gbt 27635-2011 斑点叉尾鮰嗜麦芽寡养单胞菌检测操作方法

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1、ICS11．220B41蝠亘中华人民共和国国家标准GB／T27635—201斑点叉尾触嗜麦芽寡养单胞茵检测操作方法ProtocolofidentificationofStenotrophomonasmaltophiliafromIctaluruspunctatusRafinsque2011-12-30发布2012-04—01实施丰瞀徽鬻瓣警襻瞥星发布中国国家标准化管理委员会况10刖罱GB／T27635--2011本标准按照GB／T1．12009的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防

2、疫标准化技术委员会(SAC／TC181)归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人：薛峰、蒋原、袁芳、王云飞、张睿、易海华、徐帮兴、邵卫星、马卉、栾军、陈国强、乔华林、谢怀根。1范围斑点叉尾触嗜麦芽寡养单胞菌检测操作方法本标准规定了斑点叉尾蛔嗜麦芽寡养单胞菌的分离与鉴定方法。本标准适用于对斑点叉尾鲴的嗜麦芽寡养单胞菌的分离、鉴定。2规范性引用文件GB／T2763512011下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件；仅注日期的版本适

3、用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T4789．28—2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB／T66822008分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。NA：nutrientagar，普通营养琼脂。TSA：tryptosesoyaagar，大豆胰蛋白胨琼脂。VIA：amphotericinB；imipenem；vancomycinhydrochloride，含有万古霉素、亚胺培南、两性霉素B的选择性平板。4设备和材料4．1冰

4、箱：0℃～4℃。4．2恒温培养箱：28℃士1℃。4．3铂／铱接种环或玻璃棒。4．4滤纸。4．5发酵管。4．6天平：0g～100g，精确至0．5g。4．7均质器或灭菌乳钵。4．8灭菌广口瓶：500mL。4．9灭菌三角烧瓶：500mL，250mL。4．10灭菌培养皿：直径90cm。4．11显微镜：10×～100×。5试剂和培养基5．1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB／T668212008规定的二级水，所用化学试剂1GB／T27635—2011均为分析纯。5．2普通营养肉汤、大豆胰蛋白胨琼脂(TSA

5、)、普通营养琼脂(NA)、普通羊血营养琼脂和VIA的配制见附录A(也可按GB／T4789．28—2003中4．7规定)。5．3革兰氏染色液：按GB／T4789．28—2003中2．2规定。5．4氧化酶试剂：按GB／T4789．28--2003中3．18规定。5．5糖发酵管：麦芽糖按GB／T4789．28—2003中3．2规定。5．6DNA酶甲基绿琼脂：按GB／T4789．282003中4．51规定。5．7微量生化反应管：乳糖、水杨苷、乙酸盐、丙酸盐、戊酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、L_苹果酸盐、乳酸

6、盐、柠檬酸盐、2一酮戊二酸盐、丙酮酸盐生化反应，L_丙氨酸、D丙氨酸、L．谷氨酸盐、L_组氨酸和L_脯氨酸，按照GB／T4789．282003中规定。5．8API20E生化鉴定试剂盒。6检验程序斑点叉尾鲴嗜麦芽寡养单胞菌检验程序见图1。图1斑点叉尾蛔嗜麦芽寡养单胞菌检验程序7操作步骤GB／T27635--20117．1样品处理液的制备以无菌操作取出有病症鱼体，直接从鱼体肝、肾等组织中采样。如果是体长小于4crfx的幼鱼取整条鱼，如果是体长4cm～6cm的鱼取内脏。将鱼体或内脏25g均质于225mL营养肉汤中

7、，28℃士1℃，需氧培养24h，无菌取培养液作为样品处理液。7．2细菌的分离将24h普通营养肉汤增菌液划线接种于VIA，置于28℃需氧培养24h，显微镜观察，背景未变化的单个优势菌落为可疑菌落。7．3可疑菌落筛选挑取背景未变化的单个优势可疑菌落于大豆胰蛋白胨琼脂或普通营养琼脂或者普通羊血平板，置于28℃需氧培养24h。观察菌落的大小、形态。在普通营养琼脂上菌落呈灰白色，圆形，表面光滑，边沿整齐的半透明菌落；在大豆胰蛋白胨琼脂(TsA)平板上形成圆形，表面光滑，边缘整齐，直径0．18mm～1．12mm的透明的

8、无色菌落；在普通羊血琼脂平板上出现明显的口溶血环，且溶血环呈草绿色，有强烈的氨味。符合以上菌落特征的为可疑菌株。7．4嗜麦芽寡养单胞菌的鉴定7．4．1革兰氏染色对可疑茵落进行革兰氏染色，嗜麦芽寡养单胞菌为G杆菌，无荚膜，无芽孢，极生端鞭毛，鞭毛数不小于2。7．4．2氧化酶实验使用铂／铱接种环或玻璃棒，挑取单个可疑菌落，然后接种到用氧化酶试剂澜湿的滤纸上，如果在10s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性，不变色为阴性