国家标准：gb 4789.41-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆菌科检验

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1、中华人民共和国国家标准犌犅４７８９．４１—２０１６食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验２０１６０８３１发布２０１６０９２０实施中华人民共和国发布国家卫生和计划生育委员会犌犅４７８９．４１—２０１６食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验１范围本标准规定了食品中肠杆菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）的检验方法。本标准第一法适用于肠杆菌科含量较高的食品中肠杆菌科的计数；第二法适用于肠杆菌科含量较低食品中肠杆菌科的计数。２术语和定义２．１肠杆菌科犈狀狋犲狉狅犫犪犮狋犲狉犻犪犮犲犪犲在给定条件下发

2、酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。２．２肠杆菌科计数犈狀狌犿犲狉犪狋犻狅狀狅犳犈狀狋犲狉狅犫犪犮狋犲狉犻犪犮犲犪犲按本标准规定方法，对每克或每毫升检样中的肠杆菌科进行计数。２．３最可能数犿狅狊狋狆狉狅犫犪犫犾犲狀狌犿犫犲狉；犕犘犖基于泊松分布的一种间接计数方法。３设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：３．１恒温培养箱：３６℃±１℃。３．２冰箱：２℃～５℃。３．３水浴箱：４６℃±１℃。３．４天平：感量０．１ｇ。３．５显微镜：１０倍～１００倍。３．６均质器。３．７振荡

3、器。３．８无菌吸管：１ｍＬ（具０．０１ｍＬ刻度）、１０ｍＬ（具０．１ｍＬ刻度）或微量移液器及吸头。３．９无菌锥形瓶或等效容器：容量１５０ｍＬ、５００ｍＬ。３．１０无菌培养皿：直径９０ｍｍ。３．１１无菌试管：１８ｍｍ×１８０ｍｍ、１５ｍｍ×１５０ｍｍ。３．１２ｐＨ计或ｐＨ比色管或精密ｐＨ试纸。４培养基和试剂４．１缓冲蛋白胨水（ＢＰＷ）：见Ｂ．１。１犌犅４７８９．４１—２０１６４．２缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤（ＥＥ肉汤）：见Ｂ．２。４．３结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（ＶＲＢＧＡ）：见Ｂ．３。４．４营养琼脂（ＮＡ）：见Ｂ．４。４．

4、５葡萄糖琼脂：见Ｂ．５。４．６革兰氏染色液：见Ｂ．６。４．７氧化酶试剂：见Ｂ．７。４．８无菌１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ：见Ｂ．８。４．９无菌１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ：见Ｂ．９。第一法肠杆菌科平板计数法５检验程序肠杆菌科平板计数法检验程序见图１。图１肠杆菌科平板计数法检验程序２犌犅４７８９．４１—２０１６６操作步骤６．１样品的稀释６．１．１固体和半固体样品：称取２５ｇ样品放入盛有２２５ｍＬＢＰＷ的无菌均质杯中，８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ均质１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，或放入盛有２２５ｍＬＢＰＷ的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打

5、１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，制成１∶１０的样品匀液。６．１．２液体样品：以无菌吸管吸取２５ｍＬ样品放入盛有２２５ｍＬＢＰＷ的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成１∶１０的样品匀液。６．１．３用１ｍＬ无菌吸管或微量移液器吸取１∶１０样品匀液１ｍＬ，沿管壁缓缓注入盛有９ｍＬＢＰＷ的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面），振摇试管或换用１支１ｍＬ无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成１∶１００的样品匀液。６．１．４按６．１．３操作程序，依次制成１０倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释１次，换用１支１ｍＬ

6、无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过１５ｍｉｎ。６．２倾注平板和培养６．２．１根据对样品污染状况的估计及相关限量要求，选择２个～３个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种２个无菌平皿。同时，分别吸取１ｍＬＢＰＷ加入两个无菌平皿内作为空白对照。６．２．２将１０ｍＬ～１５ｍＬ冷却至４６℃的ＶＲＢＧＡ（可放置于４６℃±１℃恒温水浴箱中保温）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，使样品匀液与培养基充分混匀。６．２．３待琼脂凝固后，倾注一薄层同样的培养基覆盖平板表层。防止蔓延生长并使

7、菌落特征更为明显。６．２．４待ＶＲＢＧＡ平板上层琼脂凝固后翻转平板，３６℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ。６．３典型菌落计数和确认６．３．１肠杆菌科典型菌落为有或无沉淀环的粉红色至红色或紫色菌落。选取典型菌落数在１５ＣＦＵ～１５０ＣＦＵ之间、无蔓延菌落生长的平板，只计数典型菌落数。菌落计数以菌落形成单位（ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔｓ，ＣＦＵ）表示。６．３．２其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半

8、个平板后乘以２，代表一个平板菌落数。６．３．３当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。６．３．４从每个平板上至少挑取５个（小于５个全选）典型菌落进行确认；如果有不同形态的典型菌落，则每种形态分别至少挑取１个菌落进行确认。６．３．５典型菌落的确认：ａ）分别将所挑选的每一个菌落，划线于营养琼脂平板，３６