最新疫苗中支原体的检测PPT课件.ppt

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1、主要内容1.支原体2.支原体的危害3.支原体的检测方法培养法指示细胞培养法1.支原体又称霉形体，为目前发现的最小的最简单的原核生物。结构也比较简单，多数呈球形，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。其大小介于细菌和病毒之间。可通过滤菌器，常给细胞培养工作及发酵和制药灭菌带来污染的麻烦。一般能以葡萄糖或精氨酸为主要碳源。2.支原体的危害致病支原体一般包括肺炎支原体，人型支原体，生殖器支原体。肺炎支原体引起支原体肺炎，又称原发性非典型肺炎，支原体肺炎全年均可发病，以冬季多见，可有小流行。人型支原体和生殖器支原体一般引起尿道及生殖器的感染。3.1培养法培

2、养基制备培养基灵敏度检测培养基处理接种培养结果判定推荐培养基及其处方（1）支原体肉汤培养基猪胃消化液500ml氯化钠2.5g牛肉浸液（1:2）500ml葡萄糖5.0g酵母浸粉5.0g酚红0.02gpH值7.6±0.2于121℃灭菌15分钟。（2）精氨酸支原体肉汤培养基猪胃消化液500ml牛肉浸液（1:2）500ml葡萄糖1.0g酵母浸粉5.0gL-精氨酸2.0g酚红0.02g氯化钠2.5gpH值7.1±0.2。于121℃灭菌15分钟。（3）支原体半流体培养基按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂2.5～3.0g。（4）支原体琼脂培养基按（1）项处方配制，培

3、养基中不加酚红，加入琼脂13.0～15.0g。培养基灵敏度检测（1）菌种肺炎支原体（ATCC15531）、口腔支原体（ATCC23714），由国家药品检定机构分发。（2）操作将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传2代后，将培养物接种到待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7～10-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种3支试管，置36℃士1℃培养7～14天，观察培养基变色结果。(3)结果判定以接种后培养基管数的2/3以上呈现变色的最高稀释度为该

4、培养基的灵敏度。液体培养基的灵敏度：肺炎支原体（ATCC15531)应达到10-8，口腔支原体（ATCC23714）应达到10-4。培养基处理检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基（或支原体琼脂培养基）。支原体半流体培养基（或琼脂培养基）在使用前应煮沸10～15分钟，冷却至56℃左右，然后加人灭能新生牛血清（培养基与血清体积比为8:2)，并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。接种培养取每支装量为10ml的支原体半流体培养墓（已冷至36℃士1℃）和支原体肉汤培养基各4支，每支培养基接种供试品0.5～1.0m

5、l，置36℃士1℃培养21天。于接种后的第7天从4支中取2支进行次代培养，每1支培养基转种支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基各2支，置36℃士l℃培养21天，每隔3天观察1次．结果判定培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。3.2指示细胞培养法（DNA染色法）实验试剂的制备培养基及指示细胞的处理供试品处理用指示细胞培养后固定封片阴性、阳性对照处理结果判定实验试剂制备（1）二苯甲酰胺荧光染料浓缩液称取二苯甲酰胺荧光染料5mg，加人

6、100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hank's平衡盐溶液中，室温下用磁力搅拌器搅拌30～40分钟，使完全溶解，-20℃避光保存。（2）二苯甲酰胺荧光染料工作液无酚红和碳酸氢钠的Hank's溶液100ml中加人二苯甲酰胺荧光染料浓缩液lml，混匀。（3）固定液醋酸:甲醉（体积比1:3）混合溶液。（4）封片液量取0.1mol/L枸橼酸溶液22.2ml、0.2mol/L磷酸氢二钠溶液27.8ml、甘油50.0ml，混匀，调pH值至5.5。培养基及指示细胞处理（1）DMEM完全培养基。(2)DMEM无抗生素培养基。(3)指示细胞（已证明无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞

7、）取培养的Vero细胞经消化后，制成每lml含105的细胞悬液，以每孔0.5ml接种6孔细胞培养板或其他容器，每孔再加无抗生素培养基3ml，于36℃士1℃、5％二氧化碳条件下培养过夜，备用。供试品处理（1）细胞培养物将供试品经无抗生素培养液至少传1代，然后取细胞已长满的且3天未换液的细胞培养上清液待检。（2）毒种悬液如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判定时，应用对支原体无抑制作用的特异抗血清中和病毒后或用不产生细胞病变的另一种指示细胞进行检查。（3）其他供试品检查时所选用的指示细胞应为该供试品对其生长无影响的细胞。用指示细胞培养后固定封片于制备好的指示细胞培养

8、板中加入供