第六章第四节生物化学方法及其在中医研究中的应用.doc

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1、第六章第四节生物化学方法及其在中医研究中的应用一．生物化学的主要实验方法有哪些？答题要点：（一）生物大分子物质的分离和提纯生物大分子主要指蛋白质、核酸、糖类和脂类等物质。制备高度纯化的生物大分子是研究大分子结构与功能的前提，整个分离提纯过程可分为以下几个阶段：1．材料选择。原则是：选取所需成分含量较高、来源丰富、工艺简单、成本低廉的材料。例如，胰岛素的提取可选择猪胰。还要注意取材新鲜，要进行预处理，对于蛋白质和核酸的提取要在低温条件下进行，防止生物大分子的变性、失活。2．细胞破碎。生物大分子绝大部分存在于细胞内。根据材料来源及

2、实验要求，可选取匀浆器研磨、高速组织捣碎器、反复冻融、超声波破碎、自溶、酶消化、表面活性剂处理法等。3．亚细胞器的分离。各类生物大分子在细胞内分布往往是区域化的。例，DNA几乎全部在细胞核中，电子传递链和氧化磷酸化酶系分布在线粒体，蛋白质合成酶系在内质网（微粒体）上，Na+-K+-ATP酶分布在细胞膜上等，因此细胞破碎后，可以先分离亚细胞器，这有助于制备纯度更高的生物大分子。亚细胞器的分离，一般采用不同密度梯度介质，经差速离心法制备。4．提取。提取过程，首先要使生物大分子与其他物质分离开来，使大分子物质充分释放出来，在此过程中

3、，特别要考虑溶剂性质、pH值、离子强度、介电常数、抽提温度等多种影响溶解度的因素，然后可结合经验并根据具体实验条件灵活地选取某一试剂进行提取。5．分离纯化。刚提取得到的大分子物质，往往是粗制品，含有许多杂质，必须进一步分离纯化。分离提纯各种生物大分子，主要根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大小等差异，选用有机溶剂沉淀，等电点沉淀，盐析，层析，电泳，超离心，吸附，结晶等方法。6．浓缩、干燥及保存。经过分离、纯化得到的提取液有时很稀，体积较大，需要采用蒸馏法、冰冻法、吸收法、超滤法等，去除水分而浓缩。最后低温保存，有时

4、还需加入防腐剂或稳定剂，防止生物大分子变性失活。（二）离心技术离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。这里的悬浮颗粒往往是指制成悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等。离心机转子高速旋转时，当悬浮颗粒密度大于周围介质密度时，颗粒离开轴心方向移动，发生沉降；如果颗粒密度低于周围介质的密度时，则颗粒朝向轴心方向移动而发生漂浮。常用的离心机有多种类型，一般低速离心机的最高转速不超过6000rpm，高速离心机在25000rpm以下，超速离心

5、机的最高速度达30000rpm以上。根据离心原理，可设计多种离心方法，常见下列三大类型：1．差速离心法。通过逐步增加相对离心力，使一个非均相混合液内形状不同的大小颗粒分步沉淀。2．密度梯度离心法。离心前，离心管内先装入分离介质（如蔗糖、甘油等），使形成连续的或不连续的密度梯度介质，然后加入样品进行离心，具体又可分为：1）速度区带离心法。离心前，离心管内先装入蔗糖、甘油、CsCl、Percoll等密度梯度介质，待分离样品铺在梯度液的顶部，离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心，利用各颗粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同，使具

6、有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。本法可分离各种细胞、病毒、染色体、脂蛋白、DNA和RNA等生物样品。2）预制梯度等密度离心法。要求在离心前预先配制管底浓而管顶稀的密度梯度介质，常用介质有蔗糖、CsCl、Cs2SO4等，待分离样品一般铺在梯度液顶上，如需挟在梯度液中间或管底部，则需调节样品液密度。离心后，不同密度的样品颗粒到达与自身密度相等的梯度层，即达到等密度的位置而获得分离。3）自成梯度等密度离心法。某些密度介质经过离心后会自成梯度，例Percoll，可迅速形成梯度，CsCl、Cs2SO4和三

7、碘甲酰葡萄糖胺经长时间离心后也可产生稳定的梯度。需要离心分离的样品可和梯度介质先均匀混合，离心开始后，梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时，可以带动原来混合的样品颗粒也发生重新分布，到达与其自身密度相等的梯度层里，即达到等密度的位置而获得分离。3．沉降平衡离心法。根据被分离物质的浮力密度差别进行分离，所用的介质起始密度约等于被分离物质的密度，介质在离心过程中形成密度梯度，被分离物质沉降或上浮到达与之密度相等的介质区域中停留并形成区带。（三）层析技术层析法又称色谱法，是目前广泛应用的一类分离分析技术

8、。它是利用混合物各组分理化性质上的差异，例如吸附力、溶解度、分配系数、带电性、分子大小、亲和力等，使各组分以不同程度分布在二个相中，其中一个为固定相，另一个为流动相，当混合物随流动相通过固定相时，由于各组分受固定相的阻力和流动相的推力不同，而使各组分移动速度各异，以达到分离的