非细胞结构的超微生物-病毒

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第二章非细胞结构的超微生物-病毒 第一节病毒的一般特征及其分类 由于人类视觉所限，故形体越小的生物就越不易被发现。因此，在生物界中，微生物的发现比动、植物迟得多；在微生物中，细菌发现得较迟，病毒更迟；在病毒中，类病毒、拟病毒和朊病毒等亚病毒的发现最迟。病毒的发现 发现1886年，德国农业化学家迈尔在荷兰的接种试验(烟草花叶病是一种传染性疾病) 1892年，俄罗斯伊万诺夫斯基烟草花叶病感病因子（细菌滤器滤过性）发现 发现1935年，美国生物化学家斯坦莱烟草花叶病毒结晶 病毒定义病毒是一类超显微的非细胞生物，每一种病毒只含有一种核酸；它们只能在活细胞内营专性寄生，靠其宿主代谢系统的协助来复制核酸、合成蛋白质等组分，然后再进行装配而得以增殖；在离体条件下，它们能以无生命的化学大分子状态长期存在并保持其侵染活性。 一、病毒的特点病毒在寄主细胞外，不能独立地进行代谢和繁殖，它们是严格的寄生物，与其它生物相比有明显不同，具有其本身的特点。1.形体及其微小，必须在电子显微镜下才能观察，一般都可通过细菌滤器；2.没有细胞构造，故也称分子生物；3.其主要成分仅有核酸和蛋白质两种；4.每一种病毒只有一种核酸，不是DNA就是RNA； 5.缺乏酶系统，既无产酶系统也无蛋白质合成系统；6.在宿主细胞的协助下，通过核酸的复制和核酸蛋白装配的形式进行增殖，不存在个体的生长和二分裂法等细胞繁殖方式；7.在宿主的活细胞内营专性寄生；8.在离体条件下，能以无生命的化学大分子状态存在，并可形成结晶； 9.经提纯的病毒结晶能保持侵染力。人类传染病中，约70—80%属于病毒病，每一种植物至少有一种病毒引起的病害。引起人类致病的病毒相当多，如肝炎，胆囊炎，狂犬病，爱滋病，风湿关节炎等，也有多种病毒可以致人癌症。10.对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感。迄今，还未发现一种药剂或抗菌素对人、动植物体内病毒有效的药物，也没有一种药剂能杀死细胞体内的病毒而又不伤害寄主。经提纯分离在体外的病毒结晶，用不少的药物都可杀死，但寄主细胞内的病毒均不敏感。干扰素（IFN）是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。 二、病毒的分类病毒的分类病毒有自己单独的分类系统，其分类依据主要有：病毒的宿主、所致疾病、核酸种类、病毒粒子的大小、病毒的结构、有无被膜等。1.根据专性寄主分类：植物病毒、动物病毒、细菌病毒（噬菌体）、放线菌病毒（噬放线菌体）、藻类病毒、真菌病毒。动物病毒寄生在人体和动物体内引起人和动物疾病：如流行性感冒、水痘、麻疹、腮腺炎、乙型脑炎、脊髓灰质炎、甲型肝炎、乙型肝炎、天花、艾滋病等。植物病毒引起植物疾病：烟草花叶病、番茄丛矮病等。噬菌体寄生在细菌体内引起细菌疾病。用蓝细菌噬菌体控制水华。2.根据核酸分类：DNA病毒和RNA病毒。 类病毒是目前已知最小的可传染的致病因子，比普通病毒简单，是无蛋白质外壳保护的游离的共价闭合环状单链RNA分子，侵入宿主细胞后自我复制，并使宿主致病或死亡。不能像病毒那样感染细胞，只有当植物细胞受到损伤，失去膜屏障，才能在供体植株与受体植株间传染。柑桔裂皮病，黄瓜白果病，椰子死亡病等防治的方法主要选择无感的种子和繁殖体，以及防止机械传播。