广东部分地区犬流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定

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分类号学号硕士学位论文广东部分地区犬流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定郭昊指导教师刘永杰教授罗卫强研究员专业学位兽医硕士研究领域预防兽医学研究方向兽医微生物学与免疫学答辩日期二〇一三年六月 SEROLOGICALSURVEYOFCANINEINFLUENZAINSOMEAREASOFGUANGDONGANDVIRUSISOLATIONANDIDENTIFICATIONByGuoHaoSupervisors:Prof.LiuYongjieProf.LuoWeiqiangAThesisSubmittedtoNanjingAgriculturalUniversityInPartialFulfillmentofTheRequirementforTheMasterofProfessionalDegreeinVeterinaryMedicineCompletedinApril,2013CommencementinApril,2013 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文木包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者（需亲笔）签名丨年乙月十曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在―年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密请在以上方框内打“”）学位论文作者（需亲笔）签名：年月卞曰 目录目录摘要语辟献综述流感病毒的病原学特征流感病毒的结构与理化特性病毒的分类馳特血凝特‘性分子特征犬流感流行病学研究进展亚型犬流感亚型犬流感亚型犬流感亚型犬流感其他亚型犬流感犬流感检测方法研究进展血清学检测病原学检测犬流感的危害与公共卫生意义参考文献第二章亚型犬流感的血清流行病学调查材料与方法犬血清样本的收集菌株与血清血清处理血凝与血凝抑制试验棘样品来源与总阳性率宠物犬、农家犬、流浪犬亚型抗体阳性率比较不同区域宠物犬亚型抗体检测不同区域农家散养犬亚型抗体检测 广东部分地区犬流感血淸流行病学调查及病毐的分离鉴定参考文献第三章犬流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析材料与方法样品与实验动物主要试剂与仪器引物设计与合成的分离与鉴定全基因序列测定及遗传演化关系分析觀病毒分离与初步鉴定病毒鉴定基因核苷酸序列分析氨基酸序列比对遗传演化分析参考文献第四章亚型犬流感病毒蛋白的表达与纯化材料与方法病毒株、血清、菌株及载体主要试剂引物设计病毒提取与反转录重组表达质粒的构建与鉴定蛋白的诱导表达与纯化基因的扩增重组质粒的酶切鉴定重组蛋白的分析分析结果参考文献钱難 中文摘要广东部分地区犬流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定摘要犬流感是由犬流感病毒引起的一种高度接触性、传染性呼吸道疾病。已经证实有马源和禽源亚型流感病毒可以造成犬的感染，并引起犬的种内传播。犬与人类接触密切，目前尚不清楚流感病毒是否可以通过犬传染给人。因此，对犬流感的流行病学调查和病毒的监测具有重要公共卫生意义。研究利用血凝抑制试验对来源于广东省的份犬血清样本进行亚型流感病毒抗体检测，总体阳性率为。对不同类型、不同区域的犬抗体阳性率进行比较，结果显示宠物犬、农家犬及流浪犬的抗体阳性率分别为、和个别地区的阳性率超过。说明亚型犬流感已在犬群中流行，并且与近年的调查结果相比呈上升趋势。釆集广东地区份有呼吸道症状犬的鼻拭子，接种鸡胚分离病毒，并进行亚型鉴定和序列分析。分离获得株亚型犬流感病毒，分别命名为根据参考毒株的基因序列设计特异性引物，用的方法分别扩增两株病毒的个基因片段，克隆入载体进行基因测序，并构建基因进化树。结果显示分离病毒的个片段与韩国禽源犬、猫流感毒株、泰国分离株以及广东、江苏、北京、浙江、辽宁分离株的基因同源性均较高，达到，与泰国年分离株在演化关系上最为接近。氨基酸比对显示裂解位点、抗原位点、受体结合位点及潜在糖基化位点与禽源株相比均有突变。抗原位点也有突更，并在颈部有氛基酸插入。其中分离株较独特，颈部只有一个氨基酸插入，与以往犬流感病毒中国分离株不同。为了建立针对多种亚型犬流感病毒的检测方法，选取犬流感病毒中保守的核蛋白基因，克隆至载体，在大肠杆菌中诱导表达，然后进行和分析。结果显示，蛋白获得成功表达，重组蛋白分子量为，且与全病毒抗血清可发生特异性反应，表明该蛋白具有良好的反应原性。重组蛋白的表达，为建立犬流感抗体检测方法提供了物质基础。上述研究为进一步探讨犬流感病毒的生物学特征和传播机制奠定基础，并为有效检测、科学防控犬流感提供参考依据。关键词：犬流感病毒；分离鉴定；流行病学；蛋白； 广东部分地区犬流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定 AbstractinsertionofonlyoneaminoacidintheneuraminidasestalkwasfoundinA/canine/Guangdong/12/2012(H3N2),whichisdifferentfromotherCIVisolates.Inaddition,theNPgeneofH3N2CIVwasclonedintovectorpET-32a(+).TherecombinantplasmidpET-NPwastransformedintoBL21(DE3)andinducedtoexpresswithIPTG.ExpressionofnucleoproteinwasexaminedandidentifiedbySDS-PAGEandwestern-blot.Theresultsshowedthattherecombinantproteinwiththemolecularweightof66kuwasexpressedsuccessfullyandtheycouldreactwithpositiveserumagainstCIVparticle.ThisprovidesabasisfortheestablishmentofindirectELISAmethodtotestCIVantibody.Inconclusion,thisstudyappliesafoundationforthefurtherstudyonepidemiology,biologicalcharacterizationsanddetectionmethodsofCIV.KEYWORDS:Canineinfluenzavirus;Isolationandidentification;Epidemiology;Nucleoprotein;H3N2IV 缩略语及符号缩略语及符号简写英文全称中文全称犬流感病毒脱氧核糖核酸互补血凝试验血凝抑制实验酶联免疫吸附试验无特定病原聚合酶链式反应转录聚合酶链反应栖热水生菌聚合酶培养基磷酸盐缓冲液氨苄青霉素乙二胺四乙酸辣根过氧化物酶异丙基硫代半胱糖苷千道尔顿碱基对吸光度十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳三（羟）甲基氨基甲烷，’二氨基联苯胺开放阅读框 第一章文献综述第一章文献综述犬流感（是由犬流感病毒（弓起的一种高度接触性、传染性呼吸道疾病⑴。