物农药成为当今农药发展的趋势。目前以植物源为方向研制生物农药处于比较快的发展,对植物源农药的成分研究主要有以下几种有生物碱类、砧烯类、黄酮类、多酚类、皂普、有机酸、此外还有木质素类。近年来,国内外投入了大量的人力物力进行植物源农药的开发和研究,在这方面我们也做了一些有益的尝试,从一种乔木针叶植物的根部提取到一种强力杀菌抗病毒的活性物质,经大田实验显示其高效低毒,具有良好的开发前景,许多植物的提取物能抑制某些病菌抱子的萌发或阻止致病菌的感染和侵入。郁建平等人研究发现贵州金丝桃挥发油成分主要就是菇类物质,占其总含量的以上,该挥发油对白色念珠菌、绿脓杆菌和大肠杆菌有明显的抗菌作用。等从属植物种分离出两种新的菇类物质,能够抑制尖袍镰袍菌等病原菌及其分生抱子的萌发,国内企业也投入大量人力,物力进行植物源农药的研发,并取得明显的成效。木荷,,山茶科木荷属植物,该植物全株有毒,曾在世纪年代民间用该属植物的树皮和根皮熬制成农药杀虫和灭钉螺,兽医用其作驱虫药。近几年,国内目前木荷抑菌杀虫剂的文章还比较少。广西师大的邓志勇等在用种植物对小菜蛾的龄幼虫进行毒杀实验,其中木荷树皮对其毒杀效果十分好。随后又用木荷提取物对小菜蛾和菜青虫做拒食活性实验,发现其甲醇提取物对上述中小虫有较好的杀虫效果。本实验室从前期实验发现,木荷叶乙醇提取物对部分植物病原菌有很强的抗性,尤其是对稻瘟病有着很强的抑菌活性,其乙醇提取物在'的浓度对稻瘟病的菌丝抑制率为,研究木荷中抗稻瘟病活性的物质及其结构是一项非常有意义的事情,为此在原来本实验室研究进展的基础上,采用乙醇水溶液浸提木荷树叶,采用琼脂扩散法跟踪抗稻瘟病活性物质,依次经过大孔树脂柱层析,硅胶柱柱层析, 第一章文献综述一柱层析,最后借助制备式高效液相,寻找到两个抗稻瘟病活性物质,通过核磁、质谱、红外、紫外等光谱学手段,鉴定出其结构,为木荷抗稻瘟病真菌的防治提供有力的数据。为木荷作为植物源杀虫抑菌剂的实践应用提供强有力的实验数据。继而拟通过分子结构改造等方法将其改造成具有更强抗稻瘟病及其他病虫害的,为木荷在我国水稻稻瘟病的防治中应用提供试探性研究。 木荷抗稻瘟病菌活性皂试的分离与鉴定攻红二白已弄、卜、卜一一书一户尸卜司州防—辱已们不汁习刀了古材料试剂和仪器木荷叶、树枝皮、根茎皮样品木荷去树叶、树枝皮、树根皮年月一年月采摘于江西农业大学农学院。供试病原菌株水稻稻瘟病真菌五勿月'分别为一、一、一。分别有江西省农业科学院植保所、江西农业大学生物科学与工程学院分离分析实验室、中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资料持续利用国家重点实验室友情提供。培养基培养基土豆、葡萄糖、琼脂、蒸馏水、。袍子培养基米糠、酵母膏、琼脂鲍、蒸馏水、。分离用固定相材料及主要试剂柱层析用材料包括山东鲁抗医药集团有限公司、卿一、一一林、一、一预制板协度,柱层层析硅胶一目青岛海洋有限公司、薄层层析硅胶一青岛美高化工有限公司、薄层层析预制硅胶板青岛美高集团有限公司、薄层层析展开剂系统为氯仿一甲醇一水、苯一甲酸甲酷一甲酸,显色剂,葡萄糖、琼脂、石油醚、乙酸乙酷、氯仿、甲醇、正丁醇、二甲基亚矾、三氟乙酸、冰醋酸、甲酸、甲酸甲酷、苯、三氯化铁、浓硫酸、盐酸、毗睫、几的盐酸标准溶液,的标准液,蒸馏水等所使用的化学试剂均为分析纯。色谱纯甲醇和乙睛均为美国入公司生产,一半肤氨酸甲酷盐酸盐一只为美国公司产品,三甲基硅烷咪哩一衍川一记为瑞士公司产品,一葡萄搪和一葡萄糖分别购自美国和公司。主要仪器中药粉碎机一湖南中诚制药机械厂电热水浴锅一上海精 第二章材料与方法·密实试验设备公司数显调剂水浴加热仪浙江余姚工业仪表二厂电子分析天平奥豪斯上海公司,一、入尺一北京赛多利斯仪器系列有限公司梅特列一托利多仪器上海有限公司灭菌锅手提式灭菌锅·上海医用核子仪器厂,立式压力蒸汽灭菌器一上海华线医用核子仪器有限公司培养箱一、诬一广东医疗器械厂超声波仪冰箱容声一倪广东科龙电器股份有限公司,海尔一海尔公司扫描仪一上海中晶科技有限公司纯净水系统一浙江赛因科学仪器有限公司自动收集器一,旋蒸水浴锅一上海爱朗仪器有限公司减压旋蒸干燥器一上海爱朗仪器有限公司冷却水循环装置一上海爱朗仪器有限公司预备冷冻槽一上海爱朗仪器有限公司冷冻干燥机一几,,冷冻干燥真空泵一宁波爱发科真空技术有公司电热恒温鼓风干燥箱一上海跃进医疗器械厂超净工作台一江西安泰空气技术有限公司紫外可见分光光度计一北京普析通用仪器有限责任公司。全自动数字旋光仪一紫外可见分光光度仪红外光谱仪德国公司气相色谱一质谱联用仪美国公司、气相色谱柱一液相四极杆飞行时间质谱仪美国公司一入在质谱仪测定超导核磁共振仪一、丸二均为瑞士公司高效液相色谱所用仪器人度一洗一,认一一,一入美国公司色谱柱型号为一,协、一,林为美国公司。方法木荷抗稻瘟病真菌活性化学成分的提取样品处理 木荷抗稻瘟病菌活性皂试的分离与鉴定新鲜木荷树叶取全叶,树枝、树根去除表皮和木质部部分取真皮组织。自来水冲洗,晾晒,真空干燥箱烘干除水,中药粉碎机粉碎,过目样品筛,备用。木荷树叶、树枝皮、树根皮三部位的提取及配制在王岂,李小梅,郭宝江等植物三菇皂普的提取分离技术】的基础上,对木荷醇提方法进行了改进,方法是称取粉样在,乙醇溶液中混匀,密封室温浸提小时,提取液离心,,收集上清液,残渣采用同样的方法再次提取和离心两次,合并三次提取上清液,于真空减压旋转蒸发仪浓缩,得到固态醇提物,置于℃冰箱中保存,待测。化学成分的预实验方法对木荷树叶、树皮、树根皮乙醇醇提取物进行了化学成分的预实验,检测其是否含有皂试类化合物。其检测方法如下发泡性皂昔有降低水溶液表面张力的作用,多数皂营的水溶液经强烈振摇能产生持久性的泡沫,并不因加热而消失。用发泡实验可以初步判断皂营的有无及区别三菇皂营与街体皂营。