红外-拉曼光谱.ppt

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1、红外、拉曼色谱在蛋白质二级结构测定中的作用拉曼散射光谱的基本概念一束频率为V0的入射光，照射到气体液体或透明晶体样品上，绝大部分可以透过，大约有0.1%的入射光光子与分子发生碰撞后向各个方向散射。有一部分散射光发生了光子与分子之间的能量交换，即非弹性碰撞，散射的频率不再等于V0，而是Vi，这种散射现象称为拉曼散射。根据这个原理所获得的散射光谱，称为拉曼光谱。若入射光与基态分子相碰撞而发生拉曼散射，分子从光子那里获得能量，从振动基态跃迁到振动的激发态，而散射光子的能量减小，散射光的频率低于入射光的频率，这种形式的拉曼散射称为Stokes辐射，相应的光谱线称为

2、Stokes线。如果与入射光相碰撞的分子是处于振动的激发态，结果分子交出能量给光子，散射光子的能量增强，散射光的频率大于入射光的频率，这种形式的拉曼散射称为反-Stokes辐射，相应的谱线为反-Stokes线。在振动光谱中有九个谱峰，按波数递减的方向命名为酰胺A、B及酰胺I至VII带，各种酰胺(Amide)频率：在3000cm-1以上，有酰胺A（3280cm-1）及酰胺B（3090cm-1）；在1700cm-1以下有酰胺Ⅰ（1650cm-1）酰胺Ⅱ(1550cm-1)酰胺Ⅲ(1300～1250cm-1)酰胺Ⅳ(627cm-1)酰胺Ⅴ(725cm-1)酰胺Ⅵ

3、(600cm-1)及酰胺Ⅶ(206cm-1)。拉曼散射光谱的应用酰胺A3280cm-1酰胺B3090cm-1酰胺Ⅰ1650cm-1酰胺Ⅱ1550cm-1酰胺Ⅲ1300～1250cm-1C=O伸缩、C—N伸缩和N—H面内弯曲振动N—H面内变形及C—N伸缩振动C—H伸缩振动振动谱带振动波数归属N-H伸缩N-H伸缩（费米共振）酰胺Ⅳ627cm-1O=C—N面内弯曲振动酰胺Ⅴ725cm-1N—H面外弯曲酰胺Ⅵ600cm-1C=O面外弯曲酰胺Ⅶ206cm-1C—N扭曲振动振动谱带振动波数归属此外，还有可能存在C—CH3伸缩振动频率（910～890cm-1）以及骨架振

4、动频率（500cm-1以下）。酰胺I带各子峰所对应的二级结构：Table2FT-RamanfrequenciesofproteinamideIbandsandtheirassignmentstodifferentsecondarystructure此外，Lippert等人用已知二级结构的蛋白质（聚-L-赖氨酸）的拉曼光谱得到一组强度参数，然后用蛋白质拉曼光谱的酰胺III和酰胺I′（重水溶液）谱带强度建立了一组联立方程，从而求解蛋白质的二级结构。根据Lippert等的方法，以聚-L-赖氨酸的三种构象为模型，利用四阶联立方程组：聚-L-赖氨酸三种构象的酰胺谱带

5、（1240，1632，1660）对CH21448cm-1模式的相对强度数据水溶液重水溶液124016321660聚-L-赖氨酸，α-螺旋0.000.800.55聚-L-赖氨酸，β-折叠1.200.720.88聚-L-赖氨酸，无序0.600.080.78注：这些数据是Lippert等的修正值另外，在多肽和蛋白质的拉曼光谱中，谱带850和830是酪氨酸残基的对未取代基的有关振动。由于环的呼吸振动和面外弯曲振动倍频之间的费米共振，它们总是成双成对的出现，而且这两谱带的强度比可表征酪氨酸残基所处的环境，并定量的表示它呈“暴露式”或“埋入式”。0.5Nbury+1.

6、25Nexpo=I850/I830Nbury+Nexpo=1红外光谱的应用蛋白质主要表现出九个吸收谱带，其中酰胺I（1600～1700cm-1）是C=O伸缩、C—N伸缩和N—H面内弯曲振动的贡献，对蛋白质二级结构的研究最有价值，其振动频率受C=O和N—H之间氢键的影响，通过这个可以测定氨基酸链的二级结构。酰胺I带的归属：1650～1658α-螺旋1640～1610β-折叠1700～1660β-转角1650～1640无规卷曲但是H2O在1640附近的吸收对其造成很大影响，目前可以采用吹扫，差减及氘代等方法消除水的干扰。自然界存在的蛋白质是许多种不同构象的多缩

7、氨基酸，这样就会使蛋白质的酰胺I很复杂，主要是α-螺旋，β链和无规则多肽片段引起的峰重叠。由于这种重叠组分带的带宽很大，使人们不可能从测出谱带中鉴定。酰胺III带由于信号较弱，过去很少应用于蛋白质二级结构测定，但由于水再次吸收带没有吸收峰，解决了严重的水汽干扰，不同二级结构在III带的光谱性质特征明显，拟合过程中易于将其分开。尤其对于I带中因峰重叠而难以区分的螺旋和无规则卷曲结构，在III带中得以明显的分离。酰胺III带谱峰归属：1330～1290α-螺旋1295～1265β-转角1270～1245无规卷曲1250～1220β-折叠其中1290～1295，

8、1265～1270及1245～1250三个区域为相邻二级结构的交盖