最新免疫组库测序ppt课件.ppt

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1、2018免疫组库测序目录免疫组库（IR）免疫组库测序技术信息分析1、免疫组库概念免疫组库（ImmuneRepertoire，IR）是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。研究免疫组库就要测定免疫系统中的BCR和TCR的基因或RNA分子序列。影响免疫组库组成的因素有很多种。比如年龄、疾病、免疫记忆、免疫缺陷遗传疾病、疫苗、器官移植、癌症治疗等。3、TCRT细胞受（TCR）是由T细胞分泌的膜蛋白分子，与BCR不同的是TCR只在细胞表面而不分泌出去。一个T细胞的TCR可以是α链和β链组成的，或者由γ链和δ链组成的。

2、α链和γ链由V-J-C基因片段重组而来，β链和δ链由V-D-J-C基因片段重组而来，这也类似于BCR的重链和轻链。参与特异性免疫应答的T淋巴细胞主要是α/βT淋巴细胞，占外周Ｔ淋巴细胞的90-95%。TCRβ链CDR3在抗原特异性识别中起关键作用，是直接与抗原肽的结合位点，其编码基因位于人类7号染色体（7q34），全长620kb，由50多个可变区（V区）基因片段、2组上游D基因片段/下游恒定区（C区）基因片段、6~7个J区基因片段组成，这些基因在T淋巴细胞发育早期不连续分布，在胸腺内原始T细胞阶段，D-J区片段连接为DJ片段；在成熟T淋巴细胞阶

3、段，V、D、J、C区基因片段相连成VDJC片段。据推测，胚系VDJC基因片段随机组合、重排以及TCRα/β链和γ/δ链V区基因重排产生的TCR克隆数量高达1015-1018，构成多样性极其丰富的T淋巴细胞抗原受体库。不同T淋巴细胞克隆有不同序列或长度的TCR-CDR3基因，翻译出不同的CDR3多肽序列，从而反映T淋巴细胞功能状态。在发生特异性免疫应答时，TCR多样性发生变化，出现寡克隆甚至单克隆扩增，随着胸腺再生，大量原始T淋巴细胞增殖，TCR免疫组库多样性得以恢复和重建。不同VDJ基因片段组合的多样化；不同基因片段连接时随机插入删除造成连接的

4、多样化，V(D)J连接区核苷酸的插入和删除，体现为互补决定区簇CDR3)序列多样性；不同重链和轻链组合的多样化；以及B细胞受体特有的随机高频突变。4、BCR/TCR多样性产生机制5、研究免疫组库的流程提取样本DNA/RNA:根据所要研究的问题设计试验方案，提取血液或组织样本，分离B细胞或T细胞，然后提取和纯化DNA/RNA。构建测序文库:根据不同实验情况加入不同扩增引物进行PCR扩增，从而扩增出想要测序的免疫基因，最后构建测序文库。测序:利用二代高通量测序仪，如Roche454、IlluminaHiSeq2500、IlluminaMiSeq等进

5、行测序。信息分析:对测出来的序列数据进行信息挖掘，来发掘出生物学意义与结果。数据分析主要包括数据清理、质量控制、不同样本数据分离、序列比对、序列注释以及下游的各种分析。二、免疫组库测序1、免疫组库测序概念免疫组库测序（ImmuneRepertoiresequencing(IR-SEQ)）是以T/B淋巴细胞为研究目标，用多重PCR技术或5’RACE扩增决定B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR）多样性的互补决定区（CDR3区），再结合高通量测序技术（HTS），全面评估免疫系统的多样性，深入挖掘免疫组库与疾病的关系。2、两种PCR技术的优缺点Ar

6、m-PCR是最新开创的一种高效扩增子救援多重PCR，它克服了传统多重PCR的缺限。通过在扩增的早期使用基因靶点特异性的引物，而在指数扩增期使用共用的引物，使得所有模板的扩增效率大大提高，因而具有较高的特异性和灵敏性。3、模板比较基因组虽然DNA容易制备，但PCR扩增过程中易产生非产出性的重组序列，且J-C区之间存在的大量内含子使其下游引物只能位于J区，PCR扩增的敏感性一般由细胞的拷贝量决定；相对而言，RNA需取自新鲜的标本，其产物多为产出性的CDR3序列，下游引物可选自C区，具有高度的敏感性。4、主流测序技术及优缺点免疫组库分析的精确性依赖于

7、HTS数据的可靠性。而HTS数据的可靠性又依赖于测序的准确性和覆盖的深度。Thermo测序平台IonTorrent:革新性的半导体芯片测序技术平台原理是：向DNA聚合物中加入dNTP，会释放出氢离子。我们采用半导体测定这些氢离子引起的pH变化，通过同时测量数百万起此类变化，可以测定各个片段的序列。高效靶向覆盖-运用多重PCR设计实现平均97%靶向覆盖读长-可选择200bp或400bp读长5、信息分析1、基本数据统计数据过滤，对原始数据进行去除接头污染序列及低质量reads的处理数据搭建，数据拼接，消除测序背景及有效数据构建数据统计，数据产出统计

8、及测序数据的成分和质量评估2、数据比对分析比对分析，与数据库（IMGT）V/D/J基因片段比对重新比对，寻找最佳V/D/J比对结果3、序列结构分析分析