①各取木荷树叶、树皮、树根皮乙醇提取物,加水溶解并振摇,同时在℃的水浴锅中加热,观察泡沫的产生及持续的时间,如产生持久性泡沫以上呈阳性。含蛋白质和乳液质的水溶液虽也能产生泡沫,但不能持久,很快消失,以此可区别二者。②各取木荷树叶、树皮、树根皮乙醇提取物,加水溶解,取支试管,分别加入和,各,再各滴加滴木荷树皮乙醇提取物水溶液,振摇,观察两支试管产生泡沫持久的时间。如两管形成泡沫持久时间相同,说明该样品中含有三菇皂营,如碱液管的泡沫较酸液管泡沫保持的时间长几倍,则证明含有吊体皂营。皂试的显色反应醋配一浓硫酸一反应各取木荷树叶、树皮、树根皮乙醇提取物,溶于醋醉中,加入浓硫酸一乙醉数滴,观察其产生的颜色变化。如样品中有浴体皂营,则会表现出一系列的颜色变化,从呈黄色一红色、蓝色绿色,最后呈蓝绿色,三菇皂若只能呈红或紫色。 第二章材料与方法木荷树叶的提取处理取全年中后半年的木荷树叶样品,准确称量,以比例,用乙醇溶液室温密闭浸提次,料液比分别为、、,每次间隔,合并提取液,减压抽滤后,℃真空减压浓缩,得到升无醇悬浊液。然后依次用氯仿,水饱和正丁醇溶液各萃取次,每次间隔小时,合并各萃取层共计得到四个级分,减压收干,称量其重量,氯仿层,正丁醇层,水层,乳化层。依据树叶含量的进行活性跟踪检测。大孔吸附树脂初步分离木荷抗稻瘟病真菌活性成分提取物的前处理及制备取正丁醇级分加入少量低浓度的甲醇水溶液溶解,充分混均,备用。树脂的前处理及装柱取工业级大孔树脂,甲醇溶液卜倍树脂量浸泡小时,弃去甲醇溶液,加入甲醇水溶液混均,取一支干净的玻璃柱,下段出口阀门上端放一团脱脂棉防止树脂流失。然后将处理好的甲醇树脂混合液沿玻璃柱的内壁轻轻倒入,甲醇溶液淋洗柱直到洗脱液清澈为止。然后用蒸馏水平衡到下端洗脱液的值为为止。树脂的选择表三种大孔吸附树脂的物理特性》·颗粒范围平均孔径比表面积树脂型号极性极性一一一极性一一一一非极性一一一将表中型号大孔吸附树脂经预处理后,各称量置于三角瓶中,分别加入用原液,为自然,温度为室温。放置在摇床上,静态吸附,单层滤纸滤去树脂,将树脂反复用无离子水冲洗,然后将冲洗液和残余液合并浓缩,测活,重复三次。往冲洗过后的树脂加入浓度为的乙醇,静态解吸,单层滤纸滤去树脂,树脂用的乙醇反复冲洗,然后将冲洗液和滤液合并,浓缩蒸干,加水溶解测活,重复三次。 木荷抗稻瘟病菌活性皂试的分离与鉴定按以下公式计算吸附量扭、吸附率、解析率和回收率。一吸附量二,一一吸附率仁肠夕—解析率回收率。一一原液的效价砰留二残余液浓度林洗脱液浓度扭。原液体积,残余液体积洗脱液体积树脂重量洗脱剂的选择选择梯度洗脱的方法确定对活性物质进行跟踪,洗脱剂采用甲醇一水二元溶剂进行洗脱,起始浓度为、、、、、、、、、、的甲醇水溶液,每个洗脱剂的体积为柱体积的倍,流速常压自然。定量收集各个级分,依据洗脱液梯度同时进行检视结合和显色将相同和相似值的级分合并,得到个层,即、、、、、、、,然后合并各级分,℃减压浓缩称重,依据树叶含量的。进行活性跟踪监测。树脂的再生首先用水溶液一倍柱体积洗柱,之后用一倍柱体积的蒸馏水洗同时对洗脱液进行监测,至中性为止。其次用水溶液一倍柱体积洗柱,之后用一倍柱体积的蒸馏水洗同时对洗脱液进行检测,至中性为止。最后甲醇溶液洗脱一柱体积后浸泡在其中。硅胶柱层析法分离抗稻瘟病真菌活性成分干法上样处理取层,甲醇溶解,样品硅胶拌样,℃恒温干澡箱小时除去有机溶剂和水分,取一支直径长度比的玻璃柱,柱的下端放一团脱脂棉,称取倍拌样的硅胶缓慢加入柱内,轻轻上下敦实硅胶,直至发出清脆的响声为止,保持硅胶面处于一个水平面上,把己经办好的样品沿漏斗缓慢加入到硅胶的上层,轻轻敲击 第二章材料与方法柱的外壁使其加样面与原硅胶面处于一个水平面,之后在加样面上再加一层高一的硅胶,使上层硅胶面,所加样品上层面,下层硅胶面三面合一,处于一个水平面。最后在上层硅胶面上加一团脱脂棉,防止因加洗脱剂把上层硅胶冲起,影响分离效果。展开剂的选择、展层以及显色根据样品极性大小,将少量样品溶于适当的溶剂中,毛细管点样于硅胶薄层层析板上,用电吹风将溶剂吹干。用两种或两种以上互溶而极性不同的溶剂配成一系列成极性梯度的混合溶剂,分别以此溶剂对板上的样品进行展开,展开后吹干溶剂,直接于和紫外灯下观察荧光,并用铅笔做好标记,接着将板进行和浸润一,电炉烤板显色,或根据需要以碘熏蒸显色,并用铅笔做好标记。对板的展开情况进行比较,分开点数多,且多数点的值在以内的为合适的洗脱剂。层析分离正相硅胶柱层析用极性从小到大的洗脱剂梯度洗脱,反相硅胶柱层析用极性从大到小的洗脱剂梯度洗脱。选择正相硅胶柱梯度洗脱系统比例起始为氯仿一甲醇一水介每个体积洗个柱体积。依据中展开的展开效果进行柱层析分离,常压室温自然流速洗脱,根据柱体积的大小,用三角瓶收集定量接收级分,结合主要活性物质最佳洗脱剂配比的洗脱剂体积,经薄层层析检验后将成分相同或相似者合并,得到个级分,即是、、入在、、、卜、,℃旋蒸减压收千各级分,称取重量,依据树叶含量的。进行活性跟踪监测。一柱纯化抗稻瘟病真菌活性成分样品处理加入少量毗咤溶解,℃冰箱中保存备用。树脂的前处理及装柱一反相柱材料的的前处理及装柱与相同。树脂的选择方法同中的相同。同时结合反相一,即一板的丁检视发现,即一的分离效果优于一,因此选择一的反相柱材料进行柱层析。洗脱剂的选择选择梯度洗脱的方法确定对活性物质进行跟踪,洗脱剂采用甲醇一水二元溶剂 木荷抗稻瘟病菌活性皂试的分离与鉴定进行洗脱,起始浓度为、、、、、六个梯度进行洗脱,每个洗脱剂的体积为柱体积的倍,流速常压自然。依据洗脱液梯度同时进行检视结合硫酸和】显色将相同或者相似级分分段合并共得到个层,即是、、、、、、,旋蒸减压收干各级分并称重,依据树叶含量的。进行活性跟踪监测。一柱再次纯化抗稻瘟病真菌活性成分前期处理参照中的步骤进行,然后用甲醇水溶液平衡一个柱体积,选择甲醇水溶液的洗脱系统进行梯度洗脱,起始梯度为、、、共计四个梯度进行洗脱,每个梯度洗个柱体积,结合一板进行检视合并,得到四个级分,分别为、、、、分别称取各级分重量,依据树叶含量的进行活性跟踪监测。