首次被报道是在年，美国佛罗里达比赛用灰猎犬感染亚型流感病毒，美国疾病控制中心将其命名为“犬流感”。该病毒遗传性和抗原性与当时的马流感病毒非常相似，随后相继有国家地区报道其他型引起犬只感染甚至死亡的情。感染后病犬多以咳嗽、打喷嚷、流鼻涕、呼吸困难为主要症状，偶尔引起体温升高。约的犬表现为亚临床感染，但这些感染犬和隐性感染犬的鼻液中含有大量病毒，成为流感病毒的携带者和传播者。因为犬可以迅速、持续地传播流感病毒，犬又是人类亲密的伴侣，所以可能对公共卫生造成威胁。目前已经引起广泛关注，国内外对其流行特点与变异情况、检测方法以及防控措施的研究也日趋增多。流感病毒的病原学特征流感病毒的结构与理化特性流感病毒（，属于正點病毒科，球型，直径。病毒具有脂质双层囊膜，由内向外可分为基质蛋白、脂类、和糖蛋白三层，膜表面具有致密分布的纤突结构。病毒的核衣壳在电子显微镜下呈致密的核心，卷曲的蛋白包绕螺旋组成。其核酸为单股负链分节段，核酸本身不具有感染能力。一般来说，流感病毒的热稳定性差，对外界环境的抵抗力不强，其感染性在°条件下就可丧失，°分钟便可灭活。可保存两个月以上，°可保存数年，冷冻干燥后°可长期保存。流感病毒对紫外线、乙醚、氯仿、两酮等有机溶剂及各种消毒药表现敏感，均可使其灭活。在范围内病毒表现稳定，小于以或大于时病毒的感染力很快被破坏，为左右能使病毒的血凝素蛋白结构发生改变，其轻链的区域溶血序列裸露，使红细胞发生溶解。而在自然条件下，因为受到动物体内有机物如鼻腔分泌物、粪便等的保护，流感病毒对于外界环境的抵抗力会大大增强。病毒的分类根据其核蛋自和基质蛋白抗原性的差 广东部分地区犬流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定异，将流感病毒可分为、、三个病毒属，其中型流感病毒宿主范围最大，可自然感染禽类、人类和其他哺乳动物，如猪、马和犬。型流感病毒最容易发生变异，危害也最为严重，常引起大流行和中小流行；而型流感病毒自然状态下仅感染人类；型流感病毒主要从人分离到，也能从猪分离到。目前发现的均属于型流感病毒。根据血凝素（和神经氧酸酶（抗原性的不同，型流感病毒又分为个亚型以及个亚型，分别用和表示。和在动物感染流感病毒中发挥十分重要的作用，的作用是使病毒粒子吸附在宿主细胞的表面受体上，而参与病毒的装配和出芽使病毒释放，因此在分类上利用两者的抗原性对病毒进行分类。病毒的和亚型可依据血凝抑制实验（和神经氨酸酶活性抑制试验（进行划分。根据感染对象的不同，流感病毒通常被称为人类流感病毒、禽流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒以及犬流感病毒等。增殖特性流感病毒可以在鸡胚和多种细胞中增殖。鸡胚尿囊液中的蛋白可以对病毒起到保护作用，因此病毒在鸡胚中增殖较稳定，在°可保存数周，或冻干可长期保存。利用病毒在鸡胚中增殖的特性可以用接种鸡胚的方法分离和扩增病毒，流感疫苗的生产上也常用鸡胚作为材料。流感病毒可以在多种细胞中增殖，如胎猪肺细胞、猪肾细胞、人胚肾细胞、牛肾细胞、鸡胚成纤维细胞等，病毒接种细胞可以产生细胞病变。目前在细胞系中细胞最为敏感而且应用最多，然而连续传代，病毒对细胞的感染性会降低。在自然状态下流感病毒对于鸡、火鸡和鸭等禽类动物易感，因此在研究中常应用作为试验动物。另外，流感病毒也可以在一些人工接种的试验哺乳动物如小鼠、猴、水紹和猪体内增殖。血凝特性流感病毒在一定条件下可以凝集鸡、膝鼠、大鼠、小鼠、兔、牛、和人等二十多种血红细胞，凝集谱广泛。不同亚型或者同一亚型的不同毒株的血凝价相差很大，因此，血凝性与流感病毒的致病力强弱并无直接关系，但在流行病学和生态学上具有重要的意义。大部分情况下，血凝素对热敏感稳定性差，但部分稳定性强的毒株可能有跟多机会接触不同的宿主，这也可能是引起流感病毒大流行并影响其遗传演化造成种间传播的原因。 第一章文献综述分子特征除型流感病毒的基因分为个节段，型和型流感病毒的基因组由大小不等的个独立片段组成，依据基因组从小到大依次是、、、、、、、，共编码种蛋白。病毒的核衣壳由核蛋白（包裹，、和分子与基因的’端相连组成核糖核蛋白复合体。囊膜表面有许多放射状排列的纤突，纤突分为杆状的三聚体的血凝素（分子和蘑燕状的四聚体的神经氨酸酶（，二者在囊膜上的比例在不同流感病毒中差别很小，为。基因编码和蛋白，为病毒的非结构蛋白。所有的基因片段中，’端的前个核苷酸以及’端的个核苷酸均高度保守，而且是病毒转录的重要核苷酸识别位置，其中的部分序列可以反向互补形成发夹结构。病毒的聚合酶可以结合在发夹结构的柄部，因此认为这一结构是识别病毒酶所必须的。血凝素血凝素（蛋白是以三聚体形式存在于嚢膜表面，在病毒吸附及穿膜过程中其关键作用，同时可以刺激机体产生中和抗体，是至关重要的免疫原性蛋白。由基因片段编码，分子量为，是典型的型糖蛋白。由和亚单位组成，两者通过二硫键相连，在感染的过程中能否被水解是病毒感染细胞的先决条件。在细胞内质网内合成由内质网运运输到高尔基体并被不断修饰，由二硫键连接并折叠成三聚体到达细胞膜并嵌入胞膜脂质双层，最后在病毒出芽释时被带到病毒囊膜上。合成后要发挥作用要经过切割的过程，包括端信号肽的切除及的产生。和的分子质量分别为和，经过二硫键和其他非共价键的作用形成一定空间结构。蛋白作用于宿主的特异性细胞受体是唾液酸糖脂或唾液酸糖蛋白，不同种属动物有不同的流感病毒受体。前体的裂解能力与病毒的毒力呈正相关，表现为裂解位点上的碱性氨基酸的数量以及裂解位点附近糖基化位点的改变。低致病性的毒株裂解位点上只有一个碱性氨基酸，只局限于在肠道或者呼吸道复制，表现为亚临床感染。而高致病性的流感病毒在裂解位点上具有数个碱性氨基酸，可以被分布于宿主全身的多种细胞蛋白酶识别，可引起宿主各系统变化，导致全身性、致死性感染。此外，裂解位点附近糖基化位点上的糖链也会影响被蛋白酶切割的敏感性，进而影响流感病毒的致病性。因此，的变异对于病毒致病力的影响是至关重要的。 广东部分地区犬流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定神经氨酸酶神经氨酸酶（由病毒基因组片段编码，分子量为编码或个氨基酸，也构成病毒囊膜的纤突。是一种核苦酸外切酶，属于类糖蛋白，其端在胞内而端在胞外。能从病毒和感染细胞上出去唾液酸残基，防止病毒粒子的聚集，这一功能对于流感病毒的感染性非要重要。的一级结构包括个区域：氨基端胞菜尾、非极性跨膜区、莲部序列和头部序列。氨基端胞衆尾区的序列高度保守，而且其缺失并不影响蛋白转移至病毒颗粒表面和的酶活性⑴。非极性跨膜区可以固定并在运输过程中起信号肽的作用。的每个单体的头部顶端有酶活性的催化中心，基部氨基酸的插入也与其活性相关。此外，病毒的释放和扩散要求和两种蛋白达到某种精密的平衡，与宿主细胞受体的亲和性太强可能影响破坏受体的活性，减弱病毒的释放。例如，等发现当禽流感病毒为适应新宿主而改变受体结合活性的同时伴随着序列的改变，证明了和功能方面的匹配对病毒感染致关重要。而且目前也不是所有的和亚型的流感病毒均可以在自然界可以分离到，因为如果和不平衡，可能很难得到稳定的重组毒株。核蛋白核蛋白（，分子量约，构成病毒核衣壳，而且是一种多功能的蛋白质。