最新Unit3-Look-at-me!第五课时教学讲义PPT课件.ppt

《最新Unit3-Look-at-me!第五课时教学讲义PPT课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、Unit3-Look-at-me!第五课时BigHeadSonSmallHeadFather身体部位单词知识早知道greenhand生手、没有经验的人handinhand手拉手，密切相关，密不可分arminarm臂挽臂、手挽手headteacher【英】(中小学)校长、班主任1.听、读学生用书第28页的Let’slearn和Let’sdo。2.跟你朋友一起读Let’sdo的指令和做相应的动作。3.动手做一个puppet,并说说他身体的各部位名称。Homework综合性实验植物体内过氧化物酶活性测定及同工酶电泳过氧化物酶活性测定一、

2、原理1.过氧化物酶[peroxidase,POD]：广泛存在于各种动物、植物和微生物体内。催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应:RH2+H2O2→2H2O+R2.POD分子结构特点：POD是一种由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白,脱辅基蛋白分子须与血红素结合才构成全酶。3.POD的主要生理功能：◆参与活性氧代谢过程；◆参与木质素和木栓质的合成；◆参与生长素的降解。二、实验材料与试剂1.材料：玉米幼苗2.试剂：0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）；0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）愈创木酚；H2O2三、实验步骤1.提取酶

3、液：取样品1.0g，加入2ml的0.05mol/LpH5.5的磷酸缓冲液，冰浴研磨，10000rpm，4℃离心后取上清，即为粗酶液。2.酶活性测定：采用愈创木酚比色法测定，对照为煮沸5分钟的粗酶液，反应体系包括：0.05mol/LpH5.5的磷酸缓冲液2.9ml；0.05mol/L愈创木酚1ml;2%H2021ml；粗酶液0.1ml，反应1分钟后，立刻在470nm下，测定OD值。以每分钟在470nm处吸光度的变化0.01为一个酶活单位。3.计算酶活性：选取OD值变化较均匀的一段数据，代入公式计算；以每分钟OD值变化0.01作为1个

4、过氧化物酶活力单位（U）。酶活力=活力单位(U)w(gFW)注：W=W总（gFW)×V(ml)/V总POD活性[U/g.min]=注：△A470为反时间内吸光度的变化，w为样品质量t为反应时间Vt为提取酶液总体积Vs为测定时间酶液体积△A470*VtW*Vs*0.01*t同工酶电泳一、原理聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂作用下聚合而成，具有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节。凝胶电泳兼有电荷效应和分子筛效应。被分离物质由于所载电荷数量、分子大小和形状的差异，因此在电泳时产生不同的泳动速率而相

5、互分离。利用特异性的颜色反应使待测酶着色，这样就可在凝胶中展现出酶谱。过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。植物体内许多生理代谢过程常与它的活性及其同工酶的种类有关。利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于有H2O2及联苯胺的溶液染色，出现蓝色或棕褐色部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带即构成过氧化物酶同工酶谱。本实验利用垂直板凝胶电泳，采用Tris－Gly缓冲系统来分离阴离子过氧化物酶同工酶。二、材料、仪器设备及试剂1.材料：玉米幼苗2.仪器设备：稳流稳压电泳仪；冷冻

6、离心机及离心管；pH试纸；3.试剂：（1)分离胶缓冲液（pH8.9）：1mol/LHCl48ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，加水定容至100ml。(2)分离胶贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加水溶解并定容至100ml，过滤后使用。(3)过硫酸铵溶液：过硫酸铵0.2g，加水定容至100ml制胶时现配现用）。(4)浓缩胶缓冲液：1mol/LHCl48ml＋Tris5.98g＋TEMED0.46ml，调pH6.7，并定容至100ml。(5)浓缩胶贮备液：丙烯酰胺10g，甲叉双丙烯酰胺2.5g,加水定容到1

7、00ml，使用前过滤。(6)电极缓冲液：Tris6.0g，Gly28.8g，用水定容至1000ml（pH8.3），用前稀释10倍。(7)四甲基乙二胺（TEMED）。(8)0.1％的溴酚蓝水溶液。(9)联苯胺染色母液：联苯胺1g＋冰醋酸18ml＋H2O2ml溶解贮于棕色瓶中。三、实验步骤1.安装电泳槽2.凝胶的配制3.过氧化物酶的提取：称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，加入1mlH2O或0.05mol/LTris－HCl缓冲液（pH6.8）研成匀浆，转入离心管，再用2ml前述溶液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管，

8、3500rpm离心15～20min，上清液即为酶提取液，供电泳分析用。4.点样：取10ul样品加等体积的40%的蔗糖溶液和5ul2%的溴酚蓝5.电泳6.剥胶：电泳完毕，将电泳槽取出，倒去缓冲液，取下凝胶管，放入培养皿中。用一个带有长针头的注射器，吸