半制备纯化抗稻瘟病真菌活性成分样品的处理分别称取、人左、、四级分各加入少量甲醇溶解,定容于的容量瓶中,用林滤膜过滤,用移液枪取加入液相分析瓶中,进行高效液相分析'。···入级份的分析条件仪器二,型分析液相色谱仪色谱柱一,林检测波长,柱温室温,流速进样量叩洗脱条件几亏二注释乙睛,一叹。二。入值级份的半制备条件仪器二半制备型液相色谱仪色谱柱一,林检测波长一,柱温室温,流速,进样量拼川进样方式标准手动进样器手动进 第二章材料与方法样拼定量环洗脱条件扭气匕厂片月,八`︺,﹃八︸月注释甲醇,乙睛,】。抗稻瘟病菌活性成分的生物和化学检定抗稻瘟病活性检测方法指示菌的培养将供试的稻瘟病菌个小种接种到斜面培养基上培养天,然后用无菌水将斜面培养基上的菌丝洗下,接种至灭菌后的平板上,涂布,在下培养天。检测方法采用抑制菌丝生长法测定各级分分离纯化的抗稻瘟病真菌活性,将各指示菌分别用无菌水洗下,接种至灭菌后的平板上,涂布,在℃下培养天。将配置好的培养基放到灭菌锅中,压力温度℃,持续灭菌时间为,灭菌完成后,取出培养基,在无菌操作台上,待培养基冷却至室温时,将各级分分离纯化的物质按树叶中。的浓度加入到培养基中,摇匀,倒平皿,每个平皿到培养基。用直径为打孔器打取事先培养好的供试菌落边缘菌块作为接种物。接种到含有提取液的平板上,以不含分离纯化活性物质的平板为对照,培养采用十字交叉法每隔小时测定菌落生长量大小,每个样三个对照,重复测次,并根据下面公式计算出菌丝生长抑制率。菌丝生时稀蟀一竺塑共兰止兰弓岑兰二竺立的监视溶样分别称取同级分样,分别加入原级分溶液充分溶解,备用。点样取一块硅胶板`在距底边处用铅笔画一条直线,平均分段,每段距离约为一,取一支毛细管吸取溶样,轻轻地点在事先准备 木荷抗稻瘟病菌活性皂试的分离与鉴定好的硅胶板上的刻度线上,每个样点滴,以点间距离可视斑点扩散情况控制点样的频率,点样扩散直径为一之间为最宜,之后用吹风机吹干。展层取事先用同配比展开剂饱和的展开槽,加入适量展开剂,将点好的样品的薄层放以一定的倾斜度放入展开槽的展开剂中,薄层板浸入展开剂的深度为距薄层板底边一为宜,切勿将薄层板上的样品点浸入展开剂中,密封展开槽,待展开到时,取出薄层板,晾干。显色显色,方式浸润烤板显色。显色,方式直接喷雾显色。抗稻瘟病菌活性成分的波谱分析紫外检测波长范围一,甲醇溶解,测量模式,扫描速度中速,狭缝,采样间隔。红外光谱分析检测范围一一',制样方式压片涂膜,检测器,光谱分辨率一,,扫描信号累加次数次。···、一入核磁共振谱样品的处理前处理样品经纯度检测之后达到以上用样品瓶准确称取样品'谱,'谱,低温真空干燥箱小时真空抽去样品中多余的水分。转移样品取一支核核磁管,向样品瓶中加入氖代试剂溶解,,少量多次原则,用无菌移液枪把样品瓶中的样品溶液转移到核磁管中使样品的高度为左右。检测程序样品管插入转子、在量规中测量并确定样品溶液与转子的相对位置、样品放入磁体、锁场、匀场、自动调节增益、采样、傅立叶变换、积分、出图内标,化学位移用表示,祸合常数用表示。·质谱条件,样品的前处理称取样品,甲醇溶解,林超滤膜过滤除杂,备用。样品检测离子源电喷雾离子源,扫描方式正离子扫描,检测方式多反应检测,电喷雾电压,雾化气压,气帘气压力,离子传输管温 第二章材料与方法度℃,碰撞室出口电压,电子能量离子极性正离子,富集时间娜,扫描范围一。活性成分的酸水解取级分,加入少一的二氧六烷水月的溶液,使样品溶解,然后加入的,采用水循环冷却℃水浴锅水解个小时,待反应终止后,冷却至室温,用的把溶液滴定至中性,℃真空减压除去有机溶剂,氯仿萃取次,合并萃取液,旋干,然后采用硅胶柱,以石油醚乙酸乙酷为流通相进行梯度洗脱分离纯化,萃余液水层蒸干,然后毗睫溶解,真空抽滤除盐,定溶于毗陡中,得到单糖的混合物。皂昔元分析分别取水解前,水解后样品各,加入甲醇溶解,定容于的容量瓶中,用件滤膜过滤,取用于液相分析。仪器型分析液相色谱仪色谱柱一只,件检测波长,柱温室温,流速,进样量川。洗脱条件一注释乙睛,,二。洗脱条件`、,注释乙睛,,。,。单糖绝对构型确定将单糖混合物溶于毗淀中,加入手性试剂一半肤氨酸甲酷盐酸盐,水浴密闭反应小时,接着在冰浴条件下,缓慢的向反应液中加入三甲基硅烷咪吟,继续在保温反应分钟,取反应液进行气相色 木荷抗稻瘟病菌活性皂试的分离与鉴定谱分析。采用同样方法制备单糖标准品的衍生物。通过比较样品和标准品衍生物的保留时间来确定糖的绝对构型。气相色谱柱而一仪器上测定,气焰离子化检测器,石英毛细管柱一,柱温““,程序升温,载气,进样温度,进样量林,分流比。 第三章结果与分析第三章结果与分析获得木荷中抗稻瘟病菌活性成分的取材部位和季节的确定木荷树叶、树皮、树根皮化学成分的预实验发泡性①各取木荷树叶、树皮、树根皮乙醇提取物,加水溶解并振摇,同时在℃的水浴锅中加热巧,木荷树叶、树皮、树根皮均能能产生持久性泡沫巧以上,同时也并不因加热而消失,因此可以初步判断,样品中含有皂普成份。②各取木荷树叶、树皮、树根皮乙醇提取物,加水溶解,取支试管,分别加入和各,再各滴加滴各取木荷树叶、树皮、树根皮乙醇提取物的水溶液,振摇,结果表明酸液管和碱液管形成泡沫持久时间大约相同,持续了约小时,说明样品中含有三菇皂营。皂试的显色反应醋配一浓硫酸二一盯反应,结果表明其颜色变化最后只能呈现红色,说明样品中含有三菇皂普。,木荷三部位乙醇级提取物对植物病原菌的抗菌性采用琼脂扩散法测定全年木荷三部位乙醇提取物对一供试菌抑制效果差异比较,结果如下表全年木荷三部位对一的抑菌率差异性一序号月份部位门一一枝,根,」 木荷抗稻瘟病菌活性皂贰的分离与鉴定,︸勺︸一今乃︸,斗办人八︸`、了︸加︺`了,声,月盈压`气、︸,山且,且今乞泊工万,,︸,︸气,办石乞表木荷月份和部位两因素方差分析表加'一”·、,变异米源平方和自由度均方值值因素间,因素间,,误差总变异刀、上表可知,因素和因素对抑菌率的影响均为极显著,因素间的交互作用对抑菌率的影响不显著即不存在交互作用。 