由个氨基酸残基组成，富含，是细胞毒性淋巴细胞识别的主要抗原。它能在病毒转录和复制过程中与结合形成复合体，使稳定，从而免受的作用。此外，在病毒基因组转录、复制以及宿主的特异性等方面也起到重要作用。等发现在病毒粒子出芽的过程中，可与蛋白相互作用发挥作用，使核蛋白在病毒感染的后期滞留在胞楽中。基质蛋白流感病毒的基质蛋白（是病毒粒子中含量最丰富的蛋白，其基因组片段有两个阅读框，分别转录和翻译为和蛋白，它们在演化中相对保守。蛋白由个氨基酸组成，分子量为，是病毒的主要结构蛋白，并可在病毒感染过程中可发挥调节作用。等人的研究发现蛋白对亚型高致病性禽流感在哺乳动物的致病力有影响。蛋白是一种小型的非糖基化蛋白，其功能是作为一种离子粟，降低并维持细胞内含体的。 第一章文献综述非结构蛋白非结构蛋白（由基因编码，分为和两种蛋白。主要在核内，为流感病毒唯一的非结构蛋白，在胞衆内，为结构蛋白，两者分子量分别为和。蛋白有两个核定位信号区，分别在第位氨基酸残基和第位氨基酸残基处，这些序列在不同型流感中都相同或者高度保守。是型干扰素的诘抗剂，除了在核内聚集之夕卜，可能在病毒逃逸宿主免疫反应的过程中起到重要作用。聚合酶蛋白聚合酶蛋白（由、、组成，它们是流感病毒粒子中分子量最大的个蛋白质，大小分别为、和。聚合酶蛋白变异速度较慢，在各型流感病毒不同亚型之间同源性较高。这种蛋白质在氨基酸序列上有一共同特点，即都含有一特定亲核序列，该序列使这几种蛋白质能在胞楽合成后能顺利进入细胞核。具有多聚酶活性，但缺乏校对功能，这是流感病毒变异性强的重要原因之一。可识别并裂解宿主细胞端帽子结构，获得宿主的帽子结构用于病毒转录。有研究表明，蛋白是亚型禽流感病毒突破种间屏障传播给哺乳动物的因素之一，。由个氨基酸残基组成，、和形成复合体与的’端形结合形成核糖核蛋白颗粒，在合成中作用目前还不清楚。犬流感流行病学研究进展犬能够感染流感病毒的报道可以追溯到世纪年代，等人首次证明人的流感病毒可以感染犬，并且在犬的血清内可以检测到相应的抗体。虽然很多学者也验证了犬对流感病毒的感染，但此后并没有发现在犬群众发现流感病毒的自然感染或流行，也未自然分离到流感病毒】。直到年，美国佛罗里达的灰猎犬群体暴发呼吸道症状，研究者从病犬肺勾莱组织中分离到了流感病毒】犬能自然感染流感病毒才得以证实。近年来，包括马源、禽源、禽源及其他亚型的型流感病毒感染犬、猫的情况相继被报道。亚型犬流感年，美国佛罗里达灰猎犬群暴发呼吸道疾病，许多赛犬的症状表现为咳嗽、喷嚷和体温升高等，并且其中一些犬只最终死于出血性肺炎。等人从病犬体内分离到了流感病毒，并利用免疫组化的方法在病犬的呼吸道中检测 广东部分地区犬流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定到亚型流感病毒抗原，在康复犬血清中检测到相应抗体。经证实感染犬的流感病毒为亚型，与马源流感病毒具有很高同源性。其实早在年至年之间，美国及其他国家许多犬饲养场的犬就发生过与流感症状类似的呼吸道疾病，因此研究人员推测当时流行的呼吸道疾病与流感病毒有关，病毒可能已经在犬群中存在了更长的时间。等人】在一项对于犬流感的回顾性血清学调查中发现，年至年之间收集的赛犬血清样品的流感病毒亚型抗体阳性率分别为、、、、和，这与当时赛犬的呼吸道疾病暴发的规律相吻合，不同时期的血清样品阳性率差异的变化规律也论证了早在年就已经在犬群中开始流行。年英国对猎犬的血清学调査中血清样品阳性率达，这些调查都进一步证实了马源亚型流感病毒可以通过自然接触感染犬’。年该病毒再次席卷了美国个洲，导致了个赛犬场大量的犬发病。年发病的犬的分布己扩散至个，到年，美国已有个洲报道了犬感染流感病毒，病毒不仅在赛犬中流行，也感染了宠物店或词养场的犬。亚型犬流感亚型流感病毒对多种哺乳动物（如猫、虎、小白鼠等）敏感，并且可以造成感染动物死亡。年，泰国报道一只家猫感染亚型流感病毒死亡，发病猫表现为呼吸困难和体温升高的症状，检发现脑部充血、肺水肿和严重的肺炎。年泰国等也报道一只感染了流感病毒的犬出现高热、呼吸困难症状，最终死亡，研究表明这只犬可能是因为食用了感染流感病毒的病死鸡肉。而对泰国份犬血清抗体的血清学调查显示，约的犬体内有特异性抗体。为确定是否能进行种间传播或传染给人，等人】用两种不同的高致病性禽流感病毒人工接种试验动物，结果临床症状不明显，并且未从实验动物体内分离到病毒。等人在虽然在攻毒后分离到了滴度较低的病毒，但与人工感染犬同居的犬并未被传染。年，中国的陈化兰等人用野生鸟类中分离的禽流感病毒通过鼻接种腔和气管接种两种方式对两组比格犬攻毒。结果所有犬均表现出食欲不振，并有体温升高、咳嗽、呼吸困难、结膜炎等症状，一只经气管接种的犬死亡。经鼻腔接种病毒的犬的鼻拭子和粪便拭子中都分离到了流感病毒，存活的犬的血清中都检测到了流感病毒抗体。因此，由于犬对亚型流感病毒的高度易感性，不能排除犬、猫作为流感病毒传播中间宿主的可能。亚型犬流感年，一些国家相继报道了犬、猫感染亚型流感病毒的病例。 第一章文献综述首次报道从家猫体内分离到一株亚型流感病毒，该毒株与美国年人类流感的分离株的、、基因的同源性均很高。由于饲养该发病猫的家庭此前有人发生了流感样疾病，因此推测猫感染的亚型流感病毒可能来源于人。同年月月，意大利等人检测了份犬血清的流感抗体，结果份血清呈阳性，但至今尚未有关亚型犬流感病毒在犬群中水平传播或与人相互传播的报道。亚型犬流感年，韩国南部某省的犬发生以高热、咳嗽和流鼻液为特征的呼吸道疾病，随后有犬只死亡。等从发病犬体内分离到个亚型流感病毒毒株，通过基因序列测定与遗传演化分析表明，毒株与禽源亚型流感的同源性最高。将分离的病毒接种于周龄的比格犬，结果实验犬均表现出体温升高、咳嗽和流鼻涕的症状接种后的天可以在犬体内检测到升高的血清抗体。病理剖检可见肺部的实质性病变，组织学检查可见呼吸道有炎症和坏死。随后的一项血清学调查显示，对来源于只圈养犬和只是宠物犬的份血清学的检测显示的犬血清呈阳性，甚至其中一个犬饲养基地的阳性率达到。该调查表示亚型的犬流感已经在韩国的犬群中流行，后续的实验也证实了亚型流感病毒可以引起犬和犬之间的水平传播。在我国，年广东地区首次分离到，通过基因序列的测定和进化树的分析，结果分离的病毒与禽源流感病毒亲缘关系较近，并与年的韩国株接近。在此几年我国江苏、北京、辽宁、浙江相继分离到了，，试验结果证实均为亚型流感病毒，说明亚型已经在我国造成了广泛的流行。血清学调查方面，杨新艳等对来自宠物医院、农家犬、流浪犬的份血清的检测中检出亚型流感病毒抗体的阳性率为。粟硕等对广东省地市的份犬血清样品进行了亚型的抗体检测，结果表明抗体阳性率为局部地区阳性率较高。针对目前我国亚型的流行情况，要避免的暴发和流行，应当进行更多调查研究并制定有效措施。其他亚型犬流感目前分离到的大多来源于异种动物，说明流感病毒可以突破种间屏障而传播。流感病毒容易变异，为了适应新的宿主，其基因也可能发生了突变或重组。我国山东首次分离到亚型流感病毒，通过基因序列的测定和分析，推测该病毒可能为病毒与病毒的重组新病毒虽然尚未发现该病毒可造成大范围感染和传播，但其对于研究犬流感的变异与流行具有实际意义。 广东部分地区犬流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定犬流感检测方法研究进展血清学检测血凝与血凝抑制试验目前对于血清抗体的检测方法主要依赖传统的血凝（和血凝抑制试验（，病毒颗粒表面的蛋白可以识别并吸附于红细胞表面受体，并与之发生特异性结合。因此可以利用不同亚型的流感病毒对待检血清样品加以定性分析。