乙型肝炎表面抗原酶免疫检验方法

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1、乙型肝炎表面抗原酶免疫检验方法前言乙型病毒性肝炎（简称乙肝）是由乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus,HBv）引起的传染性疾病，在我国人群中感染率较高，，是严重危害人民身体健康的常见传染病之一。对乙肝的诊断主要以实验室检测乙肝表面抗原（HepatitisBSurfaceantigen,HBsAg）为主，检测方法主要有酶免疫法、反向间接血凝法、放免法、化学发光法、免疫荧光法等，目前应用较广、较普及的是酶免疫法。本标准所使用的缩略语为HBV、HBsAg。本标准从2002年7月1日起实施。本标准由卫生部医政司提出。本标准由北京大学医学部人民医院肝病研究所

2、负责起草。本标准主要起草人：陶其敏、全文斌。本标准由卫生部委托卫生部临床检验中心负责解释。中华人民共和国卫生行业标准中华人民共和国卫生部2002-04-20批准2002-07-01实施乙型肝炎表面抗原酶免疫检验方法WS/T223一2002Guidelinesforenzymeimmuno一assayofhepatitisBsurfaceantigen1范围本标准规定了血清HBsAg酶免疫检验方法（两步法）中相关的技术要求。本标准适用于各基础、临床实验室和流行病学研究中血清HBsAg测定。2方法选择2.1常用方法HBsAg的酶免疫检验方法根据反应模式可分为“

3、一步法”和“两步法”两种方法。“一步法”是将待测样品和酶标记抗体同时加人到反应孔中进行反应，从而达到快速的目的；“两步法”则是先将样品加人到反应孔中，待反应结束后再加人酶标记抗体，从而使待测样品的“捕获反应”和酶标记抗体的“酶联反应”分开进行，因而反应更加稳定、重复性也更好。2.2推荐方法由于“一步法”存在产生“前带现象”的可能，故在本标准中不列为推荐方法；本标准推荐使用酶免疫“两步法”。2.3方法原理本标准推荐使用酶免疫“两步法”检测HBsAg：将抗HBs的单克隆抗体（简称单抗）或多克隆抗体（简称多抗）包被于聚苯乙烯微孔板等固相载体上，加人待测血清，如其

4、中含有HBsAg，则可与固相上的包被抗体结合；洗板去除不参加反应的无关蛋白成分后，加人酶（如辣根过氧化物酶）标记的第二株抗体使之与血清中HB、Ag反应，在固相载体上形成包被抗体一血清中HBsAg一酶标记抗体的复合物（即双抗体夹心）；再加人底物后，酶催化底物，产生显色反应，根据显色反应颜色的深浅可判定血清样品中HB、Ag的有无及相对含量。 3试剂和材料国内目前已有成套的试剂盒供应。显色反应底物液可选用邻苯二胺（o-phenylenediamine。OPD）过氧化氢（H202。）溶液（简称OPD）或3,3',5,5’-四甲基联苯胺（3,3',5,5’一Tetr

5、amethylbenzidine,TMB）-H2O2溶液（简称TMB）。使用OPD时，可选用2mol/l的硫酸（H2SO4）作为终止液，比色时选用492nm作为测定波长；使用TMB时，可选用2mol/l的盐酸或2mol/l的硫酸溶液作为终止液，比色时选用450nm作为测定波长。注:国内市场目前亦有HBsAg检测的快速酶免疫试剂盒供应，该试剂盒系加有标本加速剂和酶标记抗体加速剂，可达到快速反应的目的，具体操作方法详见各生产厂家的试剂盒说明书。4仪器和设备包括酶标仪、移液系统（移液器及移液器头）和恒温设备（水浴箱）等。所选用的仪器设备应满足以下要求：a）酶标仪

6、在450nm和492nm的波长不精密度应在≤1%，分别在449nm-451nm和491nm-493nm之间，吸光度（A值）要求可以测到小数点后两位；b）移液系统在100μl和50μl的移液不精密度应≤1%，分别在99-101μl和49.5μl-50.5μl之间；c）恒温系统在37℃、43℃的温度变异应成士I℃。样品5.1血液样品的采取取受试者的前臂静脉血。止血带的使用时间应不超过1min，同时避免溶血。5.2血液样品的处理、贮存和测定前准备血液样品采取后室温下静置30min-45min使其凝血，避免溶血，2O00r/min离心5min后立刻吸出血清置密封的

7、试管中贮存。分离出的血清标本可于2℃-4℃贮存1周，如需贮存更长时间，则应保存在-20℃以下，用时提前取出融化并使其温度升至室温，充分混匀后测定。保存在－20℃的标本应避免反复冻融，否则可能会影响测定结果的准确性。注：HBsAg的检测亦可用血浆类标本，其抗凝剂可选用拘椽酸钠（106mmol/L的水溶液与血液按1：9比例使用）、乙二胺四乙酸二钠（15g/l，的水溶液与血液按1：9比例使用）、肝素（100u/mg～125u/mg的肝素钠粉剂配成1g/L的水溶液与血液按1:9比例使用）等。6测定步骤6.1测定前准备将贮存的成套试剂盒及待测血清样品取出，使其温度升

8、至室温后混匀使用。准备或开启仪器设备。6.2测定操作a）已包被好的