第三章结果与分析、因素多重比较不同月份木荷抑菌物质变化表木荷叶不同月份的多重比较表叭了处理均值显著水平极显著水平··从上表可知,即月木荷各部分抑菌活性最强,但是月抑菌活性与月、月、月、月、月相比差异不显著。抑菌活性最高的月与最低的月差异极显著。就全年而言,不同月份木荷抑菌活性物质是存在变化的。表因素多重比较不同部位抑菌活性变化、,处理均值显著水平极显著水平气,︸上表是木荷不同部位抑菌活性的多重比较,可知木荷各部位抑菌活性差异极显著,树哈部分抑菌活性最强,树根部分次之,树枝部分最弱。表不同月份不同部位抑菌活性多重比较、,处理均值显著水平极显著水平,一︸,一勺八 木荷抗稻瘟病菌活性皂试的分离与鉴定气乌,一,一,︸气﹄今︸气︸勺泞、﹃勺,八,今,︸︻︶龟`、、、、、、、、,组实验抑菌活性差异不显著,即是树叶部位个月,,卜,,,的活性抑菌差异性与本部位其他月份的抑菌活性差异性显著,同时在月份中树叶粉的抑菌活性与本月份树根皮部位的抑菌活性的差异性不显著。因此本实验采用的试验样品为树叶的下半年月份。 第三章结果与分析提取木荷抗稻瘟病菌活性成分的技术路线和各步骤技术参数室温,,乙醇提取,木荷叶浸膏℃,旋蒸减压浓缩。混悬水依次用氯仿,水饱和正丁一各苯取,℃减压浓缩各层。氯仿层正丁醇乳化层水层柱洗脱系统甲醇一水一,卜叹,、下,,、,卜理卜理人、,一……二入入二木荷皂试木荷皂试大孔吸附树脂初步分离木荷抗稻瘟病菌活性成分的条件选择树脂型号的选择及装柱试验选用了种常用于实验室中植物活性物质分离的大孔吸附树脂,采用的是木 木荷抗稻瘟病菌活性皂试的分离与鉴定荷醇提取液是经过氯仿,水饱和正丁醇萃后的正丁醇层,再经抽滤除杂之后,用甲醇水溶解的待分离,测定各种树脂对上柱液的静态吸附和解析情况,结果见表由表可以看出,大孔吸附树脂在吸附量、吸附率、解析率和回收率这四个方面都是最高的。因此,选择大孔吸附树脂作为活性目标物的吸附剂。表树脂对活性物质静态吸附及解析结果、》,样品效价,,,样品义例寸重林叹川寸革解析革回收率林加原液残余液一残余液残余液本实验选用了种常用于实验室中植物活性物质分离的大孔吸附树脂,采用的是木荷乙醇水溶液浸提处理后的水饱和正丁醇级分的上样液。测定各种树脂对上柱液的静态吸附和解析情况,结果见表由表可以看出,大孔吸附树脂在吸附量、吸附率、解析率和回收率这四个方面都是最高的。因此,选择大孔吸附树脂作为水饱和正丁醇级分大孔树脂柱层析的吸附剂。洗脱的温度和流速柱温室温,流速常压自然流速。洗脱方式和流动相组成待样品溶液慢慢滴加完之后,即可开始洗脱,先采用水洗,之后再用浓度递增的甲醇水溶液进行洗脱,控制洗脱剂的用量和流速,洗脱方式虹吸流加梯度洗脱,流动相组成甲醇、水二元溶剂混合洗脱,梯度范围甲醇一水二一,每个单位为一个梯度,即是二。上样量和级分收集与判别上样量的确定可以用最大吸附容量可以用吸附饱和试验来确定,取一根直径为的玻璃柱,装入的柱材料,将样品溶于的甲醇中,缓慢上柱,流速自然,每个梯度洗个柱体积,依据检视进行合并得到层,然后℃减压旋干各级分,按树叶中。。的浓度进行活性差异分析。检视 第三章结果与分析正丁醇级分氯仿一甲醇一水一一苯一甲酸甲醋一甲酸一一告',`于阶裴锅、坷一渺杯。嘿纂娜警登臀贪粼徽轰勺裂翠粉︸惫奏登鉴介凡甘匆、庵鑫番一蚕拳殊戮图正丁醇级分经大孔树脂后各层的展板图一抑菌率差异性比较表正丁醇层经大孔树脂后各级分的抑菌活性差异性一》,、·级份重量浓度抑菌率抑菌率抑菌率入叹一,一一一一卜叹一一一卜庄勺尹产,叶``︺入︶入咬入正丁醇层经柱层析处理后各层活性庄乙叮户艺主门曰八口日八︵︺砚门并担早一巨可,圈“一四…兰旦鱼下下下一福目葡万窿而二翻'勤「戳,日的盛川乙七竖二口姚乙哭乙厂附乙行夕二乙上一、蒸嘿嘿飞厅了、,万、,】、井伪`产下阿、了“飞下一级份图正丁醇层经大孔树脂后各级分的抑菌活性差异性·一》,》'执℃、, 木荷抗稻瘟病菌活性皂试的分离与鉴定抑菌图片平皿顺序左,平皿顺序左七毛上下正丁醇层平皿顺序左平皿顺序左`上毛仁下平川冲顶序左平皿顺序左``卜下入下图正丁醇层经大孔树脂后各级分的抑菌扫描图·一》,术荷树叶乙醇提取物分别用氯仿和水饱和的正丁醇溶剂进行次连续等量萃取,分别得到氯仿级分萃取物、水饱和正丁醇级分萃取物、乳化级分提取物和水级分剩余物。并用各萃取物对稻瘟病真菌的抑菌活性进行测定,水饱和正一醇级分对稻瘟病真菌的为,为了进一步确定木荷树皮正丁醇萃取物抗稻瘟病活性物质,采用常规开管柱大孔树脂层析法,所得级分经薄层层析检验后,相同或相似成分者合并成个级分。将合并后的级分进行生物活性测定,确定活性成分所在级分。合并级分对稻瘟病真菌的抑菌活性测定结果表木荷树叶正丁醇萃取物大孔树脂层析分离得到的各级分中,组分冲柱流分对稻瘟病真菌有较高的抑菌活性,其小时、小时、小时的抑菌率分别为、、,而其余级分 第三章结果与分析小时内抑菌率均低于,由此可见,木荷树皮正丁醇萃取物大孔树脂柱层析分离得到的各级分中,其抑菌活性成分主要在级分,该级份对稻瘟病真菌的为,经过大孔树脂处理后,抗稻瘟病的抑制力提高倍,相对纯度为。硅胶柱层析法分离木荷抗稻瘟病菌活性成分的条件硅胶颗粒与装柱柱层析硅胶一目,取一根的玻璃柱,玻璃柱的下端轻轻的放入一小团脱脂棉,防止硅胶洒落出来,与水平面垂直的固定在铁架台,柱子上端加一个塑料的漏斗,使硅胶通过漏斗倒入柱体积中,然后上下缓冲体内的硅胶,待其在分布均匀柱内的硅胶在柱子下落时发出清脆声音为止,轻轻敲击上层的硅胶面,使其硅胶面与地面处在一个水平面上方可。洗脱条件洗脱方式梯度流加方式进行梯度洗脱。流动相组成氯仿一甲醇一水三元溶剂系统进行梯度洗脱,洗脱梯度为、、、、、、、、、。