原子力显微镜在单分子研究中的应用

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1、原子力显微镜在纳米生物学研究中的应用蒋青青1张利娟2张钰1郭彦1任炜1张晓晖1王鑫艳1*收稿日期:2010-01-05接受日期:2010-8-31中国科学院知识创新工程重要方向项目百人计划(No.0813S11411)资助项目*通讯作者。Tel:021-54921192,Fax:021-54921191,E-mail:xinyanwang2008@hotmail.com(1中国科学院生物化学与细胞生物学研究所,上海200031,2重庆市畜牧科学院,重庆402460)摘要原子力显微镜(atomicfo

2、rcemicroscope,AFM)自从1986年发明以来，作为一种重要的单分子研究工具，在包括细胞粘附、蛋白折叠以及蛋白间的相互作用等生物学过程的研究中得到了广泛应用。本文主要介绍原子力显微镜的原理，着重于研究相互作用时能垒大小的确定，以及常用的单分子表面修饰方法。关键词原子力显微镜(AFM);单分子;能垒;表面修饰1引言蛋白之间正常的相互作用是机体发挥其生理学功能的基础。目前的生化方法可以检测出蛋白间相互作用的亲和力或速度常数。尽管这些方法可以估测出蛋白相互作用的速率和自由能的指标，但是它们不能

3、检测相互作用动力学的重要特征，而那些恰恰可以揭示各种不同的中间态或替代反应途径。近几十年，很多可以直接用于测量生物分子间相互作用这一动态过程的高分辨率的技术迅速发展，包括原子力显微镜、光镊和生物膜力学探针等单分子技术。其中，原子力显微镜拥有低至纳米和微秒水平的超高分辨率，为实时测量单分子间的相互作用提供了新的途径[1,2]。采用单分子技术避免了其他方法的内在缺陷，使实时检测单个分子间的相互作用成为可能[1,3,4]。因此单分子技术无疑成了理解控制蛋白间结合、解离和过渡态能级图的有力工具[2,5]。此

4、外，在细胞表面，外力作用可以不断的拉伸分子。比如细胞迁移时，利用单分子技术，可以观察在牵引力诱导下细胞表面粘附受体受到粘附和去粘附的循环过程[6]。而传统的生物技术要揭示蛋白间相互作用的内力和外力的影响往往难以实现[7]。但是，采用原子力显微镜之类的单分子工具，则可以直接测出保持蛋白复合体的力，并可测量反应过程中的压力和拉力[2]，有助于深入研究细胞表面及蛋白间相互作用的动力学能级和确定能垒。本文就原子力显微镜的原理、方法及其作为单分子工具在蛋白间相互作用研究中的应用做一简要综述，着重阐述研究相互作

5、用时能垒大小的确定，以及常用的单分子表面修饰方法。2原子力显微镜简介2.1原子力显微镜工作原理原子力显微镜主要包括微悬臂、探针、样品台、能精确移动样品台或微悬臂的压电陶瓷转换器、以及用于记录微悬臂反射光偏移变化的包含了激光和光电探测器的光学偏转系统(图1)。微悬臂的尖部置于倒置显微镜上，实时采集光学和原子力显微镜信号，从而能够实时观察到细胞形态，更适宜对活细胞进行研究。原子力显微镜最早被用作成像工具[4]，通过有弹性的微悬臂扫描来探测样品的形貌。在成像模式下，原子力显微镜是通过在X和Y轴方向，扫描连

6、在其悬臂末端的探针在接触样品时实现的。在做样品表面扫描时，压电陶瓷不断的校正微悬臂的位置从而保持偏离常数不变，通过探测探针的位置变化，可以转化得到原子级分辨率的样品表面形貌图。为了把偏离转换为力单位，微悬臂必须经过校准测量，然后算出微悬臂的弹性系数kC。校准微悬臂的方法有2种[8]：应用已知的力常数F测出微悬臂的偏离x[9]，或者测量微悬臂的热共振频率[10]。目前最常用的方法是根据Hutter和Bechhoefer的方法[10]，把微悬臂看做一个简易的谐振器，振动模式下每接收到一个自由度的热能kB

7、T/2，微悬臂即可从已测量过的微悬臂偏离方差来计算其弹性系数，即1/2kBT=1/2kC，其中kB和T分别代表波尔兹曼常数和绝对温度。Fig.1Schematicoftheatomicforcemicroscope(AFM)一束激光直接打在微悬臂上，继而反射到裂像光电二极管上面，通过不同的A-B信号就反映出施加给探针的力。微悬臂小位移时遵从胡克定律，所以微悬臂弹性系数校正后的光电二极管信号即反映了探针和样品间的相互作用力。2.2典型的原子力显微镜力曲线采用力扫描模式，原子力显微镜可以

8、在单分子水平测定两个相对独立表面间的相互作用，出现就是典型的原子力显微镜力曲线。当微悬臂上抬时，通过测量相对于“零点力”的偏移量，得到悬臂接触表面后返回的曲线，从而得到单个蛋白复合体间分开的力(图2)。在很多实验中，微悬臂的移动速度达到每秒几个微米时，力的曲线通过测定微悬臂速度就可得到。由于介质中存在阻力，微悬臂在自由接近和向后拉时将经受一个与速率成比例的弯曲常数。阻力不仅取决于微悬臂的速率和随温度变化的介质的粘性，还取决于微悬臂的自身特点、样品的形貌、以及微悬臂与样