张端秀等利用和方法对份犬血清和份猫血清进行了亚型的抗体检测，检出率分别为和。利用该方法的优点是特异性好，可以对血清抗体进行分型鉴定，缺点是操作繁琐，主观判断会影响试验结果。酶联免疫吸附试验（方法是以酶作为标记物、抗原抗体之间免疫结合反应和固相吸附为基础的测定方法。该方法具有敏感、特异、简单、准确的特点，适用于临床样品的检测以及血清流行病学调查。等利用方法和同时对份犬血清样本进行检测，阳性率分别为和，结果表明方法对于的检测比更为敏感。黄柏槐等利用基因工程方法表达亚型的表面抗原蛋白，建立了一种可以检测亚型的间接方法，试验证明特异性和重复性良好。目前针对的检测方法尚不多，国内商品化试剂盒的研制也不够成熟。病原学检测逆转录聚合酶链反应（分子生物学技术早已广泛的应用与流感病毒的快速诊断，可从基因水平检测病毒，结果可靠，具有高度的敏感性和特异性。应用该方法对人和禽流感病毒直接进行检测和病毒分型的报道很多，而这种方法也是目前用于鉴定较多、较可靠地方法。余利旋等经过丁的扩增、克隆，成功鉴定并获得了分离株的序列。的基因较为保守，可据此设计引物进行检测，同时可在、基因内部设计引物进行进一步的亚型鉴定。利用还可鉴定出病毒的全基因序列，用于序列的测定以及进化关系的分析。劳光定量劳光定量技术可以实现对病毒模板定量检测，具有操作简便，敏感性和特异性好的特点。其优点是检出率高，可以防止检测中产物后续操作造 第一章文献综述成的污染及假阳性，虽然不能在基层推广，但在般条件的实验室或诊断中心均可以应用。我国已经建立了亚型禽流感的焚光定量检测方法，年亚型流感暴发以后，世界卫生组织推荐使用探针法突光定量的检测方法，该方法在流感的诊断、监测和防控中发挥重要作用。由于我国尚未展开对的大面积监测，目前该方法在的检测中应用较少。逆转录环介导等温扩增环介导等温扩增（技术由于其反应迅速，灵敏度高等特点逐渐在分子生物学领域受到重视并应用于病毒的检测。在国内，高晓宇等根据￥相对保守的片段设计对特异性引物，首次建立的检测方法，对反应体系和引物浓度等分别进行了优化，并进行敏感性和特异性试验。结果表明所建立的反应体系在恒温水浴锅中作用即可得到结果，该方法为的临床检测和基层检疫提供了一种简便、实用的方法。犬流感的危害与公共卫生意义犬感染后表现为可表现出高热、严重呼吸道症状等，严重者可造成死亡。而目前已经证实犬流感不仅可以由马和禽类传播给犬，也可造成犬群之间水平传播。流感病毒已经历经了几十年的适应和演变，其传播正在快速蔓延并呈现进一步扩大的趋势。流感病毒的种属特异性限制了其向哺乳动物传播的能力，在很长一段时期以内，虽然只有少数亚型的流感病毒可以感染哺乳动物，但后果却是灾难性的。例如，年（、年（、年（亚型流感的流行造成了世界范围内数百万的死亡’。年的流感大流行，导致在实验室确诊的病例中，超过个国家和地区大于万的人死亡。在过去的四次流感大流行中，病毒几乎全部来源于禽流感病毒，因为流感发生种间传播时，人类并没有获得有效对抗流感病毒的免疫力。从年开始，我国已有不少针对禽源的报道。随着犬与犬的接触以及犬与人的接触的频繁，特别是宠物犬的增多，这些都将提高犬流感传播和感染人的几率。同时缺乏完善的监测制度和及时的病犬隔离措施势必会使的传播呈扩大趋势，对人类以及其他哺乳动物构成潜在威胁。目前还没有切实有效的疫苗预防该病，也没有及时有效的措施控制其传播。因此，应当重视造成的公共卫生安全问题，展开的监测和研究，部署相应防控措施。 广东部分地区犬流感血淸流行病学调查及病毒的分离鉴定参考文献，，，，王全英，乔传玲，申之义禽流感病毒神经氨酸酶的结构及其生物学功能动物医学进展，，，，，贺贞，林东子，李观强，等亚型禽流感病毒蛋白多克隆抗体的制备及鉴定第三军医大学学报，， 第一章文献综述，，，，，， 广东部分地区犬流感血清流行病学调査及病毐的分离鉴定，，，，，，，，，，，，杨新艳，于迪，夏冬华，等锦州地区犬流感的血清学调查畜牧与兽粟硕，李华涛，陈济锫，等犬流感亚型）血清学调查中国畜牧兽医，展建光犬流感病毒的分离鉴定及其生物学特性的研究，张端秀，温清萍，张险朋，等亚型禽流感病毒感染犬、猫的流行病学调查中国畜牧兽医，黄柏槐，张敦伟，远立国，等亚型犬流感病毒重组蛋白间接检测方法的建立中国预防兽医学报佘利旋，熊永忠，远立国，等亚型犬流感病毒的分离鉴定中国预防兽医学报，，高晓宇，曹荣峰，张桂红，等犬流感病毒快速检测方法的建立中国预防兽医学报， 第一章文献综述， 第二章亚型犬流感的血清流行病学调查第二章亚型犬流感的血清流行病学调查摘要：本研究利用血凝抑制试验对来源于广东省的份犬血清样本进行亚型流感病毒抗体检测，总体阳性率为。对不同类型、不同区域的犬的抗体水平进行比较，结果显示宠物犬、农家犬及流浪犬的抗体阳性率分别为、和个别地区的阳性率超过。说明亚型犬流感已在犬群中流行，并且与近年的调查结果相比呈上升趋势。关键词：犬流感；血清学调查；亚型犬流感病毒（是正點病毒科甲型流感病毒属成员。该病毒可引起犬体温升高、咳嗽、流鼻液、呼吸困难，并具有高度接触性、传染性。自年从暴发呼吸道疾病的病犬身上分离到马源流感病毒，流感病毒的跨宿主传播引起了人们的广泛关注。年韩国首先分离到禽源亚型，同年在我国广东也分离到两株相同亚型的。近几年我国江苏、浙江、北京、辽宁均陆续分离到了亚型，该亚型可以在犬与犬之间传播，被认为是第二种流行的犬流感病毒⑴。—旦在犬群中持续流行，必将威胁犬甚至人类的健康。血清学诊断是检测最准确可靠的手段之一，用血清学方法可以在感染的天内检测到相应抗体。目前我国报道流行的主要为亚型，本研究通过对年收集的广东省不同地区宠物犬、流浪犬、散养农家犬血清样本进行亚型抗体水平检测，研究亚型在犬群中的感染和流行规律，为的研究和预防提供理论依据。材料与方法犬血清样本的收集年月年月，随机采集犬血清样本份，样本来源于广东省内广州、东莞、佛山的宠物医院、宠物店、词养场、流浪动物收容所以及农家散养犬。血清的制作方法为静脉采血后室温斜面放置，待血液凝固后离心，收集血清，保存。 广东部分地区犬流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定菌株与血清毒株及其标准阳性血清和阴性血清均由本实验室保存。材料阿氏液的配制称取葡萄糖、梓檬酸钠、梓檬酸、氯化钠。加蒸馆水定容至，加热溶解后调节值至，°高压灭菌，°保存备用。鸡血红细胞悬液的制备将阿氏液和新鲜鸡血液按混合，颠倒混勾，离心分钟，弃上清液；再加入灭菌轻轻混勻，离心分钟，重复两次，用移液器移去上清；将红细胞加入有刻度的离心管内，离心，观察刻度并加入倍体积的灭菌配制成的红细胞悬液；取混合好的红细胞悬液，力口入灭菌混匀即为鸡血红细胞悬液，红细胞保存在°，不超过天。血清处理血清在进行试验之前用如下方法去除非特异性因子：加胰酶溶液于血清中，°灭活，冷却至室温；加入的过碘酸钠，混合，室温孵育加的丙三醇盐溶液，混合，室温孵育加的生理盐水并混合，最终血清的终稀释度为。血凝与血凝抑制试验血凝试验（根据姚火春介绍的方法进行，具体步骤是：先在孔微量反应板的孔均加入灭菌。然后吸取病毒悬液加入到第，用移液枪吹打混匀后从中吸取卩入第孔，混匀后再吸取卩入第，如此进行倍比稀释至第孔，孔后弃去。最后每孔均加入鸡红细胞悬液（加入前应轻轻摇勾）。振荡混勻，°静置，待对照孔红细胞沉到孔底便可观察病毒的血凝效价。结果判定以能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数作为病毒的血凝价，即效价，用表示。 