每个梯度冲两个柱体积。流速常压自然流速,柱温室温。上样量和级分收集与判别称取样品,按卜样品硅胶比进行拌样,干燥箱干燥过夜除去水分,然后加入事先装好的硅胶柱中,保持样品的上下面处在一个水平位置。然后在上层铺一层硅胶防止添加洗脱液是把样品冲起来而影星分离效果,同时每个梯度冲洗过程中添加检视,然后依据检视结合树叶中。含量的浓度进行抗稻瘟病活性差异性检测,然后进行合并,找出活性主要级分。检视 木荷抗稻瘟病菌活性皂试的分离与鉴定氯仿一甲醇一水,一一氯仿一甲醇一水一一册洲阵,神撼尸分再桃'姗书,娥一枷茄杯碱'引`城馨、·气鳃愁乳舞幸补队岁丫必、务、飞枷粤一予舔号噜顺序图层经硅胶柱层析各级分的展板图》尸,抑菌率差异性比较表层经硅胶柱层析各级分的抑菌活性差异性入》·》,么,、,钾级份重量浓度二幼川劲抑菌率飞抑菌率抑菌率今乞级份经硅脸柱层析后各层活性搜心︻︸祥誉草任口圈性飞口,一月翩门习圈刃厂喊刁谁象,「噢厂级了分图层经硅胶柱层析各级分的抑菌活性差异性·入》℃》,作,、' 第三章结果与分析抑菌图片平皿顺序左,平皿顺序上、上下下平皿顺序左,平皿顺序上上』下,下,平皿顺序左`平皿顺序上上下下图层经硅胶柱层析各级分的抑菌扫描图入,了木荷树叶正丁醇萃取物大孔树脂层析分离得到的各级分中,其抑菌活性成分主要在级分,为了进一步确定级分中抑菌活性物质,对抑菌活性最高的级分经筛选溶剂系统后,采用常规开管硅胶柱层析法,以氯仿甲醇水为洗脱系统,梯度洗脱溶剂极性变换顺序为氯仿一甲醇一水、、众、·、、、、、、,所得级分经薄层层析检验后,相同或相似成分者合并得到个级分,各级分对稻瘟病真菌抑菌活性测定结果见表。组分硅胶柱层析分离得到的各级分中,组分对稻瘟病 木荷抗稻瘟病菌活性皂武的分离与鉴定真菌有较高的抑菌活性,其小时、小时、小时的抑菌率分别为、、,而其余级分小时内的抑菌率均低于,由此可见,组分硅胶柱层析分离得到的各级分中,其抑菌活性成分主要还是在较大极性的级分。活性部位在级分中得到富集,该级分对稻瘟病真菌的。为,抗稻瘟病的抑制力提高巧倍,相对纯度提高为。一柱纯化活性成分的条件一柱材料颗粒与装柱取”一一娜柱材料,浸泡在一倍甲醇中保持,'之后滤去多余的甲醇,加入一倍的甲醇,取一支的玻璃柱,除去柱内壁上的水珠,选择湿法上柱,在柱下段放一团脱脂棉,打开柱下段的开关,把事先处理好的即一柱材料沿柱壁内测缓缓倒入柱体内,待页面平稳后,向柱内加入个柱体积的甲醇,淋洗柱材料中的杂质,然后选择的甲醇溶液淋洗柱个柱体积,待完成之后。选择甲醇溶液淋洗下端试纸检测至中性,之后选择起始浓度的甲醇溶液进行平衡一柱体积,至此柱子平衡完成备用。洗脱条件依据一板检视结果,,乞甲醇水溶液展开剂的盯大约在左右,梯度范围甲醇一水一,每个单位为一个梯度,即是人。常压自然流速。每梯度洗脱液,自动收集器收集,管,结合反相卿一板检视合并。上样量和级分收集与判别准确称取样品加入毗陡溶解,用移液管缓慢滴加对一柱的上层加液面上层,待样品完全吸附在柱材料上,开始从洗脱剂的起始梯度进行洗脱,采用自动收集器进行定量接收管,结合一反相板将相同或者相似的级分进行合并,得到个级分,即是、卜、入、、、、,然后依据树叶中含量的。进行抗稻瘟病活性检测。检视 第三章结果与分析州卜展开剂舰显色剂顺序柱尾图层经一柱层析各级分的展板图入了一》,抑菌率差异性比较表层经一柱层析各级分的抑菌活性差异性·》'一'、·级份重量浓度川抑菌率抑菌率抑菌率毛级份经一柱层析后个层析活性一绪草一圈翻下口嚼靡彝门洲爵一尸喂翻门尸灌象刁一斗瓤,厂君厂厂犷了扩级份图姐层经一柱层析各级分的抑菌活性差异性·入》'〕一了、一 木荷抗稻瘟病菌活性皂贰的分离与鉴定抑菌图片平皿顺序上下,平且项序上下平皿顺序平月创项字左上`卜下入入图卜”层经一柱层析各级分的抑菌扫描图·级分硅胶柱层析分离得到的各组分中,级分对稻瘟病真菌有较高的抑菌活性,该级分对稻瘟病真菌的。为。对抑菌活性最高的级分经展板后级分极性大小结合即一反相板,采用常规开管一柱层析法,以甲醇水为洗脱系统,梯度洗脱溶剂极性变换顺序为甲醇一水、、、、卯·以所得级分经一薄层层析检验后,相同或相似成分者合并得到个级分。各级分对稻瘟病真菌抑菌活性测定结果见表。级分硅胶柱层析分离得到的各级分中,级分对稻瘟病真菌有较高的抑菌活性,其中小 第三章结果与分析时、小时、小时的抑菌率分别为、和,级分对稻瘟病真菌抑菌活性较弱仅次于级分,其中小时、小时、小时的抑菌率分别为、和,级分的树为,抗稻瘟病的抑制力提高倍,同时次要抑菌活性级分的为,抑菌活性大约是的,为了抗菌活性物质的抑制力,其他级分的抑菌活性均小于,结合一薄层层析检验后二者的值差别很小,将两级分合并为级分,而其余级分小时内的抑菌率均低于,由此可见,级分一柱层析分离得到的各级分中,其抑菌活性成分主要还是在较大极性的级分,活性部位在级分中得到富集。一柱再纯化活性成分的条件反相柱材料选取颗粒、装柱、上样量、级分收集和判别与相司,洗脱条件据一板检视结果,甲醇水溶液展开剂的大约在左右,选择洗脱的起始浓度为甲醇水溶液,每单位为一个梯度即是,,常压自然流速,每梯度洗脱液,自动收集器收集,管。反相一板检视合并之后得到四个级分,即是人、、、级分,然后依据树叶中含量的。进行抗稻瘟病活性检测。四级分的分析入认一协、飞甲人 木荷抗稻瘟病菌活性皂试的分离与鉴定寻。。叫际、一一一了一一一公一一一一一,吐〔呢灯肖洲川叫间门日洲口︸八目`,州朗公卜叫鱿,`汽俩即了一刀,, 第三章结果与分析。月︸们六目以少叭创田叫州、,吮,一一一尹。一,叼众的丘伪,以肠,巧们,︸件月,们抑菌率差异性比较表层经一柱层析各级分的抑菌活性差异性,,》了一》,、·级份重量浓度抑菌率抑菌率抑菌率入入 木荷抗稻瘟病菌活性皂试的分离与鉴定工经即一柱层析后各层活性…一一卜月月卜一瀚卜一月蕊翔—一,一一一茶,八八八、砚洛箱熟卜纂翔一口抑菌率一兰卜州—澳互井卜一月雇粗—一``一一'一聋。。