对类病毒的研究可能为揭示生命起源和进化、生命过程的实现等生命科学的重大理论问题作出贡献。 朊病毒又称蛋白质侵染因子。朊病毒是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子无免疫性疏水蛋白质。与一般病毒不一样，它只有蛋白质而无核酸，但却既有感染性，又有遗传性，三百年前，羊搔痒症，广泛传播于欧洲和澳洲，1996年春天英国蔓延的“疯牛病”。1997年，诺贝尔生理医学奖授予了美国生物化学家斯坦利·普鲁辛纳。为致死性中枢神经系统的慢性退化性脑病，感染朊病毒后有超长的潜伏期，平均20年，最长可达到50年，发病前无法检测和诊断。朊病毒目前尚未有有效的治疗方法，因此属“不治之症。”朊病毒的传播途径包括，食用动物肉骨粉饲料、牛骨粉汤；医源性感染，如使用脑垂体生长激素、促性腺激素和硬脑膜移植、角膜移植、输血等。 第二节病毒形态和结构一.病毒的大小和形态测量的单位是纳米，在电子显微镜下观察。多数病毒粒子的直径在100nm左右。不同病毒大小差别较大。病毒的形态主要有球形、杆形、砖形、蝌蚪形等。 有代表性的若干病毒的直径或大小 烟草mosaic病毒RNA核壳体烟草花叶病病毒结构（螺旋对称）烟草花叶病毒的杆状壳体由2130个壳粒螺旋排列而成，大约有130个螺旋。 腺病毒粒子的三维结构人体腺病毒负染照片腺病毒二十面体对称的模式图及负染显微照片。腺病毒结构（二十面体对称） 大肠杆菌的T4噬菌体是由椭圆形的二十面体头部和螺旋对称的尾部组合而成，是病毒中复合对称的代表。大肠杆菌的T4噬菌体结构（复合对称型） 登革热病毒照片 艾滋病病毒 水生动物皮瘤中的虹色病毒 BacterialVirusesMaintypesofbacterialviruses.Sizesareapproximatescale 二.病毒的化学组成和结构由于病毒是非细胞生物，故单个病毒个体不能称作“单细胞”，这样，就产生了病毒粒子（virion，即病毒体）的名词。病毒粒子有时也称病毒颗粒（virusparticle），是指结构完整的、具有感染力的病毒体。 病毒粒子的主要成分是核酸和蛋白质。核酸位于病毒粒子的中心，构成了它的核心（核酸内芯）或基因组；蛋白质包围在核心周围，构成了病毒粒子的衣壳。衣壳是病毒粒子的主要支架结构和抗原成分，对核酸有保护作用。衣壳是由许多在电镜下可辨别的形态学亚单位——衣壳粒所构成。核心和衣壳合在一起称为核衣壳，它是任何病毒（指“真病毒”）所必须具备的基本结构。有些较复杂的病毒，在其核衣壳外还被一层由类脂或脂蛋白组成的被膜包裹着。有时，被膜上还长有刺突等附属物。 病毒蛋白质的功能：保护病毒使其免受环境因素的影响。决定病毒感染的特异性。使病毒与敏感细胞表面特定部位有特异亲和力，病毒可牢固的附着在敏感细胞上。病毒蛋白质还有致病性、毒力和抗原性。 动植物病毒核酸类型dsDNA，ssDNA，dsRNA，ssRNA。病毒其核酸含量占1-5%不等，如感冒病毒核酸占1%，99%占蛋白质。TMV含核酸5%，含95%蛋白质。核酸可用物理、化学方法分离出来，分离出的核酸仍具有侵染力。病毒核酸的功能决定病毒遗传、变异和对敏感宿主细胞的感染力。 病毒粒子的模式构造 由于衣壳粒的排列组合不同，使病毒有三种对称性构型。立体对称型（主要是20面体）；螺旋对称型；复合对称型。 头部尾鞘尾丝刺突基板尾管复合对称的代表—T偶数噬菌体 具有复合对称衣壳结构的典型是有尾噬菌体，以大肠杆菌T4噬菌体为例。