第二章亚型犬流感的血清流行病学调查血凝抑制试验（按照常规方法操作，为减小主观判断造成的影响，确保试验的准确性，每个待检血清样品设置重复，判定结果参照《高致病性禽流感诊断技术》（中的规定，方法如下：根据血凝试验的试验结果配制倍血凝单位的病毒抗原，即以完全血凝的病毒最高稀释倍数除以为含单位的抗原的稀释倍数。在孔微量反应板的孔孔均加入灭菌的生理盐水，第孔内加入吸取血清加入第匕吸取于第孔，充分混匀后吸至第孔，如此依次倍比稀释至第孔，然后弃去。向第孔孔均加入含个血凝单位的病毒悬液，°静置。结果判定：以血清能完全抑制病毒凝集红细胞的最高稀释度为血凝抑制价，即效价，用表示。结果样品来源与总阳性率共收集样品份，其中份采自就诊于东竞市、广州市的个区域的二十余家宠物医院的犬，份来源于东莞市个镇街的农家或工厂散养犬，另外分别有份、份来源于广州某动物流浪收容所及佛山某宠物市场。经过检测，检出份阳性血清，总抗体阳性率为。宠物犬、农家犬、流浪犬亚型抗体阳性率比较根据犬生存环境的不同，将犬血清样品分为宠物犬（包含宠物医院和宠物市场）、农家犬和流浪犬三类，分别统计亚型抗体检测结果。如表所示，宠物犬的血清抗体阳性率最高，其次是流浪犬，农家散养犬的亚型抗体阳性率与前两者相比较低，仅为。表宠物犬、农家犬、流浪犬亚型抗体阳性率比较项目样品数（份）阳性数（份）阳性率（％宠物犬农家犬流浪犬 广东部分地区犬流感血清流行病学调査及病毒的分离鉴定不同区域宠物犬亚型抗体检测对份来源于宠物医院的宠物犬进行抗体检测，结果见表。由表可知阳性血清数为份，阳性率为。其中部分地区样品的阳性率较高，来源于东莞常平的样品阳性率高达。广州海珠的样品阳性率达到，东堯莞城、南城、虎门的血清样品阳性率也达到以上。表不同区域宠物犬亚型抗体检测结果区域样品数（份）阳性数（份）阳性率（％南城莞城长安常平虎门清溪广州海珠佛山大沥合计不同区域农家散养犬亚型抗体检测份血清来源于东堯市个镇区的农家散养犬的抗体检测结果见表。结果显示份样品中有份血清抗体检测呈阳性，阳性率为。其中分别采自道潜镇和茶山镇和份样品均未检出抗体，望牛墙镇份样品也仅检出份阳性，石碣镇和樟木头镇的血清阳性率分别达到和。表不同区域农家散养犬亚型抗体检测结果区域样品数（份）阳性数（份）阳性率（％石碣道潜望牛傲樟木头茶山合计 第二章亚型犬流感的血清流行病学调査讨论目前我国有关的血清流行病学调查的报道还不多，而流行病学调查对于了解疾病发生发展的规律以及制定相应防制措施是十分重要的。本试验采集的样品来源于广东省东莞市的余个区域和镇街，另外还包括广州的宠物医院、佛山宠物市场等，来源广泛，因此具有较好的代表性。根据调查的结果，的亚型抗体总体阳性率为，对于不同地区采集样品的阳性率统计表明，局部地区感染率已相当高，超过了，许多区域的抗体阳性率也都在，说明该地区已有相当数量的犬感染了亚型犬流感。其中，来源于宠物医院和流浪动物收容所的犬血清阳性率明显高于农家犬。在此之前有研究报道】流浪犬较农家犬的抗体阳性率较高，这与本研究的结果一致。本次调查发现高达到三分之一的宠物犬抗体呈阳性，笔者认为这与该地区的实际环境与情况有关。在采样过程中笔者了解到，东竞地区许多宠物店出售的犬均来自于佛山某宠物市场，随后对该宠物市场犬血清抗体检测显示阳性率达。因此推测许多宠物犬在饲养集中、环境较差的宠物市场就已经遭受了感染，而且可能成为大面积传播的源头。年，广东地区是我国首先报道发现禽源亚型的区域，此后等在犬的研究中报道了深圳地区宠物犬和亚型的阳性率分别为为和佘利旋等在研究中报道了广州地区宠物犬病原学调查的阳性率为，血清学调查阳性率为粟硕等报道，广州地区宠物犬血清学阳性率为。本次调查的结果显示的感染从年至今已经有较大幅度的上升，这不得不引起人们足够的重视。加之近几年各地陆续发现并分离到亚型，说明的感染将进一步呈扩大趋势。虽然造成的死亡率较低，但有报道显示，与其他病原混合感染的情况下，对病犬的致死率会明显提高。目前还没有能有效预防感染的疫苗或措施，因此，应当通过加强饲养管理、及时的隔离和制定完善的交易管理制度等来预防该病。同时，持续的血清学、病毒学监测对于研究和有效控制该病具有重要意义。 广东部分地区犬流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定参考文献，姚火春兽医微生物学实验指导第二版中国农业出版社，杨新艳，于迪，夏冬华，等锦州地区犬流感的血清学调查畜牧与兽医，佘利旋，熊永忠，远立国，等亚型犬流感病毒的分离鉴定中国预防兽医学报，粟硕，李华涛，陈济铛，等犬流感亚型）血清学调查中国畜牧兽医，，，，， 第二章亚型犬流感的血清流行病学调查，，，：； 第三章犬流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析第三章犬流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析摘要：为了解广东地区犬流感病毒的亚型，釆集份有呼吸道症状犬的鼻拭子，接种鸡胚分离病毒，并进行亚型鉴定和序列分析。分离获得两株亚型犬流感病毒，分别命名为及根据参考毒株的基因序列设计特异性引物，用的方法分别扩增出两株病毒的所有基因片段克隆到载体进行序列测定，并建立基因进化树。结果显示分离病毒的个片段与韩国禽源犬、猫流感毒株、泰国分离株以及广东、江苏、北京、浙江、辽宁分离株的基因同源性均较高，达到与泰国年分离株在进化关系上最为接近。氨基酸比对显示的裂解位点、抗原位点、受体结合位点及潜在糖基化位点与禽源株相比均有突变。抗原位点也有突变，并在颈部有氨基酸插入。其中分离株的颈部只有一个氨基酸插入，与以往犬流感分离株不同。研究为进一步研究犬流感病毒的生物学特性奠定了基础。关键词：犬流感病毒；分离鉴定；序列分析；流感病毒可以通过抗原的不断变化产生变异毒株来逃避宿主的免疫机制，其表面两种主要的免疫原性糖蛋白和发生抗原性变化时病毒的毒力也可能发生变化。抗原变异表现为两种形式，即抗原漂移和抗原转变。由于聚合酶缺乏校正功能，病毒基因组复制时很容易出错。例如，在自然进化过程中由于经常受到宿主防御机制的选择压力，亚型的流感病毒在抗原位点的一个点突变就可能改变其抗原性，而与细胞受体的亲和力及结合特性的改变则可以导致宿主特异性的改变年美国马源流感病毒造成大面积赛犬的感染，年韩国在呼吸道症状的犬中分离出禽源流感病毒，这些事实都再一次证明了流感病毒在一定选择压力下可突破种间屏障进行传播，流感病毒的种间传播和进化是一个相互作用、相互促进的过程。完成基因组测序是认识犬流感病毒的重要步骤，有助于分析的变异和传播规律，并制定相应预防对策。本研究采集了广东地区有呼吸道症状的患犬鼻拭子样品，进行的分离与鉴定，对分离病毒的基因组进行序列测定，确定亚型，并分析遗传演化关系，为有效预防犬流感的发生提供参考。 广东部分地区犬流感血清流行病学调査及病毒的分离鉴定材料与方法样品与实验动物份疑似病例的犬鼻咽拭子采自广州市和东堯市的家宠物医院、家宠物店以及佛山市某宠物市场；鸡胚购自南京中牧实业股份有限公司南京药械厂。主要试剂与仪器病毒采样管购自北京友康生物科技有限公司；大肠杆菌购自天根生化科技有限公司。—、、酶、、、、均购自公司；病毒提取试剂盒、质粒提取试剂盒购自公司；常规分析纯试剂购自北京试剂厂；灭菌、的碘酒、酒精、阿氏液、红细胞悬液等均为自行配制。主要仪器包括超低温冰箱、低温高速离心机、水浴锅、仪器与电泳系统、凝胶成像系统等。引物设计与合成参考等设计反转录单链引物。应用及软件根据上已发表的犬流感毒株参考序列设计扩增个基因全长的特异性引物，引物核苷酸序列见表。