第六章-沉淀法和吸附法.ppt

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1、第六章沉淀法和吸附法一、沉淀法二、吸附法(一)盐析法(二)有机溶剂沉淀法(三)等电点沉淀法(四)生成盐复合物沉淀法一、沉淀法一、沉淀法沉淀是通过改变条件或加入某种试剂，使溶液中的溶质由液相转变为固相析出的过程。成本低设备简单收率高浓缩倍数高操作简单优点：①盐析法:多用于分离纯化各种蛋白质和酶。②有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸等产品的分离纯化，也有用于蛋白质的沉淀。③等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀。④生成盐复合物沉淀法：用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。(一)盐析法高浓度的中性盐能破坏蛋白质、酶

2、等的胶体性质，中和微粒上的电荷，促使蛋白质等发生沉淀或絮凝现象。logS＝β-Ks•ⅠS—离子强度为Ⅰ时的蛋白质的溶解度；Ks—盐析常数，与温度和pH无关；β值—是溶质的特征常数，对于蛋白质而言，其大小主要取决于不同蛋白质的性质，它也与溶液的温度和pH值有关，但与盐的种类无关;为便于计算，用盐的摩尔数m代替离子强度I，则logS＝β-Ks•m1、盐析原理盐析机理示意图盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下

3、降；盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。碳氧血红蛋白的溶解度与硫酸铵离子强度的关系图pH6.6，温度25℃，logS0=17g·L-1不同蛋白质的溶解度曲线蛋白质的盐析分布曲线溶解度曲线(a)和盐析分布曲线(b)蛋白质起始浓度的影响高浓度蛋白质溶液可以减少盐的用量，但蛋白质浓度太高，会发生严重的共沉作用。2、影响盐析的主要因素无机盐种类的影响不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25℃）(○)NaCl;(▼)KCl;(◘)MgSO4;(▲)NH4SO4;(●)Na2SO4;(□)K2SO4;

4、(■)柠檬酸三钠离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。不同蛋白质盐析所需离子强度不同。可用不同的盐浓度将各种蛋白质分别沉淀析出。温度的影响升温，可增加许多无机盐和小分子有机物的溶解度。但在高盐浓度中，蛋白质等生物大分子物质的溶解度随温度的升高反而减小。pH对β的影响盐析pH的选择要以不降低产物的活性为原则。由于蛋白质在等电点时最易沉淀，可选择等电点的pH作为盐析的pH二次盐析(二)等电点沉淀法是利用两性电解质在电中性时溶解度最低的原理，进行物质分离纯化的方法。中性盐的浓度增加时，相应于最低溶解度的pH值向偏酸方向移动；同时最低溶解度会有所

5、增大。等电点沉淀法应在低离子强度下操作。许多蛋白质的等电点都在偏酸性的范围内。(二)等电点沉淀法是利用两性电解质在电中性时溶解度最低的原理进行物质分离纯化的方法。中性盐的浓度增加时，相应于最低溶解度的pH值向偏酸方向移动；同时最低溶解度会有所增大。等电点沉淀法应在低离子强度下操作。许多蛋白质的等电点都在偏酸性的范围内。许多无机酸的价格低廉，并能为食品标准允许。缺点：优点：酸化时，容易引起蛋白质失活，因为蛋白质对低pH比较敏感。等电点沉淀实例从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右进行等电点沉淀，除去共存

6、的许多酸性蛋白质(pI=3.0)。工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。等电点沉淀实例碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调pH4.0后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH9.0的0.1mol/LTris-HCl缓冲液重新溶解，加入20～40%饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。(三)有机溶剂沉淀法许多水溶性有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇等能使溶于水的小分子生物物质以及核

7、酸、多糖、蛋白质等生物大分子发生沉淀作用。其主要作用是降低水溶液的介电常数。1、有机溶剂沉淀的原理有机溶剂沉淀原理图分辨能力比盐析法高一种溶质只在一个比较窄的有机溶剂范围内沉淀沉淀不需脱盐有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，容易进行固液分离有机溶剂容易蒸发，不会在成品中残留，因此适用于食品、药品的制备。优点：容易引起蛋白质变性失活有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高需冷却、降温、低温操作。缺点：对同一种溶剂，蛋白质的分子质量越大，沉淀所需有机溶剂的量越少。2、影响有机溶剂沉淀的因素有机溶剂的种类：选择的溶剂必须能与水互溶，但与产物如蛋白质

8、等不发生反应。温度：降低温度可以增加收率。同时许多生物分子如蛋白质、核酸等对温度特别敏感，温度稍有升高，便发生变性。pH：选择溶解度最低时的pH，有助于提高沉淀效果。因此在接近等电点处，以引起沉淀所需有机溶剂的量较少。合