T4噬菌体的头部为二十面体对称结构，直径为5nm。噬菌体(phage)的尾部较为复杂，由尾鞘、尾管、颈部、基板、尾钉和尾丝组成。头部与尾部由颈部连接起来。 噬菌体感染大肠杆菌 一组噬菌体 一、病毒的繁殖过程以大肠杆菌T系噬菌体为例。有如下四步：吸附、侵入、复制、聚集和释放。第三节病毒的繁殖 烈性噬菌体的繁殖过程（裂解性周期）： 1.吸附通过噬菌体表面特异性吸附蛋白与细菌细胞表面受体相互作用。E.Coli的T4噬菌体：以细菌细胞壁脂多糖或蛋白质作受体，受体性质的变化与噬菌体宿主选择性有关。T4噬菌体吸附涉及多个尾部结构，当一个尾丝接触菌体表面的受体后，噬菌体的吸附过程就开始。在更多的尾丝接触后，刺突、基板就固定到细胞表面。 吸附的机理：尾丝尖端与受体发生共价结合。 影响因素：噬菌体数量；阳离子；辅助因子；温度。 2.侵入T偶数噬菌体核酸以注射式侵入方式进人细胞。机制：T偶数噬菌体尾部的溶菌酶使细胞壁变弱，当尾鞘与细胞壁接触后，尾鞘蛋白收缩的结果使得基板上升，挤压尾管穿过削弱的细菌细胞壁到达质膜或细胞质，于是噬菌体头部的dsDNA分子通过尾管注人细胞内。 3.复制：噬菌体核酸进入寄主细胞后，操纵寄主细胞的代谢机能，大量复制噬菌体核酸，进而合成噬菌体的蛋白质，但不形成带壳体的粒子，称为潜育期。 ④聚集（装配或成熟）和释放：寄主细胞合成噬菌体壳体形成完整的噬菌体粒子。噬菌体粒子成熟，引起寄主细胞的裂解释放出病毒粒子。随种类不同，一个寄主细胞释放10～1000个噬菌体粒子。 聚集主要步骤：DNA分子缩合，通过衣壳包裹DNA而形成完整头部，尾丝和尾部其他部件独立装配完成，头部和尾部相结合后，最后装上尾丝。释放：成熟的噬菌体，在细胞内积累到一定量后，可通过噬菌体编码的溶菌酶降解细菌细胞壁，导致细胞裂解，释放出噬菌体。 把合成的各种“部件”进行自行装配的过程 大肠杆菌死亡并破裂，释放出里面的病毒，新一代病毒开始新的生命旅程 二、噬菌体的类型根据噬菌体与宿主菌的相互关系，噬菌体可分为两类：毒（烈）性噬菌体：能在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌。属正常表现的噬菌体，引起裂解。温和噬菌体：某些噬菌体感染宿主细胞后并不使宿主细胞马上裂解而是噬菌体的核酸整和到宿主细胞染色体上并随宿主细胞的分裂把噬菌体的核酸传给子细胞。这种感染宿主细胞后不引起宿主细胞迅速裂解的噬菌体称为温和噬菌体。 温和噬菌体的基因组能与宿主菌基因组整合，并随细菌分裂传至子代细菌的基因组中，不引起细菌裂解。整合在细菌基因组中的噬菌体基因组称为前噬菌体(prophage)，带有前噬菌体基因组的细菌称为溶原性细菌(lysogenicbacterium).前噬菌体偶尔可自发地或在某些理化和生物因素的诱导下脱离宿主菌基因组而进入溶菌周期，产生成熟噬菌体，导致细菌裂解。温和噬菌体这种产生成熟噬菌体颗粒和溶解宿主菌的潜在能力，称为溶原性(lysogeny)。温和噬菌体可有三种存在状态：A.游离的具有感染性的噬菌体颗粒；B.宿主菌胞质内类似质粒形式的噬菌体核酸；C.前噬菌体。某些前噬菌体可导致细菌基因型和性状发生改变，这称为溶原性转换(lysogenicconversion)。温和噬菌体 温和噬菌体及其溶原化 第四节病毒的测定与培养二、病毒的培养特征在细菌培养液中，细菌被噬菌体感染，细胞裂解，浑浊的菌悬液变成为透明的裂解溶液。