氨苄青霉素抗性在大肠杆菌中的研究

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1、学号：091201215分子生物学实验论文(2009级本科)题目：氨苄青霉素抗性在大肠杆菌中的研究系（部）院：农业与生物技术学院专业：生物工程作者姓名：何增寿完成日期：2011年12月10日二零一一年十二月氨苄青霉素抗性在大肠杆菌中的研究（农业与生物技术学院工程09（2）班何增寿091201202）摘要：为研究人工合成的氨苄青霉素在大肠杆菌中的抗性表达，利用PGEM--Teasy质粒为载体，把人工合成的抗氨苄青霉素的基因导入大肠杆菌，通过含有氨苄青霉素的培养基筛选出抗氨苄青霉素的基因的大肠杆菌，对筛选出的大肠

2、杆菌进行质粒DNA提取,并对质粒进行PCR扩增和酶切电泳图分析。结果表明：人工合成的抗氨苄青霉素的基因在大肠杆菌中表达并复制。关键字：氨苄青霉素抗性大肠杆菌研究引言：在分子生物学日益普及的今天,基因操作已成为一项重要的常规技术。体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达,从而得到大量的重组基因。其中尤以转化为主。目前可以通过两种方法得到大肠杆菌感受态细胞的储存物:第一种是通过商业途径购买冻存的感受态细胞,其转化效率十分可靠,一般可以达到108的转化子/μg质粒DNA,但是相当昂贵,通常

3、选择的是自制感受态细胞的储存物。因此,感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节,其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。1材料和方法1.1实验材料1.1.1供试材料：大肠杆菌（实验室提供）PGEM--Teasy质粒Taq酶1.1.2仪器：基因扩增仪移液器电泳仪紫外检测仪恒温摇床恒温水浴器恒温培养箱低温离心机超净工作台冰箱离心管小指管1.1.3试剂：PCR缓冲液(含Mg2＋)4种dNTPTaq酶DNA模板两种引物（正向引物和反向引物）EB溶液氯化钠(Nacl)氨苄青霉素氯化钙(CaCl2)酒精灯牙

4、签LB液体培养基ddH2O溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.HClpH8.0,10mmol/LEDTA）溶液Ⅱ0.4mol/LNaOH，2%SDS用前等体积混合溶液Ⅲ5mol/LKAc溶液60ml，11.5ml冰醋酸，28.5ml去离子水。Tris.HClRNase溶液1.2方法1.2.1PCR基因扩增1.2.1.1按顺序向微量离心管中依次加入：ddH2O35μlDNA样品1μl10×PCR缓冲液5μl2.1mmol/LdNTP4μl引物I2μl引物Ⅱ2μl混匀。1.2.1.2PCR反

5、应参数(1)94℃预变性5min(2)94℃变性1min(3)47℃退火1min(4)72℃延伸2min。(5)重复(2)-(4)30次（6）72℃延伸10min。（7）4℃保存1.2.1.3琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果：取10μlPCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。保持电流40mA。电泳结束后，用EB染色15min，紫外灯下观察结果。1.2.2DNA重组1.2.2.1取灭菌的EP管，先后加入PGEM--Teasy质粒1μl，2μl酶切缓冲液，1μlE.coRI酶，无菌双蒸水15ul，至反应混合物总体积20

6、ul，离心混匀，37℃反应3h。1.2.2.2在另一灭菌的Eppendorf管中，加λDNA1.5ug，1μl酶切缓冲液，1μlEcoRI酶，无菌双蒸水补到10ul，37℃反应3h。1.2.2.3将酶解液加入1/10体积的3mol/LKAc溶液，在加2倍体积无水乙醇，-20℃冰箱，2h沉淀DNA。12000r/min4℃离心15min，弃上清，加70%乙醇洗沉淀，再离心，去上清，真空干燥后，加5ulTE溶液。1.2.2.4将酶切后的2个DNA片段混合于一管中，加T4DNA连接酶缓冲液1ul，T4DNA连接酶1

7、ul，14℃保温14h，并作转化试验。1.2.3大肠杆菌感受态细胞的制备及转化1.2.3.1从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落接于3mlLB液体培养基试管中，37℃振荡过夜。1.2.3.2取0.5ml过夜培养液，接种于50mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h，至OD600<=0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2h。（注：以下操作均应在冰浴中进行。）1.2.3.3将培养液1ml分装入1.5ml离心管中，在冰上冷却10--30min于4℃离心，4000r/min×10min，弃去上清。1.2.3.4用冰

8、浴的0.1mol/LCaCl220µl悬浮。1.2.3.54℃离心，4000r/min×10min，弃去上清，加入冰浴的0.1mol/LCaCl2-甘油溶液200μl悬浮于冰上20-30min。4℃离心，4000r/min×10min，弃去上清。1.2.3.6分装细胞，每200ul一份，-70℃冻存备用，此为感受态细胞。取新鲜制备的200mL感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻地将细胞均匀悬浮。加入