的分离与鉴定病毒分离样品的采集将病毒采样管中的棉签轻轻插入需釆样犬的鼻道内，转动数次稍作停留后退出。将棉签浸入采样管的采样液中，弃去尾部。样本最好立即送往实验室进行病毒分离，若不能则应立即将采样管置于低温保存。鸡胚接种样品要通过一次性滤膜过滤以避免细菌导致鸡胚死亡，稀释后用注射器接种，每个样品接种枚鸡胚。取日龄的鸡胚，照蛋后在胚胎旁纸毛尿囊膜发育良好无大血管处和气室交界处标记，用碘耵、酒精消毒。在记号处穿孔，注射器吸取样品剌入壳膜约，接种，用石錯封闭注射孔。 第三章犬流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析鸡胚接种后置于孵蛋器中鮮育，每照蛋一次，弃去死亡者，孵育后取出置于°冰箱过夜。收获尿囊液时鸡胚的气室端要后先用碘及酒精消毒，敲破卵壳并用镊子沿气室周围除去卵壳和壳膜。用注射器穿破绒毛尿囊膜吸取尿液，分装于灭菌的离心管中，立即用于血凝试验检测或置于冻存，避免反复冻融。血凝试验检测尿囊液，若无血凝现象，继续接种鸡胚，盲传三代之后仍然没有血凝现象的视为阴性。表实验中所用引物丁扩增基因名称类型引物序列（丨血凝试验常规方法进行操作，设置空白和阳性对照，具体方法详见第二章。病毒提取参照病毒提取试剂盒，根据如下操作进行。取离心管，加入新鲜的尿囊液。加入祸旋，在 广东部分地区犬流感血清流行病学调査及病毒的分离鉴定室温下孵育。加入已加入乙醇），剧烈震荡。将放入收集管中，将混合的液体加入，室温下离心，弃去收集管中的液体。加入到柱子中，室温离心，弃去收集管中液体。加入已加入乙醇，室温离心，弃去收集管中液体。室温离心使柱子充分干燥。加入静置后离心收集病毒。反转录中加入引物（每叫体系中加入，在°条件下反应，置于冰上，然后按如下体系和条件进行反转录（表。表反转录体系成分用量⑷反转录条件：。’；°，基因片段的扩增取反转录的为模板，按表和表中的体系和条件进行扩增。产物的检测取产物用琼脂糖凝胶进行电泳检测，若扩增条带与目的片段的大小一致，则表示扩增正确。 第三章犬流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析表犬流感病毒基因扩增反应体系用量（去离子水上游引物下游引物表反应条件片段预变性变性退火延伸再延伸循环数（个）。，。，°°°°°°°°，°°°°。重组质粒的构建与鉴定产物的回收与纯化按照说明书进行目的片段的回收，步骤如下：将所需的目的片段从琼脂糖凝胶上切下来，尽可能切掉多余的胶，暴漏在紫外灯下不要超过。将目的条带转移至离心管（已称重，称出凝胶的重量（总重一管重，加入倍体积的，在°水浴锅中温浴至凝胶完全溶解。注意凝胶混合物的颜色，如果是橙色或红色，则加入为的醋酸钠调节，直至溶液颜色恢复浅黄色。取干净的柱子装在收集管上，将溶化的凝胶转移至柱子中，室温离心，弃掉收集管中液体。将柱子重新装回收集管上，加入确认已加入乙醇， 广东部分地区犬流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定室温离心，弃滤液。将安置在收集管上，离心。在膜的中央加入的，室温静置。室温离心即得回收的。连接取回收的目的片段与载体用购自的试剂盒，按照表的反应体系，在°连接过夜。表目的片段与载体的连接反应体系用量（目的片段连接产物转化感受态感受态的制备接种纯培养的大肠杆菌到液体培养基中，°振荡培养过夜，取菌液转接至的液体培养基中，°振荡培养使其增殖至对数期。将菌液转移到两个离心管中，冰浴使菌液冷却至。。’离心，弃上清，用的重悬沉淀，轻轻吹打均匀，冰浴。离心，弃上清，回收细胞。用重悬沉淀，分装，于保存备用。连接产物转化将连接产物加入的感受态中，用枪头轻轻混勾即可，在冰上孵育，然后置于°水浴锅中热激，再取出于冰上静置，加入°培养。离心，弃去上清，再吹打混勾吸于平板，用涂布棒铺平，于°正置，然后倒置培养观察菌落生长情况。阳性重组质粒的蹄选挑取平板上的单菌落，接入具抗性的液体培养基°培养以菌液为模板进行检测，产物在琼脂糖凝胶上电泳检测，蹄选出阳性克隆。将阳性克隆的菌液转接于的液体培养基中，用于重组质粒的抽提。重组质粒的提取将单克隆细菌菌液转接到抗性的培养基°过夜培养，质粒的提取按照说明书进行，质粒保存于。 第三章犬流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析质粒的鉴定取质粒为模板进行鉴定，方法条件同上。全基因序列测定及遗传演化关系分析序列测定将阳性克隆质粒送大连宝生物工程有限公司和上海美吉生物公司进行测序。序列分析及系统进化树旳构建将测定的序列录入联机检索，对所得的序列与同源序列进行比对。用丄软件对分离得到的病毒的基因序列和氨基酸序列进行编辑和比对分析；用软件构建系统进化树。结果病毒分离与初步鉴定年月至月期间，共收集份有呼吸道症状的犬鼻拭子，分别来自广州、东堯的家宠物医院、家宠物店及佛山某宠物市场。接种鸡胚经过代的传代后，最终得到个血凝价较高且较稳定的尿囊液样品，病毒的血凝效价分别达到和，结果如图。图血成试验结果病毒鉴定提取病毒的经反转录后用对引物进行鉴定，经琼脂糖凝胶电泳后，通过凝胶成像分析，如图泳道和泳道分别为两株病毒经的检测结果。可看到与目的条带大小相符的条带，目的片段的大小分别为：、、、、、、、。 广东部分地区犬流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定瞧聽；：、、、、、、；：、、、、、图犬流感病毒个基因片段的鉴定结果基因核音酸序列分析株分离株的个片段与中的参考毒株的比对结果显示，分离株与近年分离到的犬流感病毒的各片段同源性均较高。其中和片段与泰国年分离株、韩国犬源分离株和猫源分离株（年、年、年）、江苏年分离株、广东分离株（年、年、年）以及北京、辽宁、浙江分离株的和基因序列的同源性均达到。说明分离的株流感病毒均为亚型，根据流感病毒的命名法则，将分离的毒株分别命名为以及以下简称号株及号株）。其余个片段核苷酸序列与中国、韩国禽源毒株的同源性也较高，和分别达到和，其余片段的同源性均达到说明分离的病毒与韩国及广东最先分离的毒株一样，最早来源于禽的流感。氨基酸序列比对将株分离株、韩国犬源、猫源分离株以及广东、江苏、北京、辽宁、浙江的亚型犬流感分离株的和氨基酸序列，分别与同源性最高的禽源株和进行比对。参考毒株信息如表。 第三章犬流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析表用于序列比对的参考毒株登录号毒株名称分析与禽源毒株相比，有以下较明显的共同突变位点：，，，，。其中，和发生在个不同的抗原位点；发生在受体结合位点；导致潜在糖基化位点的丢失，而导致糖基化位点的增加；除了韩国和株，在裂解位点均发生了改变。分离的两株毒与其它毒株相比均发生的、独特的位点改变是，。分析与禽源毒株相比，共同突变位点的改变是：。其中的，发生在个不同的抗原位点。这三个位点的改变仅发生在部分毒株， 广东部分地区犬流感血淸流行病学调査及病毒的分离鉴定而位于抗原位点。在此前分离的毒株均有发生，而本次分离到的毒株以及泰国最新分离的毒株没有发生突变。，，以及号株的均为本次分离的毒株独有的位点突变。此外，本次分离的号株与中国此前分离的广东株、江苏株、浙江株、北京株、辽宁株均在颈部末端有两个氨基酸的插入，而韩国年至年分离的毒株均没有氨基酸的插入。值得一提的是，号株与其他株相比较为独特，其颈部末端只有一个氨基酸的插入。遗传演化分析采用方法建树，与中下载的核苷酸序列进行比对，用方法计算并构建遗传进化树，结果见图。