在固体培养基上-噬菌斑一、病毒的测定：1、病毒颗粒计数法：浓度2、间接计数法：血细胞凝集，效价3、病毒感染效价测定法：噬菌体 噬菌斑将少量噬菌体与大量宿主细胞混合后，将此混合液与45℃左右的琼脂培养基在培养皿中充分混匀，铺平后培养。经数小时至10余小时后，在平板表面布满宿主细胞的菌苔上，可以用肉眼看到一个个透亮不长菌的小圆斑，这就是噬菌斑(plaque)。每一个噬菌斑一般是由一个噬菌体粒子形成的。原因：当一个噬菌体侵染一个敏感细胞后，隔不久即释放出一群子代噬菌体，它们通过琼脂层的扩散又侵染周围的宿主细胞，并引起它们裂解，如此经过多次重复，就出现了一个由无数噬菌体粒子构成的群体。 噬菌斑的形成与细菌菌落的形成有点相似，所不同的只是噬菌斑甚像一个“负菌落”。噬菌斑的形成可用于检出、分离、纯化噬菌体和进行噬菌体的计数。 噬斑荧光假单胞菌 若将噬菌体按一定倍数稀释，通过噬斑计数，可测定一噬斑形成单位(plaqueformingunits,pfu) 2.病毒的培养基：病毒是专性寄生在活的敏感宿主细胞内才能生长繁殖的微生物。因此病毒的培养基要求苛刻，专一性强。敏感细胞要求具备以下条件：必须是活的敏感宿主或是活的敏感宿主组织细胞；能够提供病毒附着的受体；敏感细胞内没有破坏特异性病毒的限制性核酸内切酶，病毒进入细胞就可生长繁殖。 脊椎动物病毒的培养基：人胚组织细胞、人组织细胞、人肿瘤细胞、动物组织细胞、鸡鸭胚细胞、敏感动物。植物病毒的培养基：与之相应的敏感植株和敏感的植物组织。噬菌体的培养基：相应的敏感细菌。不同种类的病毒培养基是不同的。 3.病毒的培养动物病毒：动物接种、鸡胚接种和组织培养技术噬菌体：双层琼脂法培养 琼脂平板菌液+噬菌体试样+琼脂培养基培养10余小时计数噬菌斑噬菌斑数=试样中噬菌体数双层平板法 病毒的滴度：能产生培养管中50%的CPE（细胞病理效应）的最高病毒稀释度（即最少病毒量），称为TCLD50组织培养感染剂量。若是敏感动物则用ID50（使50%的敏感动物发生变化的感染剂量），或LD50（引起50%敏感动物死亡的致死剂量）表示病毒的滴度。 第五节病毒对物理化学因素的抵抗力及在污水处理过程中的去除效果一病毒对物理因素的抵抗力1.温度在宿主细胞外的病毒大多数在55-65℃范围内不到1h灭活。高温使病毒的核酸和蛋白质衣壳受损伤，蛋白质的变性作用阻碍了病毒吸附到宿主细胞上，削弱了病毒的感染力。低温不会灭活病毒，通常在-75℃保存病毒。 2.光和其它辐射紫外辐射：有灭活病毒的作用。灭活的部位是病毒的核酸，形成胸腺嘧啶二聚体。可见光：大多数肠道病毒对可见光很敏感而被杀死，称为“光灭活作用”。离子辐射：X射线、r射线也有灭活作用。 3.干燥干燥也是控制环境中病毒的重要因素。在土壤中，水分含量低于10％时，病毒会迅速灭活。 对化学因素的抵抗力1.体内灭活：抗体、干扰素2.体外灭活：破坏蛋白质的化学物质：酚、低离子强度环境破坏核酸的化学物质：甲醛、亚硝酸、氨影响脂类的化学物质：醚、SDS、氯仿、去氧胆酸钠pH值对病毒的影响:pH6.0~8.0：稳定，pH5以下或pH9以上：迅速失活； 病毒的危害：水痘、天花、流感、艾滋病等应用：疫苗，生物杀虫剂另外，用于细菌鉴定和分型，分子生物学领域重要的实验工具和最理想的材料，用于治疗传染性疾病，检测人、动物、植物病原菌等环境方面：水华、赤潮：蓝细菌病毒污泥丝状膨胀：球衣菌病毒第六节病毒的危害、应用