月…考卜月雀洲…卜」肇翔卜一一—竺登型蔓圣·卜一提汽卜一州一细—一—卜落——」一豢翔一一一一一—一`—一一一曰一荞翔口卜一森参卜一一一一井胭卜一月卜一〔'”一,级份一·一·图层经尸柱层析各级分的抑菌活性差异性·、,抑菌图片平顺序左平皿顺序左一平皿顺序左上上卜下,入叹下下图凡仁层经柱层析各级分的抑菌扫描图几位,一刃级分经卿一柱层析分离得到的各级分中,入咬级分对稻瘟病真菌有较高的抑菌活性,该级分对稻瘟病真菌的为。,对抑菌活性最高的人级分经一反相板,再次采用常规开管一柱层析法,以甲醇水为洗脱系统,梯 第三章结果与分析度洗脱溶剂极性变换顺序为甲醇一水、、、四个梯度,所得级分经即一薄层层析检视后,相同或相似成分者合并得到四个级分。各级分对稻瘟病真菌抑菌活性测定结果见表。级分一柱层析分离得到的各级分中,级分、级分和级分对稻瘟病真菌有较高的抑菌活性,四级分的抑菌活性差别为级分的为级分的。。为级分的为级分的。为结合高效分析液相结果得知,活性级分,,,存在有相同级分,其中级分中存在与级分中的抗稻瘟病活性成分不同种物质,级分中存在的抗稻瘟病活性成分与前三个级分都不相同,有待于进一步研究。各活性成分度纯度检验两皂昔的纯度检验级分液相分析结果洗脱条件胜`孟︸目三日,︸斗奇八,护曰八︸办`、二·注释乙睛,一。〔琦一,叫刀田吕日洲艾田邹刀以如曰目阳曰目目曰木荷一皂试`木荷皂贰` 木荷抗稻瘟病菌活性一皂试的分离与鉴定木荷皂试洗脱一条件',二,八︸办、︸勺,︸注释乙晴,叱。。八︸份田,。闻姆毋一产一一一“一口一田粗田七田刀田石田卫田王田刃田巧瓦匕'入匕木荷,皂试洗脱条件︸几了曰八︶︶办勺口,孟了认注释乙情,“。。叮础酬。一闷田田田已①山田①①忍田左及恙田瓜忿卫田洲图王田荃的姐业田田泞 第三章结果与分析,卜皂昔元的纯度检验级分液相分析结果﹄酬曰们训旧翻州飞」定钊叫,川`甲乙旧,碍田,洲田以,高效液相分析结果户`︸叱叫酬月酬胡于心,飞刁`油汀以气月,`杂质木荷皂普元 木荷抗稻瘟病菌活性皂试的分离与鉴定化合物的结构解析新化合物的结构解析化合物,淡黄色无定型粉末,正离子高分辨质谱一显示准分子离子峰为七协在例,,,结合碳谱和谱,推断其分子式为以,。光谱显示一,轻基及,一'拨基的吸收峰提示分子中可能存在经基和碳基。'一表明化合物具有■'一齐墩果烷型三菇的母核、以及两个,不饱和醋及个糖基的存在端基碳,,及。'谱显示个甲基单峰信号,提示个甲基均与季碳相连表一,以及两个甲基双峰信号。化合物经酸水解,得到水解产物普元,以及鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸。普元,为白色无定型粉末,一显示分子离子峰为,玲士【。”谱中显示个碳信号的存在,包括两组异戊二烯酷基信号【一'况,一'民,一罗价,一'倪〕,和两个酷碳基信号,根据其化学位移并与文献哪对照,可知其为两组当归酸酷基。此外,在碳谱中还观察到个归属于■'齐墩果烷型三菇骨架的碳信号,其中包括甲基,个季碳,一个双键碳一衍,一协」,以及六个与氧相连的次甲基信号【一,一,一,一,一,一。在江人生谱中,可以观察到■'齐顿果烷型三菇骨架的中的一,一分别与当归酸基中的碳基的相关信号。在谱中,可以观察到一与一,一与一,以及一,一与一的相关信号,进一步确认了经基的相对构型。综上所述,化合物的营元鉴定为一一口一一一二。该营元曾从无患子科文冠果属植物文冠果眯云,八,·,·如,中分离得到。进一步通过、一及谱确定化合物中糖基的连接位置。通过一和谱,把化合物分子中葡萄糖基,半乳糖基,鼠李糖基以及葡萄糖醛酸基四个糖基相应的碳一一归属。此外,在化合物的谱中,可以观察到葡萄糖基的端基氢「与半乳糖位碳信号阵,半乳搪基的端基氢协」与葡萄糖醛酸的位碳【改,葡萄糖醛酸基端基氢信号【〕与营元的位碳信号【改以及鼠李糖的端基氢阵与葡萄糖醛酸的位碳」的相关信号,因此,确定了糖链的连接位置和顺序如图所示。综上所述,化合物的结构鉴定为 第三章结果与分析,一一一一一一一渭一一一升节一一一一一【一一一岁一一了,命名为即是木荷皂试。化合物,淡黄色无定形粉末,高分辨质谱显示准分子离子峰为七协在一,,结合碳谱及谱,推断分子式为。与化合物的质谱数据相比,该化合物的质量数小。该化合物的'和'与化合物的信号特征非常相似,均为`一二一口一当归酚基一一玉蕊醇配糖体,不同之处仅在于糖基部分。化合物经酸水解,得到鼠李糖、木糖、葡萄糖及葡萄糖醛酸。此外,通过一和谱,将葡萄糖基,木糖基,鼠李糖基和葡萄糖醛酸基的碳谱信号一一归属。在谱中,可以观察到葡萄糖基的端基氢阵」与木糖位碳,木糖基的端基氢【与葡萄糖醛酸的位碳信号,葡萄糖醛酸基端基氢【改」与普元的位碳「饮以及鼠李糖基的端基氢信号〔丘与葡萄糖醛酸基的位」的相关信号,因此,确定了糖链的连接位置和顺序。综上所述,化合物的结构鉴定为、一一一,一,一一一渭一一一弓渭一一一一一一一产一一渭一一,命名为即是木荷皂试。 木荷抗稻瘟病菌活性皂贰的分离与鉴定化合物理化及波谱数据化合物,淡黄色无定形粉末,君一,,,二脚二、,一,,,,一,,一人`、,七汇入在例耐,。。,'一·一,人在,见表`一·一,,见表化合物,淡黄色无定形粉末,。甘一、、,,、、,,,。,,,一'二人、·,厂二【入左贬耐仁入左州,井'一入生一一诱,,见表'一入一诱,人在,见表化合物,白色无定形粉末君,训,,二,脱二此、,,,,,,,,一、,七卜项二一、·,七,训入仅,撇,见表'一琳,生,见表单糖绝对构型的确定与采用同样的方法制成葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖的标准品衍生物的保留时间相比较,一葡萄糖为,一葡萄糖为,化合物中所含葡萄糖的保留时间为,其绝对构型为一型一半乳糖为,一半乳糖为,化合物中所含半乳糖的保留时间为,其绝对构型为一型一鼠李糖为,一鼠李糖为,化合物中所含鼠李糖的保留时间为,绝对构型为一型一木糖为,一木糖为,化合物中所含阿拉伯糖的保留时间为,绝对构型为一型。 