从系统进化树可以看出分离的两株毒较接近，个基因片段均与泰国年分离株具有最近的亲缘关系。各片段与韩国犬、猫分离株、、广东株、浙江株辽宁株、北京株等毒株的具有较近的进化关系，处于同一个大的分支上，而与马源、猪源和人源的流感病毒距离较远。 第三章犬流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析——「“‘—▲—▲？￡—「「厂「的 广东部分地区犬流感血清流行病学调査及病毒的分离鉴定」厂▲—■「—「【〃—「——￡“「 第三章犬流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析：———「「“————里—「丨丨— 广东部分地区犬流感血淸流行病学调查及病毒的分离鉴定「，厂‘▲丨旧「产—；—一——厂— 第三章犬流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析！—『▲▲—一」————“— 广东部分地区大流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定丨▲“一一「旧———，————‘―厂 第三章犬流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析—■一厂—厂「—— 广东部分地区犬流感血清流行病学调査及病毒的分离鉴定—沿—「▲—」—旧」；厂—「「—厂——图基因核苷酸序列系统进化树▲ 第三章犬流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析讨论流感病毒在自然界广泛存在，并可以通过改变抗原特性来获得跨越种间障碍而适应新宿主的能力，。蛋白与抗原的受体结合有关，在病毒的变异中起重要作用。识别的受体分，半乳糖苷唾液酸，半乳糖音，，禽和马流感病毒对，具有亲嗜性，而人和猪流感病毒对，的亲和性最高。猪被认为是禽、人流感病毒的中间宿主，其呼吸道上皮同时具有两种类型的流感病毒受体，因此人和禽流感病毒都可以感染猪。有研究表明犬的呼吸道上皮细胞也同时含有两种受体，所以犬也有成为流感病毒中间宿主的潜在可能。除了禽源亚型，犬也可能重复感染其他动物来源的流感病毒，包括禽源、马源和人源，这就使流感病毒经过重组变异为新的亚型成为可能。最近，韩国发现一株基因来源于禽源的，而其他片段来源于亚型的新型重组病毒这样的重组病毒具有新的抗原性，并可能造成更高效的传播，威胁到人类的健康。此次分离的毒株与其他犬流感毒株与相似度最高的禽源毒株的氨基酸序列比显示，有个氨基酸位点发生了变化，其中个发生在抗原位点，个在受体结合位点。而大于五分之二的抗原位点发生个以上氨基酸漂移，被认为在流行病学上具有重要意义。也有研究表明两个以上的抗原位点发生改变或者一个发生在抗原位点，一个发生在唾液酸受体结合位点均会导致抗原性的改变。受体结合位点突变也发生在马源的犬流感病毒上，而通过大量比对禽和马的亚型流感病毒却发现是相当保守的。因此，这个突变很有可能与流感病毒的跨宿主传播机制有关。另外，上的潜在糖基化位点可以起到掩饰抗原位点的作用，从而影响抗原性和受体亲和力，。值得注意的是和导致了潜在糖基化位点的改变，而在人的亚型流感病毒中是非常保守的。的裂解前体的裂解性能以及激活传染性的蛋白酶被认为是决定流感病毒致病性的重要作用。流感病毒的裂解位点在不同宿主上也发生了明显了的规律性变化，马的为，禽、人、猪的为，而目前分离到的犬流感除最早的和韩国株以外其余均发生了突变，使其在犬上变为，这也体现了流感病毒在不同宿主体内不断适应和变化的过程。在影响宿主范围方面其重要作用，在子代病毒从宿主细胞表面释放时，能有效防止病毒聚集，促进病毒穿过呼吸道上皮细胞上的點液而扩散。研究分离到的毒株的与禽源毒株相比，莲部有氨基酸的插入。一般来说，莲部氨基酸的缺失常见于禽流感毒株，因此，这种插入也可能是流感病毒适 广东部分地区犬流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定应哺乳动物宿主的结果，。也有研究表明，莲部的长度与病毒在鸡胚中的复制效率有关，其莲部越长，复制效率越高】。而的糖基化和片段氨基酸莲部的变长可能共同作用，促使流感病毒向适应宿主的方向演化】。值得注意的是，本次分离的号株与近年来的研究一致，均有两个氨基酸的插入，而号株仅有一个氨基酸的插入，并且在插入附近有的突变。这在犬流感毒株中尚属首次发现，该毒株在犬流感病毒的遗传演化中是否处于一种“过渡态”还不得而知，而插入的不同是否会造成毒株生物学性状的不同值得深入研究。此夕卜，将分离的毒株与其他犬流感毒株相比，的，，和的，均为两株毒发生的独特突变，这对于病毒的抗原性到底有无影响，也有待进一步研究。从遗传演化上看，此次的犬流感病毒分离株与其余不同国家和地区的犬流感分离株都处在一个大的分支上，差异较小，最初均来源于禽。在宿主的免疫压力以及不同的环境下，流感病毒仍在不断发生变异。目前在亚洲多地均发现了亚型的犬流感病毒，虽然尚未有传染人的报道，但鉴于人类和犬的亲密关系，应当进一步加强对的监测，并制定相应的防制措施，保障公共卫生安全。 第三章犬流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析参考文献，，，，， 广东部分地区犬流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定，，， 第三章犬流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析：，，，： 第四章亚型犬流感病毒蛋白的表达与纯化第四章亚型犬流感病毒蛋白的表达与纯化摘要：流感病毒的蛋白高度保守，是作为诊断抗原的理想蛋白。为了建立针对多种亚型的犬流感检测方法，选取犬流感病毒的核蛋白（基因，克隆至载体，在大肠杆菌中经诱导表达。分析可见，重组蛋白主要以包涵体形式存在，分子质量为左右；结果显示，其可与犬流感病毒全病毒抗血清发生反应，表明蛋白具有良好的反应原性。重组蛋白的表达，为建立犬流感抗体检测方法提供了物质基础。关键词：犬流感病毒；蛋白；表达；纯化；流感病毒的蛋白，即核蛋白，通过与病毒及宿主细胞上某些大分子之间的相互作用，影响着病毒的转录、复制、装配及转运等功能。尽管流感病毒极易发生变异，但主要集中在和上，而蛋白却高度保守⑴，因此蛋白是流感病毒诊断用抗原的理想勒蛋白。早在年，等就利用纯化的蛋白建立了型特异性流感病毒抗体检测的方法，目前蛋白已用于型流感病毒的诊断试剂盒的研制，并已成为一种商品化的产品。目前有关犬流感抗体检测方法的研究还不多。本研究对犬流感病毒的蛋白进行克隆，构建重组质粒在大肠杆菌中进行表达，研究可为建立快速、准确的犬流感检测方法提供参考依据。材料与方法病毒株、血清、菌株及载体株及标准阳性血清、感受态细胞、原核表达载体、表达菌株均由本实验室保存。主要试剂限制性内切酶、连接酶购至公司；聚合酶、等试剂购自大连公司；试剂购自公司；酵母浸出粉（及胰蛋白胨购自英国公司，琼脂粉购自公司，进口分装。购自自上海生工生物 广东部分地区犬流感血淸流行病学调査及病毒的分离鉴定工程技术服务有限公司；预染蛋白购自公司，辣根过氧化物酶标记的购自武汉博士德生物公司。、相关溶液自行配制。引物设计根据中的已知基因序列设计，并参照已知序列设计犬流感扩增基因的特异性引物，引物序列如下表，反转录通用引物见第三章。表基因组彳广增用引物引物名称引物序列（病毒提取与反转录法提取病毒将尿囊液上清与的丁加入￡：处理过的￡管中混合，颠倒混勻，室温静置。