最新人外周血单个核细胞分离及T细胞受体的检测-医学免疫学-药学医学精品资料.ppt

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1、最新人外周血单个核细胞分离及T细胞受体的检测-医学免疫学-药学医学精品资料细胞免疫功能测定淋巴细胞增殖功能检测细胞表面分子检测细胞毒试验……..2021/8/32Dep.Immuno.韩艳非内容及目的内容：人外周血单个核细胞的分离Ｔ淋巴细胞受体的检测－－Ｅ花环形成实验目的：掌握单个核细胞分离的原理及方法掌握Ｅ花环形成实验的原理及操作方法2021/8/33Dep.Immuno.韩艳非Ficoll密度梯度离心法聚蔗糖-泛影葡胺(F／H)分层液比重:1.077±0.001。红细胞、粒细胞比重大(1.092)，离

2、心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重(1.070)，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。2021/8/37Dep.Immuno.韩艳非实验方法包括：单核细胞、淋巴细胞(>90%)比重：1.077比重：1.092Ficoll比重：1.070Ficoll密度梯度离心法分离PBMC2021/8/38Dep.Immuno.韩艳非操作步骤采血：无菌采血3ml，注入盛有肝素的抗凝管中，立即轻轻摇匀。稀释：用无菌吸管加入

3、等体积的RPMI-1640液充分混匀。加样：吸取淋巴细胞分层液3ml置于一离心管中，管倾斜45度，将稀释后的血液在距分层液液面1cm处沿管壁缓慢加至分层液上面。(NOTE：不要打破血液与分层液的界面)分离：18～20℃，2500rpm，20min.（四层.>>）回收：将0.5ml吸管直接插入灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白层单个核细胞，放入新的离心管中，用5倍体积1640液洗涤2次，每次2000rpm，10min.(NOTE：尽量少吸分层液)轻！轻！轻！2021/8/39Dep.Immuno.韩艳非细胞计数：加

4、1mlRPMI-1640（10％NCS）溶液，吹打混匀。制备成PBMC细胞悬液。混匀细胞悬液，吸取0.1mlPBMC悬液加于0.9ml冰醋酸溶液中，混匀，用微量加样器取少量（20微升）加于细胞计数板上，在低倍显微镜下计数4大格内细胞总数，乘以25000，即得细胞悬液的浓度。Go>>2021/8/310Dep.Immuno.韩艳非Back>>(注：一般每ml健康成人血可分离1~2×106个单个核细胞，其中90%以上为淋巴细胞，部分是单核细胞)2021/8/311Dep.Immuno.韩艳非计数原则：计上不计

5、下，计左不计右。三个细胞以上的细胞团块计为一个。细胞计数板Back>>2021/8/312Dep.Immuno.韩艳非实验二T淋巴细胞受体的检测（E-花环试验）DetectionofERofTLymphocyte2021/8/313Dep.Immuno.韩艳非CD28分子2021/8/314Dep.Immuno.韩艳非原理T细胞表面有绵羊红细胞（SRBC)受体，称为E受体(ER)，ER即为CD2(或LFA-2)。T细胞与SRBC混合孵育，形成以T细胞为中心，四周环绕SRBC的如玫瑰花样的细胞集团，称为E-

6、玫瑰花环实验或E-花环形成实验。erythrocyteTE2021/8/315Dep.Immuno.韩艳非实验步骤分离制备PBMC，调制浓度为1*106/ml。取1ml浓度为1*106/ml的PBMC细胞悬液，2000rpm,10min。倾倒弃上清。等量10％NCS（0.1ml)重悬细胞。加入1％SRBC悬液0.2ml，轻摇混匀；37℃预温，5min1000rpm，5min4℃，1.5h。取出，弃上清（保留0.1~0.2ml)。轻转离心管，使细胞重悬。滴加0.8％戊二醛0.1ml，混匀，4℃，15min。

7、取出，轻旋，重悬细胞，制备血涂片（涂片）。染色（瑞氏染色>>），镜检。2021/8/316Dep.Immuno.韩艳非①血涂片自然风干后，滴3-5滴瑞氏染液，至盖满整个涂片为止。②  约1min后，加2-3倍蒸馏水，用洗耳球（吹）混匀。③  约4-5min（？）后，用细流水冲洗，吸水纸吸干，油镜下观察结果。瑞氏干片染色：2021/8/317Dep.Immuno.韩艳非200nE-RFC×100%E花结形成细胞百分率=镜检：计数200个淋巴细胞，周围粘附3个或3个以上SRBC的淋巴细胞为E花结形成细胞（即T

8、细胞）。注意事项：避免将单核细胞及多形核粒细胞计算在内。油镜使用后用擦镜纸拭干镜头，摆开物镜，收箱。2021/8/318Dep.Immuno.韩艳非实验材料分配：（2人/组）肝素管及淋巴细胞分离管1支/1组细胞计数板1块/2组Hank’s液1瓶/列0.8%戊二醇1瓶/班1%冰醋酸1瓶/班绵羊红细胞3瓶/班2021/8/319Dep.Immuno.韩艳非通用技术IGeneralTechnologyI1正确理解通用技术2技术对社会