最新第十一课：流式细胞术测定植物基因组大小概论(1)教学讲义PPT.ppt

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1、第十一课：流式细胞术测定植物基因组大小概论(1)流式细胞术(FlowCytometry,FCM)流式细胞术，即利用流式细胞计对处在快速直线流动状态中的单细胞活生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术，是20世纪70年代发展起来的一项技术，综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等各学科的知识，它是一种自动分析的技术。流式细胞仪(FlowCytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、流体力学为一体的一种新型高科技仪器。概念一流式细胞术

2、的基本知识流式细胞术特点单细胞悬液或生物颗粒分析速度高多参数精度高当代最先进的细胞定量分析技术高灵敏度无害分析和分选流式细胞仪检测范围细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞结构特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能细胞信号转导/通路分析细胞间相互作用分子共定位与胞内分子转运细胞形态学荧光原位杂交基因表达分析细胞凋亡细胞周期分析白细胞亚群分析ImageStream成像流式细胞仪COPASTM生物分选系统流式细胞技术的最新突破分选微型模式生物C

3、OPAS在线虫分选方面的应用，就在Nature系列杂志上发表了7篇以上的文献模式动植物研究、大体积细胞研究及药物筛选等方面流式细胞仪的工作原理光学系统激光光源光收集系统液流系统流动室液流驱动系统电子系统光电转换数据处理系统细胞分选系统InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid液流系统：流动室、液流驱动系统液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱分选系统488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFA

4、LSSensorFluorescencedetectorFALSSensor90LSSensorLaser信号检测--散色光FSC(前角散射光)它反应细胞的相对大小和截面积的大小SSC(90度角散射光)代表细胞的颗粒度和精细结构的变化它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同类型的细胞群加以区分数据显示类型单参数直方图（Histogram）X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率二维等高图和密度图二维点图DotPlot便

5、于数据统计不同的细胞群可以用不同的颜色标记主要表达方式Pseudo3DPlot3DPlot利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等)与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量。二植物C值分析原理流式细胞仪计算测量DNA含量实际上是细胞周期的测量，由于细胞核G1期的DNA含量反应一个细胞的倍性，因此常用DNA含量来估计细胞倍性，包括DNA的绝对含量或相对含量。测量DNA的绝对含量时，须设一个已知DNA含量的标准样品作对照，来换算

6、出DNA的绝对含量。样品2CDNA含量=[(样品G0/G1峰均值)/(标准G0/G1峰均值)]×标准2CDNA含量(pgDNA)测量DNA的相对含量时，须设一已知倍性的同类材料作照，换算出待测样品的DNA相对含量，进行倍性分析。02004006008001000G0G1sG2MDNAcontent2N4Ncount变异系数(CoefficientofVariation,CV)：通常以G0/G1峰的宽度来反映,该指标反映了仪器的分辨率或精确度。影响CV的因素主要包括两方面：仪器因素（如鞘液的流速、光路、机器调试等）和样本制备(如样品

7、中碎片含量、细胞团块、细胞活性和细胞浓度等)及染色过程对标本的人为影响。优化DNA分析条件就是指最大程度地减少这两大因素带来的变异。DNA指数(DNAindex,DI)：DI指的是样本G0/G1峰的平均道数与正常二倍体G0/G1峰的平均道数之间的比值。DI为1意味着二倍体(2c)。倍体(Ploidy)：原指染色体数目，流式中用来描述总的DNA含量。二倍体细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。DI为1.9-2.1的细胞为四倍体(CV<5%)。除二倍体和四倍体，其他均称异倍体。DNA检测的常用术语DI=样品G0/1细胞峰均道值

8、正常二倍体标准细胞G0/1期细胞均道值DNA的倍体和DNA指数的关系DI=1.0±0.01二倍体DI=1.0±0.15近二倍体DI=2.0±0.1四倍体DI>2.10多倍体例：G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNA