资源描述：
《使用RNAscope-技术探索-HBV-DNA--cccDNA以及mRNA-在肝组织中的分布.docx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、使用RNAscope技术探索HBVDNA，cccDNA以及mRNA在肝组织中的分布简介HBV的感染侵入病人体内细胞后，其内含的HBV-DNA脱离包裹的蛋白质被释放形成rcDNA，依赖宿主的DNA聚合酶补齐形成更加稳定的cccDNA，并以cccDNA作为模板转录出不同大小的mRNA，作为各种抗原蛋白以及HBV-DNA的逆转录模板。基于各类核酸不同但同样重要的作用，本项目旨在用一种新型的RNAISH技术RNAscope@来标定HBV-DNA，cccDNA，mRNA，探索各类核酸在乙肝病人组织中的差异分布，并比较在乙肝病人四个发展阶段（immunotolerant,immuneacti
2、ve,inactivecarrier,andHBeAg-negativehepatitis）的不同变化，以及INF治疗效果不同病人之间的差异变化。本项目有助于我们进一步了解HBV传播的机制，为HBV的治疗提供指导。背景HBVcccDNA的形成HBV侵入人的肝细胞,在细胞质中脱去核壳,形成rcDNA。rcDNA进入肝细胞核中解脱正链3′端连接的末端蛋白、负链5′端的RNA残段（图一）;依赖宿主细胞的DNA聚合酶补齐两条链上的缺口,并进一步折叠、扭曲形成超螺旋结构的cccDNA,并以cccDNA为模板转录为不同大小的mRNA(3.5Kb、2.4Kb、2.1Kb、0.8KbmRNA),
3、从而翻译各种病毒蛋白。其中3,5Kb的pgRNA作为逆转录模板,利用病毒的逆转录酶合成全长的基因组负链DNA,再以负链DNA作为模板,通过病毒DNA聚合酶的作用,合成正链DNA,与负链DNA一起组成新的HBVrcDNA。新合成的HBVrcDNA一方面进入细胞核内,转化为新的cccDNA,补充细胞内的cccD2NA库,使每个肝细胞中保持大约5～50个cccDNA分子;另一方面与病毒蛋白装配成新的完整HBV,释放至细胞外,再感染健康的肝细胞(见图1)[1]。InHBVgenome,theincompleteplusstrandhasavariable3‘-endbutadefined
4、5’-endaroundposition1600nearDR2,whilethecompleteminusstrandhasdefined5‘-and3’-endswithaterminalredundancyof9bases[27].Thereisagaparoundposition1800nearDR1(Fig.1).图一HBV基因组结构。HBV基因组有部分单链，部分双链，以及部分的三DNA链在病毒粒子中。各HBV正义链的长度会有很大的不同，但是负义链有固定的5‘-和3’-端靠近1800左右的位置。圆圈，引物酶；钻石圈，DNA聚合酶。2.传统HBVcccDNA的常用检测方法根
5、据cccDNA与rcDNA在结构和理化特性上的不同,可以建立检测cccDNA的方法:(1)rcDNA能与蛋白质共价结合,cccDNA则不能。(2)rcDNA的双链是不对称的,全长的一链与病毒mRNA互补,为负链,较短的一链为正链。在正链和负链上均存在缺口,两链DNA通过5′端250～300个互补碱基的氢键作用形成部分环状结构,而非超螺旋结构;cccDNA的两条链均是完整的,形成超螺旋结构。(3)由于正链和负链上均有缺口存在,rcDNA可以被一些能够切除单链或含有缺口DNA的核酸酶如Plasmid2SafeTMATP2dependentDNase、绿豆核酸酶(mungbeannuc
6、lease)等降解成寡核苷酸或单核苷酸,而cccDNA则由于双链结构完整,不会被上述酶降解[2,3]。(一)SouthernblotHBVcccDNA以往多用Southernblot方法进行检测,该方法是分子生物学的经典方法,但对操作者的技术要求较高,且步骤繁琐,灵敏度较低[4]。图二Primerselection.PCRwasperformedtoselectprimerpairswhichcanspecificallyamplifyDNAfragmentfromHBVcccDNAbutnotgenomicDNAinthePCR.The106copiesofcccDNAfroma
7、plasmidcontainingHBVgenomewereusedastemplateinlane1,2,3,7,8,9,13,14,and15;while1.6×106copiesofvirusDNAisolatedfromHepAD38conditionmediumwereusedastemplateinlane4,5,6,10,11,12,16,17,and18.Primerpairs:1,4,HBV_CCC_F1/HBV_CCC_R1;2,5,HBV_CCC_F1/HB