第三章结果与分析表化合物一的'入数据入仅一占,,占,,一一,一一万下甲一舟一勺斗,气办︸︵了,今才夕勺,一﹃︶、勺尸,,,一一一斗勺,月乙气勺八,︸产,﹁口︸产才﹄八,勺,︸户仁一一一」一一 木荷抗稻瘟病菌活性皂试的分离与鉴定表化合物一的'数据入一一百,,百勺︸气」一今`一'一,气」勺办尸八护一一一勺,,八曰,︸勺户月甲口,人胜`办,一刚一,︸】飞·一︸一气,气今︸﹃协︸气今︸八,汁勺只︸月︶、︶了︵︸勺或口︸】一,飞气一一,︸,勺一一一,才,一一一今,刀勺 第四章小结与讨论第四章小结与讨论木荷在古代就因为毒性强大而被广泛的使用,许多的实用经验和科学研究都证明,我们在研究了木荷对多种植物病原菌的抑制效果后,发现其对多种植物病原菌都有抑制效果,对稻瘟病抑制效果尤为突出。分离纯化出其具体抗稻瘟病菌活性成分单体是很有意义的。在关于山茶科植物的分离纯化研究中,研究的比较多的是山茶属的山茶和油茶,而整个木荷属的研究还是比较粗放的,为此我们在前人研究的基础上,参考相应的文献。对木荷叶中抗稻瘟病活性物质进行跟踪筛选,木荷树叶经乙醇水溶液浸渍提取后,经氯仿,水饱和正丁醇萃取之后,抗稻瘟病菌活性物质富集在在水饱和正丁醇级分中,为进一步了明确定木荷叶中抗稻瘟病真菌的活性物质,我们将水饱和水饱和正丁醇级分依次经大孔树脂柱层析,硅胶柱层析,一柱层析得到个高活性级分,即是、人度、、,各个级分的抗稻瘟病真菌活性为级分的。为级分的为级分的为级分的。为结合分析性高效液相,我们对级分进行了制备式高效液相分离纯化,最后从人级分中得到两个新的齐墩果烷型皂贰,紧接着我们对级分进行了酸水解,确定两个化合物的皂试元部分是完全相同的,以及其所含单糖的类型,最后借助核磁、质谱、紫外、红外、和旋光分析等分析手段,我们鉴定出其结构,即是,一二一。一当归酸基一一玉蕊醇一一。渭一一毗喃葡萄糖基一一岁一一毗喃半乳糖基一一升「一一毗喃鼠李糖基一一一一毗喃葡萄糖酸试。,一一一一一仃一一岁一一一叶岁一一·一一一一歹一一」岁一一命名为即是木荷皂试`一二一。一当归酞基一一玉蕊醇一一。岁一一口比喃葡萄糖基一一岁一一毗喃木糖基一一一【一一毗喃鼠李糖基一一」渭一一毗喃葡萄糖酸试。一一一一,一一一岁一一一叶渭一一厂,一一一一一一·一一渭一一一命名为即是木荷皂贰 木荷抗稻瘟病菌活性皂贰的分离与鉴定经数据库验证,该两种化合物为首次分离得到的新化合物。这对研究,,和三个级分的意义显得更为重要,为木荷抗稻瘟病活性物质的鉴定分析提出更有挑战性的问题。 参考文献参考文献张宏达《山茶属植物系统研究》中山大学学报自然科学篇论丛江苏新医学院编《中药大辞典》上册工,工,,,一」陈惠芳植物活性成分词典中国医药科技出版社【二,,,,,一二朱恒英,刘克坤,陈永培等油茶饼中油茶皂试体外抑菌试验福建中医药陈永培,郑鸣金,朱恒英等油茶饼中油茶皂试抗突变初步研究福建中医药一李萍何明,黄起壬等油茶皂试对缺氧复氧所致大鼠心脏损伤的保护作用及其机制探讨中草药李斌,罗永明山茶属植物化学成分及生物活性研究,江西中医学院学报青新次郎,药学杂志一〕赵世明茶皂素的化学结构及药理活性研究研究国外医药植物学分一石馆守三药学杂志一」金继曙等中国化学会第三届全国农副产品综合利用化学学术会论文集武汉中国化学会应用化学委员会武汉大学资源开发与应用技术研究所一刘淑霖武汉轻一〔科技一·金继曙等天然产物研究与开发一一」安藤康雄等茶业技术研究一【一'王敬文亚林科技一,飞一一一,二、,刀一`'二一苏小青,曹光球黄石德等木荷叶及根生化物质对闽楠种于的化感效应江西农业大学学报一口邓志勇,邓业成,刘艳华等木荷提取物对小菜蛾和菜青虫的拒食舌性农药一以认叭卜,`卜斗双入扭,、〕 参考文献陈惠芳植物活性成分词典中国医药科技出版社朱恒英,刘克坤,陈永培等油茶饼中油茶皂试体外抑菌试验福建中医药陈永培,郑鸣金,朱恒英等油茶饼中油茶皂试抗突变初步研究福建中医药一陈维新,吴大刚银木荷皂试元研究化学学报一」,一陈昌祥,叶亚,申永乐等红木荷树皮的化学成分云南植物研究一【沈一【,,,,一佗一一沈一,·,,侣,,,协`甲一一盛书强茶皂素对杀菌剂的增效作用及机理,湖南农业大学学报黎海彬,张敏,王邑等植物三菇一皂营的提取分离技术食品一〔业科技于〔周洪伟,许文博,王玉蓉等,赤芍总着提取与大孔树脂纯化工艺研究中医药学报加一【〕庚石山三菇化学天然产物化学丛书北京化学工业出版社碑张卫军,刘金福,张平平大孔吸附树脂对苦瓜皂试吸附特性的研究食品研究与开发,,王隶书法测定不同产地的三七叶中人参皂营的含量中国药师一互、当代有机化学译丛有机化合物的波谱解析华东理工大学出版社一丛浦珠质谱学在天然有机化学中的应用北京科学出版社【」飞,,吻`月一阱宁永成有机化合物结构鉴定与有机波谱学北京科学出版一庚石山三砧化学天然产物化学丛书北京化学工业出版社,一,,》,刀一【〕一一一,一乃',,,一陈维新吴大刚银木荷皂贰元研究研究简报一化学学报一 致谢致谢转眼间,三年的硕士研究生学习即将划上句号,但是,在天然产物的分离分析的研习我才一刚刚上路,遥想初入江西农业大学也的情形,还历历在目,恍如昨日,这一路走来,无限感慨,虽然其间我也迷茫过,仿徨过,苦恼过,但是还是摸爬滚打地走过来了。本论文的完成得到了导师霍光华教授和张颖君研究员的悉心指导,霍老师在论文选题、实验设计、实验实施中遇到的问题以及论文撰写上都给予了很大的帮助,整个实验过程无不凝聚着导师的心血和汗水。身正为师,学高为范,霍老师治学严谨、学识渊博、对待工作兢兢业业,这些永远是我学习的榜样,都给我留下了深刻的印象,令我由衷敬佩,这些将不断鞭策着我、激励着我,恩师是我今后学习做人、做事的榜样。