基因工程研究策略和实践.ppt

《基因工程研究策略和实践.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、基因工程研究策略和实践基因决定性状青霉素能产生青霉菌家蚕能吐出蚕丝为人类利用定向改造基因的设想1.能否让细菌“吐出”蚕丝？2.能否让微生物产生人胰岛素、干扰素等昂贵药物？经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物DNA的技术-基因工程基因工程的概念将获取的目的基因片段在体外与载体DNA通过人工剪切、连接构成DNA重组体，将其导入受体细胞并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和表达，这种有目的的应用分子克隆技术,人为的改造基因、改变生物的遗传性状的系列过程,总称为基因工程。基因工程别名DNA重组技术操作环

2、境生物体外操作对象基因操作水平DNA水平基本过程剪切→拼接→导入→表达结果人类需要的基因产物基因工程过程示意图①从细胞中分离出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片断③提取大肠杆菌中的质粒④DNA重组⑤用重组质粒转化大肠杆菌⑥培养大肠杆菌克隆大量基因/使其表达③③基因工程的研究策略一、目的基因的分离(donorDNA)二、载体DNA及其改造(VectorDNA)三、体外DNA重组(DNArecombination)四、重组DNA的转化(Transformation)五、重组体的筛选鉴定与克隆扩增(identifica

3、tion&cloneamplification)六、目的DNA在受体细胞中的表达(geneexpression)一、目的基因的分离从cDNA文库中分离目的基因从基因组DNA文库中分离目的基因PCR扩增目的基因片段化学方法人工合成基因mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库逆转录酶载体受体菌复制1.从cDNA文库中分离目的基因逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ碱水解TTTTcDNA文库仅包含正在表达的基因不同物种、不同组织的cDNA文库不相同基因总量少，易筛选组织或细胞染色体DNA基

4、因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合2.从基因组DNA文库获取目的基因包含所有遗传信息构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）筛选难度大用于研究基因在基因组中的情况3、PCR扩增目的基因片段适用于克隆序列清楚的基因以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难多采用以mRNA为模板的RT-PCR法PCR扩增仪4.化学合成法获取较短的目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列二、载体DNA载体(Vector)载体是目的基因的

5、运载工具，其作用是将目的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。常用载体质粒病毒载体噬菌体粘性质粒/粘粒载体的选择标准有复制起点，能自主复制；具有筛选标记，便于重组体的筛选和鉴定；具有一种或多种限制性内切酶的单一切割位点，并在位点中插入外源基因后，不影响其复制功能；分子量小，以容纳较大的外源DNA。表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)

6、为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体的分类-按作用分穿梭载体(shuttIevector)又称双功能载体(bifunctionalvector)。能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体。其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列（ARS），它即能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效

7、率。如pKSV一10、pJDB219载体等。载体的分类-按来源分质粒(plasmidvector)病毒(virusvector)噬菌体(phagevector)粘性质粒/粘粒(cosmidvector)1.质粒载体:(1)分子量较小，在细菌中有较多的拷贝数。(2)松驰型。(3)具有一个以上的标志，便于筛选。(4)具有数个或一个单一的酶切点。天然的质粒不能具备以上所有条件，所以实际应用的都是人工构建的质粒，其中最常用的是pBR322,pUC19.，常用的质粒载体pBR322pUC118/1192．病毒载体（1）整合型载

8、体：外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。（2）游离型载体：能够以病毒颗粒的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。如：腺病毒。3.λ噬菌体载体现用的λ噬菌体载体都是在野生型基础上改造而成的。改建之后的常用载体有两类：①插入型载体，具有一个可供外源DNA插入的克隆位点，只能插入较小的外源D