菌种测定方法.doc

《菌种测定方法.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、附　录　A（规范性附录）枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌的计数和杂菌率的测定A.1　原理每个活菌在适宜的培养基和良好的生长条件下，经过合适的培养时间可繁殖成一个肉眼可见的菌落，通过对菌落数量的统计，便可计算出相应样品的单位活菌数。A.2　培养基除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的三级水或相当纯度的水。按本标准规定的方法配制培养基或购买商品化的产品。A.2.1　枯草芽孢杆菌培养基A.2.1.1　成分营养琼脂33g；蒸馏水1000mL。A.2.1.2　制法将33g营养琼脂溶解于蒸馏水中，定容至1000mL；121℃灭菌20min。A.2.2

2、　酿酒酵母菌培养基A.2.2.1　成分孟加拉红培养基36.6g；蒸馏水1000mL。A.2.2.2　制法将36.6g孟加拉红培养基溶解于蒸馏水中，定容至1000mL；121℃灭菌20min。A.2.3　植物乳杆菌培养基A.2.3.1　成分蛋白胨10g；牛肉膏10g；酵母提取物5g；磷酸氢二钾2g；柠檬酸三铵2g；乙酸钠5g；葡萄糖20g；吐温-801mL；七水硫酸镁0.58g；四水硫酸锰0.25g；琼脂粉20g；灭菌碳酸钙3g；蒸馏水1000mL。A.2.3.2　制法将上述试剂依次溶解于蒸馏水中，七水硫酸镁和四水硫酸锰单独用蒸馏水溶解后混入前述溶液中，最后加入琼脂粉，定容至10

3、00mL；121℃灭菌20min。A.2.4　麦康凯培养基A.2.4.1　成分蛋白胨17g；脙胨3g；猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g；氯化钠5g；琼脂17g；蒸馏水1000mL；0.01%结晶紫水溶液10mL；0.5%中性红水溶液5mL。A.1.1.1　制法A.将蛋白胨、脙胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2。将琼脂加入600mL蒸馏水中，加热溶解。将两液合并，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。B.临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50～55℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。（注：结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌）A.2　仪器

4、与设备A.2.1　超净工作台。A.2.2　天平：感量：0.01g。A.2.3　震荡器。A.2.4　高压灭菌器：≥121℃。A.2.5　生化培养箱：±1℃。A.2.6　玻璃培养皿。A.2.7　移液器：精度为1μL。A.2.8　显微镜：1000倍。A.2.9　玻璃或塑料涂布棒。A.3　样品制备按GB/T14699.1的规定，采取有代表性的样品200g，按GB/T20195制备试样，装入样品瓶中做好标记后备用。A.4　测定步骤A.4.1　样品稀释准确称取待测样品10g，放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成10

5、-1稀释液；再用1mL无菌吸管，吸取10-1稀释液1mL移入装有9mL无菌水的试管中，充分混匀即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2菌液1mL移入装有9mL无菌水试管中，即成10-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀释度菌液，供平板接种用。A.4.2　涂布枯草芽孢杆菌用涂布法：每个样品根据菌量不同取两个相邻合适稀释梯度，用1mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1mL，加至直径为9cm的培养基平皿的琼脂培养基表面，用无菌玻璃涂布棒将菌悬液均匀涂于琼脂表面。每个稀释梯度做三个平行，同时用无菌水作为空白对照。酿酒酵

6、母菌用混匀法：每个样品根据菌量不同取两个相邻合适稀释梯度，用1mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液1mL，加至直径为9cm平皿中，当培养基冷却至45℃左右(实验中用手触摸温热即可)，在每个培养皿中各倒入约15mL培养基，然后迅速旋动培养皿，使菌悬液与培养基充分混匀，置水平位置静止后使之凝固。每个梯度做三个平行，同时用无菌水作为空白对照。植物乳杆菌用混匀法：每个样品根据菌量不同取两个相邻合适稀释梯度，用1mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液1mL，加至直径为9cm平皿中，当培养基冷却至45℃左右(实验中用手触摸温热即可)，在每个培养皿中各倒入约15mL培养基，然后迅速旋动培养皿，

7、使菌悬液与培养基充分混匀，置水平位置静止后使之凝固。每个梯度做三个平行，同时用无菌水作为空白对照。A.1.1　培养枯草芽孢杆菌培养基平皿置培养箱内37℃倒置培养17-22h；酿酒酵母菌培养基平皿冷凝后置培养箱内28℃倒置培养48h；植物乳杆菌培养基平皿冷凝后37℃培养箱倒置培养48h，分别观察菌落形态，鉴别后计数。A.1.2　菌落特征A.1.2.1　枯草芽孢杆菌：培养基平皿置培养箱内37℃倒置培养24h后，菌落不规则，粗糙，不透明，不闪光，蔓延，污白色。A.1.2.2　酿酒酵母菌：培养基平皿