最新高效液相色谱法的应用课件ppt.ppt

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1、高效液相色谱法的应用目录CONTENTS在微生物分析鉴定的应用在分离蛋白质方面的应用在药物分析鉴别方面的作用在其他方面的应用举例HPLC应用于细菌的分子生物学鉴定和细菌细胞的化学成分分析可直接测定细菌DNA的碱基组成和细菌的化学组分，为细菌的分类鉴定提供有利的证据。因此，HPLC在微生物鉴定中的应用越来越受到人们的关注。1.1细菌DNA的G+C含量测定2.枝菌酸的分析3.醌类的分析等01在微生物分析与鉴定的作用添加相关标题文字添加相关标题文字在其他方面的应用环境保护方面高效液相色谱在检测制药废水中的应用，制药废水中的残留药物成分对环境造成的污染越来越严重,制药废水的治理已成为环境保护工作

2、中相当重要的方面。所以检测制药废水也是生物制药工业下游技术中很重要的一个组成部分。杂合子个体的DNA经扩增产生杂合二倍体,它与纯合子个体的DNA扩增产物一完全匹配的纯合二倍体的解链特征不同，在部分加热变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体于柱中的保留时间差异,而发现DNA的突变。当柱温升高使DNA片段开始变性,则部分变性的DNA可被较低浓度的乙腈洗脱下来。由于异源双链(错配的)DNA与同源双链DNA的解链特征不同，在相同的部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，被色谱柱保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。在基因突变方面的应用例子：高效液

3、相色谱测定饮料中的苯甲酸一. 实验目的：1.学习高效液相色谱法的测定原理；2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量分析方法。二。实验原理：高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似，流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小口径短的不锈钢柱内

4、，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内获得高的分离能力。由于80%的有机化合物都可以用高效液相色谱法分析，目前已经广泛应用于生物工程、制药工业、食品工业、环境检测、石油化工等行业。根据使用的固定相及流动相的极性不同，分为正相液相色谱和反相液相色谱：固定相为极性，流动相为非极性的液相色谱色谱称为正相液相色谱（固定相为硅胶和氧化镁，流动相为正己烷，醚等）；固定相为非极性，流动相为极性的液相色谱色谱称为反相液相色谱（固定相为碳粒和氧化铝，流动相为水、醇等）。可分析低分子量、低沸点的有机化合物，更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有

5、机化合物。（1）定性分析：液相色谱法可以分离有机化合物，在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度取决于它们在固定相和流动相中的分配系数K：K=（组分在固定相中的浓度）/（组分在流动相中的浓度）显然，K值越大，组分在固定相上的停留时间越长，容易理解：溶质流经色谱柱时，K值越大停留的时间也越长，K值越小，停留的时间也越短，由于组分在固定相的K不同，就会出现差速迁移，从而达到分离的目的。一般情况下，当外界条件及方法确定，溶质流经色谱柱时，不同分配系数的物质流出色谱柱的时间不一致，在检测器上得到响应，表现为出峰时间不一致，同一组分（K值固定），保留时间To一致，根据这个特性，可以分离不同的有机化合

6、物。（2）定量分析（ESTD法）：用高效液相色谱法测定未知样品中的苯甲酸含量，将已配置浓度不同的苯甲酸标准溶液也进入色谱系统，绘制浓度——峰面积的标准曲线。如流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间（T0或保留距离）和峰面积A后，可直接用T0定性，用峰面积作为定量测定的参数，注入未知样品后，得知未知样品的峰面积，查标准曲线，求出未知样中的苯甲酸的含量。三．仪器和试剂：1．高效液相色谱仪，VWD（254nm）检测仪。2．色谱柱：C183．超声波发生器或水泵(用于过滤或排气)4．注射器：50微升5．容量瓶：100ml若干6．移液管：2ml、4ml、8ml7．流动相

7、：甲醇：乙酸+乙酸氨（PH=3.5）=60：40，制备前，先调节水(用酸或缓冲盐)的PH=3.5，进入系统色谱前，用超声波发生器或水泵脱气。四．实验步骤：（ESTD法）1．标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂，用纯水或去离子水溶解，定容到100毫升，浓度为1.44mg/ml.分别取此标准液5ml，2.5ml，1ml,0.5ml稀释为10ml，则浓度分别为0.72mg/ml，0.36mg/ml，0.144mg/ml，0.