细胞工程-第十二章、试管动物与克隆动物

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1、第十二章、试管动物与克隆动物第一节　试管动物1978年7月25日深夜时分，英国曼彻斯特郊外的奥德姆总医院里，一个女婴的啼哭声划破夜空，震撼了世界……她就是世界上第一例试管婴儿——路易斯.布朗。一、试管动物概念将供体的精子和卵子在体外受精、体外培养胚胎，然后将发育到一定程度的胚胎移植入受体，可以得到各种动物。由于体外受精一般都在试管内进行，所以称为“试管动物”。也有称为“体外受精动物”。二、试管动物的培育流程精子的采集与体外获能处理卵子的回收与成熟培养卵子与精子的体外受精受精卵的体外发育试管胚胎的移植１、精子的采集与获能处理精液的采取方法通常有：人工阴道法、电刺激法、阴道内回收法等。对于

2、个体较大的动物多采用人工阴道法，而对于小动物而言多采用电刺激法采精。人工阴道法人工阴道法是由橡胶制造的双层圆筒，两层之间充以温水（38℃－40℃），后端有精液收集管以软橡胶膜袋与人工阴道相连。对于公牛而言，一般多应用台畜使爬上，将假阴道自侧面套在公牛阴茎上，使其射精。在公猪可以用猪用假阴道收集精液或用手握法采精，但仍需要台畜，使其爬上以遍进行操作。另外，也可以用特制的电极，插到公畜的直肠内，根据不同畜种给予不同的电流刺激，经过不同的时间，即可射精而得到精液。精液的保存精液的保存可以分为常温（15－25℃）、低温（0－5℃）和超低温冷冻（－79℃－-196℃）三种，其目的是要降低精子的代谢活

3、动，延长其存活时间，尽量保存其受精能力。保存前，要加稀释液，其成分按其作用可分为稀释剂、营养剂和保护剂等。稀释剂包括等渗氯化钠溶液和某些盐溶液，营养剂包括糖类、奶类和卵黄等，保护剂包括有抗冻作用的营养剂和其它一些如甘油、DMSO、糖类等。三种保存方法常温保存主要通过降低pH值达到抑制精子的代谢活动，一般可以保存2天以上。低温保存主要是抑制其正常的代谢活动，除猪外，其它家畜的保存效果均较好。如果应用超低温可以在液氮中长期保存精液，用时可以即时解冻。对于不同的动物，各种保存液的配制方法都有所差异的。人为使得精子获能可以利用自然交配法，即在交配后，由雌性生殖道回收精子。而雌性生殖道获能没有种属特

4、异性，因而可以由屠宰场取任何的动物的子宫或在实验室内取小动物的子宫给所需动物的精子获能。另外，可以利用人工配制的培养液使得精子获能。２、卵子的回收与成熟培养人工采卵是得到卵母细胞的方法通常利用激素进行诱导采卵或超数采卵。可以利用促性腺激素或黄体激素释放激素（LH－RH），对小鼠、大鼠和兔子等动物进行一次性投与诱发其排卵，排卵数目不变。以小鼠为例，通常可用3－5IUPMSG或2－3IUhCG或100μgFSH或100μgLH或0.02－0.05μgLH－RH皮下或腹腔内注射，12－14小时可以有70％－100％正常排卵。采卵（１）输卵管内采卵：以鼠为例，一般为了防止干燥可将屠杀后取出的输卵管

5、放在平皿内，用石蜡油覆盖，在实体显微镜下找到输卵管膨大部，用磨尖的钟表镊子，切开输卵管膨大部，使内容物溢出而找到卵。（２）对于稍大一些的动物可以用活体输卵管采卵，例如将兔子的腹部正中线切开，找出子宫角和输卵管。然后利用逆向冲卵法，自子宫输卵管连接处插入注射针，伞部以平皿接着冲洗；或在子宫输卵管连接处下1cm处，剪成V形小口，插入塑料细管，自伞部输卵管腹腔口插入，将液体推入，得到冲出的卵。（3）对于屠宰场中的大中型动物，可以用注射器插入卵泡中抽取，或在手术后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。（４）对人而言通常在超数排卵步骤处理后，用B超检测卵巢表面卵泡发育情况，然后，在腹腔后部体壁进行局部麻醉

6、，将腹腔镜望远镜插管插入，以观察卵巢表面卵泡成熟情况，然后用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针将卵吸出，放平皿中检查。卵母细胞一般检测得到卵母细胞后，可根据卵泡发育的不同时期，在显微镜下检查核和胞质发育的状况，如核的形态、位置和所处的时期。排出的卵母细胞，有多层卵丘细胞包围，除去卵丘细胞后，可以见到卵周隙增大，内有第一极体，核处于第二次成熟分裂中期。多数实验动物的卵母细胞胞质呈透明状，但由于胞质中富含大量脂滴和空泡，所以在镜下呈暗色。各种不同的动物，按照不同的分类标准，卵的分类可以分为优秀、普通、不良和异常卵。进行体外受精的卵母细胞，一般以卵丘卵母细胞复合体外面完整地包有3－4层卵丘细胞，卵母细胞

7、胞质无斑块者为佳。镜检卵母细胞如果新鲜或固定后要作整体观察，可以取凡士林石蜡（1：1）融化后滴于载片中部四角，在镜下用微吸管自平皿中吸取卵母细胞，滴到4滴凡士林石蜡滴的中央，盖上盖片并轻压之，即可置于相差显微镜下观察。如果要观察细节，需要染色、切片后观察。一般在卵固定后水洗染色，用琼脂与石蜡进行双重包埋，最后进行切片、脱腊和封固，进行观察。３、体外受精1951年Chang和Austin发现了精子的获能现象，为体外受精的实