过表达小麦泛素基因Ta-Ub2加快烟草发育进程机制的研究.docx

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1、过表达小麦泛素基因Ta-Ub2加快烟草发育进程机制的研究蛋白质作为生物体细胞的组成成分以及生命活动的主要承担者，其合成和降解对生物体具有十分重要的意义。蛋白质降解主要通过两种途径：溶酶体降解以及需能的泛素/26S蛋白酶体系统（Ubiquitin-26SProteasomeSystem，UPS）。UPS在泛素活化酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）的共同作用下，将76个氨基酸组成的标签蛋白泛素（Ubiquitin，Ub）结合到底物蛋白上。标记后的蛋白被蛋白酶体降解或者进行信号通路的调节。通过对底物蛋白进行不同形式的泛素化修饰，可以调节多种细胞活动

2、，如信号转导、基因转录以及细胞程序性死亡等。近年来的研究表明，UPS参与调节几乎所有的植物生长发育过程，但是以前的研究主要集中在E3的作用上，对泛素在这些过程中的作用，报道较少。实验室之前获得了过表达小麦泛素基因Ta-Ub2的转基因烟草，初步观察发现，转基因植株的表型变化较大，但是过量表达Ta-Ub2引起转基因植株表型变化的机制不清楚。本研究首先通过基因组PCR和半定量RT-PCR的方法鉴定了T-2、T-11两个株系用做实验材料，研究泛素对植物生长发育的作用，及其生理与分子机制。主要研究结果如下：（1）表型观察与结果统计显示，过量表达Ta-Ub2的转基因烟草

3、T-2和T-11相对于野生型烟草表现出明显的生长加快，开花提前。转基因烟草的花期相对野生型烟草提前约30天。（2）为进一步明确烟草的发育状况，用实时定量PCR（qRT-PCR）的方法检测烟草的发育标记基因（NtMADS-4、NtMADS-11）的表达，以在分子水平上确定转基因和野生型烟草发育时期的差异。结果显示转基因烟草NtMADS-11的表达量与迟后30天的野生型烟草相似，进一步在分子水平上说明过表达Ta-Ub2加快了烟草的发育进程。（3）用蛋白免疫方法检测了开花期的野生型烟草泛素蛋白的含量变化，结果表明，伴随着烟草顶端发育过程，顶端组织泛素水平变化明显，

4、暗示泛素参与烟草顶端发育过程。（4）提前抽薹是转基因烟草最显著的性状，同时可能是生长加快、提前开花的原因，而GA在植物抽薹过程中具有重要作用。我们用高效液相色谱的方法测定了转基因烟草叶片和茎尖的总赤霉素（GA）的含量，结果显示转基因烟草的总GA含量均高于野生型或与野生型烟草持平。考虑到总GA包括GA前体、活性GA以及无活性的GA，进一步地用酶联免疫法测定了活性GA含量，结果显示转基因烟草叶片和茎尖的GA3和GA4水平均高于野生型。（5）外源施加GA3使野生型烟草的抽薹提前，并且使野生型烟草表现为类似转基因烟草的表型。进一步说明转基因烟草体内的GA的含量增加可

5、能是造成了抽薹提前的原因。（6）GA的生物合成与代谢是一个复杂的过程，其中许多关键酶在GA代谢以及活性GA水平控制中具有重要作用，包括GA20氧化酶、GA3氧化酶以及GA2氧化酶。我们用qRT-PCR的方法在烟草发育过程中几个关键时间点，检测了GA20氧化酶、GA3氧化酶以及GA2氧化酶的表达水平，结果显示过表达Ta-Ub2影响了这些GA代谢基因的表达。相同发育时期的烟草比较结果显示，过表达Ta-Ub2上调了GA20氧化酶、GA3氧化酶以及GA2氧化酶的基因表达。综合以上结果，过量表达Ta-Ub2改变了转基因烟草的生长发育进程。这种进程的改变可能与GA代谢的

6、改变有关。过量表达Ta-Ub2通过调节GA代谢相关基因的表达，改变了转基因烟草的GA水平，导致转基因烟草提前抽薹开花。