加入氯仿，颠倒混匀，室温放置。。’离心。吸出上清中间层为沉淀放于新的￡处理过的管中，加入等体积的异丙醇。室温静置°离心，弃上清。配制的水乙醇溶液。加入乙醇溶液，°离心，弃去上清，再离心，然后静置。最后加入水，振荡混匀。反转录为取病毒，加入反转录通用引物置于°，然后置于冰上冰浴。然后加入水。将上述体系混合后，按照条件°，°产物即为。基因的扩增与鉴定以为模板，按表的反应体系扩增基因。检测时先取产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，若扩增条带的大小 第四章亚型犬流感病毒蛋白的表达与纯化与目的片段大小一致，则进一步进行大量扩增，对目的条带切胶回收。表基因扩增反应体系成分用量（去离子水上游引物下游引物重组表达质粒的构建与鉴定回收产物与载体质粒经五、限制性内切酶双酶切后，回收目的基因片段和载体片段。取基因双酶切回收产物与酶切后的质粒载体浓度比为用连接酶在°反应过夜，连接成功的质粒即为。将重组质粒转化到感受态细胞，涂布在含抗性的固体培养基上，°倒置培养过夜。挑取单个菌落接种于含有的液体培养基中，于°摇床培养，进行鉴定。蛋白的诱导表达与纯化诱导蹄选鉴定阳性的菌液，接入新的抗性培养基，摇床过夜。取培养的菌液接种于新鲜液体培养基中，于°振荡培养约，加诱导，取出后置于冰上使细菌停止生长。此过程中收集重组质粒诱导前和诱导后和空载体诱导后的样品，处理后备用。重组蛋白的可溶性分析将诱导表达的菌体在°离心，收集沉淀，超声波破碎，次，间隔，破碎次，功率。°离心，分别取上清液和沉淀用于分析。蛋白的纯化将超声波破碎处理的沉淀用洗漆次，加入包涵体（上清）溶解液，裂解沉淀，离心后收集上清。上清通过：滤膜过滤后与镜离子亲和树脂结合， 广东部分地区犬流感血淸流行病学调査及病毒的分离鉴定于室温条件下，以缓慢速度通过镇柱，收集过柱的液体；用包涵体（上清）溶解液，以速度通过镇柱，收集流出液；用包涵体（上清）洗脱液，以速度通过镍柱，用离心管收集过柱的液体。纯化后的蛋白进行复性，将蛋白溶液装入煮过的透析袋中，依次放入、、、、、脲中，在°每种浓度下透析。分析时用转膜缓冲液浸泡膜和滤纸，进行湿转，转膜电压，。用洗膜次，每次。将膜放在平皿中，力口脱脂乳封闭液浸膜，°过夜。加入用脱脂乳按的比例稀释的加入全病毒抗血清，室温摇荡。洗膜次，每次。加入用用脱脂乳按的比例稀释的辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌蛋白（，室温摇。洗遍，每次。显色用避光配制后淋在膜上显色。结果基因的扩增经过的扩增，产物在的琼脂糖凝胶电泳，扩增的片段大小约左右，与预期大小相符，如图。；；：：；：基因扩增产物；阴性对照图犬流感病毒基因片段的鉴定结果 第四章亚型犬流感病毒蛋白的表达与纯化重组质粒的酶切鉴定用限制性内切酶和对重组质粒进行双酶切鉴定，结果如图，得到与预期大小相符的两个片段，大小分别为和的片段，说明重组质粒构建成功。丨、這《零、：；；誦。：：》：—。。二；图重组质粒的酶切鉴定结果重组蛋白的分析将鉴定为阳性质粒的菌液经诱导，发现蛋白得到了表达。可溶性分析表明蛋白主要以包涵体形式存在，对表达的蛋白进行纯化。蛋白的表达以及纯化结果如图，重组蛋白分子质量为左右，与设计大小相符。 广东部分地区犬流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定一蛋白分子质量标准纯化后产务诱导后产物未诱导洗照■、空载体对照嫩―着；“拳零徽丨”丨權，一詹羡■图蛋白的分析分析结果将纯化的重组蛋白经分析后可见在约的明显的蛋白条带，将凝胶上蛋白转印至膜，用全病毒抗血清为一抗，为二抗进行鉴定，可见阳性印迹反应带，如图。卞：蛋白分子质量标准；重组蛋白的纯化产物图蛋白的鉴定 第四章亚型犬流感病毒蛋白的表达与纯化讨论蛋白是细胞毒淋巴细胞识别的主要抗原，其诱导的反应可针对不同亚型的病毒株产生交叉反应。本试验以高度保守的基因作为目的片段，在原核表达系统中表达犬流感病毒蛋白’经鉴定具有良好的反应原性。原核表达生产抗原具有成分单一、成本低、易于大批量生产等方面的优点，而且可避免全病毒作为抗原时引起的散毒危险。目前，犬流感的检测方法主要还是、以及方法。和方法，敏感度相对较低，】，且操作繁琐；方法较可靠，但不适用于大量样本的检测和基层应用。黄柏槐等利用重组蛋白作为检测抗原，建立了亚型的血清学检测方法，且不与其他亚型流感病毒发生交叉反应，具有亚型特异性。以重组蛋白为诊断抗原建立等方法，具有快速简单、成本低、特异性好、安全性高、结果容易判定等优点，对于的诊断，尤其是未知亚型检测具有重要意义。本研究表达的蛋白可为犬流感病毒检测方法和蛋白功能的研究提供物质基础，在检测试剂盒和疫苗的研制等方面具有广泛的应用前景。 广东部分地区犬流感血清流行病学调査及病毒的分离鉴定参考文献，，郭利敏，乔传玲，陈艳，等利用真核表达的猪流感病毒蛋白制备其特异性的单克隆抗体中国预防兽医学报，黄柏槐，张敦伟，远立国，等亚型犬流感病毒重组蛋白间接检测方法的建立中国预防兽医学报，宋建领，张富强，胡媛媛，等和亚型禽流感病毒型特异性抗原捕捉检测方法的建立中国兽医科技， 第四章亚型犬流感病毒蛋白的表达与纯化，： 全文总结全文总结用血凝抑制方法对来源于广东省的份犬血清样本进行亚型流感病毒抗体检测，总体阳性率为。其中宠物犬、农家犬及流浪犬的抗体阳性率分别为、和，个别地区的阳性率超过与近年的调查结果相比呈上升趋势。从份有呼吸道症状犬的鼻拭子中分离获得两株亚型犬流感病毒，分别命名为、。全基因组序列分析及基因进化树分析表明，分离毒个片段与韩国禽源犬、猫流感毒株、泰国分离株以及广东、江苏、北京、浙江、辽宁分离株的基因同源性达到，与泰国年分离株在遗传演化关系上最为接近。选取犬流感病毒保守的基因，在大肠杆菌中进行表达。重组蛋白结果显示其具有良好的反应原性。重组蛋白可为建立犬流感病毒抗体检测方法提供物质基础 m致谢本研究是在导师刘永杰教授和罗卫强研究员的悉心指导下完成的。两位导师在学习和生活上给予了莫大的帮助和关怀，在此谨向两位导师致以诚挚的敬意和衷心的感谢。刘老师平易近人的性格、严谨的科研态度、永不松懈的敬业精神是我学习的榜样，罗老师敏锐的洞察力、广阔的思维和求实创新的精神使我受益终生。感谢东莞市动物卫生监督所为我提供优越的实验条件和难得的学习机会，感谢单位领导和老师对我工作、生活上和的照顾和关心。感谢兽医微生物课题组林炎、郭长明、曾旭建、曹黛丽、庞茂达、王兆飞、沈婵娟、谢星、张倩、林小琴、李欣彤、吴亚峰、王楠楠、徐艳楠、刘广錦、武存霞、徐文豪、包银丽、马家乐、王卫雪、贾红颖等为我试验提供的无私帮助，使我在南农度过了充实而快乐的研究生生活。最后，衷心感谢我的父母、亲人和朋友对我关怀和理解，无论何时，你们的支持、鼓励将永远是我克服困难、勇往直前的动力。郭昊年月 mm附录、培养基液体培养基：胰蛋白胨：酵母提取物：：用去离子水定容至。、电泳所用试剂电泳缓冲液：碱甘氨酸去离子水定容至样品缓冲液：甘油巯基乙醇溴酚蓝去离子水定容至脱色液：冰醋酸甲醇去离子水染色液：考马斯亮蓝冰醋酸甲醇去离子水液（丙烯酰胺储存液：丙烯酰胺双丙烯酰胺 广东部分地区犬流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定去离子水定容至液（分离胶缓冲液）：去离子水定容至液（浓缩胶胶缓冲液）：去离子水定容至、所用试剂转膜缓冲液：甘氨酸甲醇去离子水定容至：：去离子水定容至