饲用酶检测过程中非定义影响因素的分析

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1、饲用酶检测过程中非定义影响因素的分析饲用酶制剂是应用现代生物工程技术,选用特殊的微生物菌株经发酵产生的具有催化活性的生物制剂。近年来,因其具有改善畜禽消化道功能、降低食糜黏度和抗营养性、提高饲料利用率和减少环境污染等特点,已作为环保型饲料添加剂广泛应用于畜牧业。但因为饲用酶制剂应用开发较晚,当前饲用酶制剂酶活测定方法除了植酸酶外,其他酶制剂都还没有一个全国通用的标准方法。虽然随着酶制剂工业的发展,酶活检测水平已得到了相应的提高,对于酶活检测中的一些重要因素,人们在酶活定义中已经进行了明确的规定,例如温度、pH值、时间、底物等,并且对于这些因素在

2、酶活测定过程中对结果的影响程度,以及这些因素不同值下的对比关系,广大科研工作者已经进行了大量而深入的研究。但是酶活检测过程中除了这些定义中规定的因素对酶活检测结果影响很大以外,许多非定义因素对酶活检测结果的影响也极其显著。有鉴于此,笔者就酶制剂酶活测定中一些非定义因素进行了分析,并对其中一些不确定的影响因素进行了对比试验,以便为广大的酶制剂应用者更好地把握酶制剂的质量提供参考。1缓冲液配置饲用酶制剂定义中pH值的确定都是根据动物胃肠内最佳作用pH值得来,一般在5.0～5.5。为了达到酶活定义所要求的pH值范围,酶制剂检测时都应用一定的缓冲液调配

3、,使反应体系达到相应的pH值。反应体系中缓冲液的离子强度影响酶制剂的蛋白空间结构,从而影响其催化能力,所以测定酶活时应尽可能统一反应缓冲液的种类和离子强度。但是在相同pH条件下,如果缓冲液的离子对和缓冲溶液的摩尔浓度不相同,则测定出来的酶活差别很大。乙酸缓冲液在酶制剂检测中最常使用,但也有方法使用柠檬酸和硼酸等缓冲液。缓冲液摩尔浓度国内方法一般用0.1M和0.2M,在国外也有使用0.05M的方法。Nelson等(2007)试验证明,使用柠檬酸缓冲液测定真菌性植酸酶的活性仅相当于使用乙酸缓冲液的65%～70%。然而,在缓冲液使用上的差异并不对所有

4、植酸酶都产生相同的影响。Dalsgaard等(2007)发现,乙酸缓冲液和柠檬酸缓冲液对两种大肠杆菌植酸酶的相对酶活的影响区别很大,用柠檬酸缓冲液分析得到的植酸酶活性只相当于用乙酸缓冲液的1/3左右。我们应用相同测定方法、不同的两种缓冲液测定同一种木聚糖酶样品,结果使用乙酸缓冲液测定的酶活仅相当于使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的60%～70%。2底物配置底物的差别对酶活测定结果具有很大影响。其选择最好是酶制剂实际应用时所对应的酶解底物,但是在实际检测时因为考虑到底物稳定性以及酶活检测的方便性等问题,底物的性质和型号往往有很大区别。对于没有统一国标

5、规定的测定方法,在底物的性质上存在许多不同,其中多以盐的形式居多,例如纤维素酶的底物以用羧甲基纤维素钠为多,但也有直接用微晶体纤维素进行测定的方法。即便是植酸酶的底物植酸钠也存在不同种型号的情况,应用不同型号的植酸钠进行测定,结果差别也很显著。我们考察了不同pH条件下2种底物(SigmaP8810和P3168)检测不同酶活水平的植酸酶时其检测值之间的差别。试验结果表明:不同pH条件下,P8810与P3168的检测结果之间差异极显著(表1)。表1不同pH下底物对不同酶活水平的植酸酶检测结果及分析酶活水平/(U/g)1000300050006000

6、7000100005.5P88101617±254158±105980±47670±14110040±11912795±100P31681340±153181±775014±175903±508009±599790±1505.0P88101748±365384±536738±338559±10110890±11814508±130P31681596±724508±266113±657498±439802±13212621±227因素P值底物P3168(5.5,5.0)P8810(5.5,5.0)P=0.0003显色剂配制酶制剂检测时其量的判断一

7、般都是通过试剂显色来确定,并用不同的方式对比产物生成的量。显色剂里同时配有使反应中止的试剂,使整个溶液起到显色和中止的作用,一般显色液的配制都比较复杂,例如植酸酶显色剂钒钼酸胺溶液、测定还原糖类用的显色剂DNS(3,5-二硝基水杨酸)溶液等。其中,显色剂类型不同、相同显色剂但其中物质配比不同、显色剂在反应中添加量不同以及显色时间不同,都会产生不同的反应结果,对酶活检测的值也会产生一定的影响。聂国兴(2002)研究了DNS量对木聚糖酶活性测定的影响,结果表明,由于DNS用量变化,测定结果也发生了明显变化,DNS用量在3mL时测得的酶活最高。王琳等

8、(1998)研究DNS法测定纤维素酶活力最适条件,结果表明,DNS显色5min比较适宜。DNS溶液的配置以3,5-二硝基水杨酸试剂为主,加入氢氧化钠保