他不仅在学术上悉心指导,而且在各方面关心着我,帮我解决工作和学习上遇到的问题,我清楚地记得霍老师怎样与我促膝而谈,谈如何做人、做学问的,这些都成为我一笔宝贵的人生财富,同时还要特别感谢师母,一感谢她对我这么多年来的照顾。张颖君研究员,作为我的第二导师,我对其充满深深的敬意,在分离提取的研究思路上给我无私的指导,令我茅塞顿开,受益匪浅。感谢中国科学院昆明植物研究所许敏副研究员在物质结构解析方面提供的帮助,感谢朱宏涛老师和王东老师在液相分析提供的帮助,老师们不同的学术背景和相同的治学态度指引和帮助着我一路走过。尤其是研三在中国科学院昆明植物研究所的日子里,老师们在学习和生活中提供的无私帮助,令我终生难忘。同时感谢何以能老师和李波老师帮助测定数据。感谢梁惠玲老师和瞿燕帮助测定数据,感谢余珍老师帮助测定旋光和紫外数据。特别感谢中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源可持续利用国家重点实验室主任刘吉开主任,为本实验分离分析后期处理提供的帮助。在此表示深深的感谢。感谢生物科学与工程学院,院长吴晓玉、涂国权教授、魏塞金副教授、黄华古书记、郭成志高级工程师、朱向东副教授、陈明辉老师、陈瑶老师和刘志文老师等在仪器设备和数据处理方面提供了极大的便利和帮助,在此深表感谢。我由衷感谢以上老师淳淳教导和帮助,在此向您们表示最真挚的感谢和最崇高的敬意。感谢我的郑伟师兄、刘军师兄、田立文师兄、吕君江师兄、同窗李磊、龙昊知、 致谢严伟、孙娜、周敏、喇小琴、蔡端午、同窗师弟冯华根、罗桂祥、袁志勇、吕涛、易磊、彭玉萌,同窗师妹孙娇娇、李芳、朱利芳、王衍明、吴肠、每每回想起和你们一起学术讨论时的一个个片断、生活中不起眼的点点滴滴,都会让人感到无比的亲切、温馨。还有那些和我一起走过来的友好朋友、同乡以及室友祝我们的友谊天长地久,没有你们的鼎力相助,我也是完成不了的论文。至此论文完成之际,我要感谢的是我最亲爱的父母,是你们给予了我健康的身体和健全的人格,谨以此文献给你们,也要感谢多年来在学习和生活中给予我极大支持的父母和家人。最后,向所有关心和帮助过我的人致以最诚意的谢意作者张长伶二一一年四月 致谢个人简历张长伶,汉族,中共党员,河南省项城市人,年月日出生。年月从信阳师范学院生命科学学院毕业,获得生物技术专业理学学士学位,年月在江西农业大学生物科学与工程学院微生物学专业进行研究生阶段的学习。研究方向是生物物质分离与分析,在导师的指导之下主要是从天然植物中寻找抗稻瘟病活性物质,在读研究生第一、二年期间,先后系统的学习了高级微生物、现代微生物实验、现代仪器分析、发酵工程与设备、生物实验方法与统计分析、工业微生物遗传与育种、生物工程专业英语、研究生英语、自然辩证法、科学社会主义、文献检索等课程。在此期间曾经担任研究生处学生团支部学习委员,生物科学与工程学院党小组副书记,为研究生处和院研究生研究生管理方面贡献自己的一点微薄之力,同时得到领导的认可并获得研究生处“优秀学生干部””和生物科学与工程学院“优秀学生干部,等荣誉称号。年月,根据导师霍老师的才旨导意见,结合实际情况,我被安排到中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用重点实验室进行硕士学位论文和一些相关研究。在国家重点实验室学习期间内,主要从事木荷中抗稻瘟病活性皂贰的筛选、分离、纯化以及鉴定工作,即是从木荷植物中分离鉴定出抗稻瘟病活性物质。同时就天然产物的提取、分离、纯化等技术手段进行了系统的学习和研究,同时对高效液相分析与制备,以及核磁、质谱、红外等光谱学理论知识的学习和实践应用也取得长足发展。 化合物图谱伙东一口一火工甲`。称落甲丁笠刀,鲡八口巡川二夕一一,成「书协了一。`二娜,翼咨`悦汁一一吮一乏三育重然`口二戛二`只下小间一',一一匕少`一一一于`,︼互终︸二即比石月`雀启月一簇债刁`甲谧,卜砂…万舀,吵小种咨砚`备`'心口二丫`,翻一二二日入, 化合物图谱︸︶﹄一一户、烫一妞·厂二、华公︼沪﹂巴￡佗`犷丫二月崎由'的翎玄叶甲兮。。乡一护,广口碳二'军,,·启弓﹃吵二虽吕一一一,、,呈一·︸,价侧七「一,凡一尸一认工任石钾护咚·事手·钾'合'一二诗户犷昼集、二于负罗滋'一`二`气自二一曰口印, 化合物图谱均划︶习洲尸丫`丫`口户土、二、心。、少一,沪从`一`几一乞一几`尸一一,巴田乞、「,—一灯气乒产一飞买若刃``飞`礴宾。沪“扩`一尹一产。`一一一一一一一一一一、「口」,夕流了一一`、一一一,勺、声食︼甲﹂`二卜一庵尸仑飞︸`沪寒沪触气,加沪…赤”护一尸一了」, 化合物图谱心之︸澹侮讥卜度犷蔺厄冬、·卜价少︸入卜田︸乏几啥旧人︸两︸︵曰的门、尸卜︸。一二﹄︸几。口︸一芝。价,的氛韶﹄︸一`一咬卜。`。自已,刊弓妻决,目切︸。`占工`,。艺口竺一己﹄︸`几价乏卜的一,一乏︸塑们门卜目卜刊一门四匡口亡吵人瀚︸卜田尹护︸一乙的`口户`一卜、`亡`。入内。一口叮肠路︸﹁口工的卜工︸`一脚仍一芝习立乏`。氏︸厅峨泥各卜`工`加七己一犷`口比宫卜尸内囚︸工一工。一己仍`断仁︸一卜一﹄些云口`己幼卜价曰可竺全口苦口…一”﹄。`入卜份田二三︸工一。二。`功咬口卜`。创。暇一白仁︸哎三﹄`厅。一切山的份悦`︸。︸一。﹄含喊尹。︸工。明卜匕二。︸`呢一口亡`一﹄二乏﹄一甲巴一力﹄`民只已口呀几几工尹`,脚今曰泊川泪妇泪尸泊践日︸、件衬碑愁与叭夕哥吻厂川一二公丁, 化合物图谱二工丁、、职工尸`止诚`「·'·卜一喻交众之攀努谈拐荟幕雾万罗巴巴些擎岁哪益簿案粤螃嵘鞋嘟牌蜻珠妾八一止、`山福`一孟习谕,入仅刀入,日月`穴。衣也土立``二、人枷二`、三、、、,李一兮三二三一一二贾勺咭尹知盗套一嘴白臼二一随飞`。鹿梦蕊“肠自`姿飞共气,`二奋矿卜,二豁吧痴唤口尸下边户口俨口俨扩李卜,跳加成一, 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