显微镜的使用资料讲解.ppt

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1、显微镜的使用HAT培养基主要组分H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA选择作用淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻目的要求掌握动物骨髓细胞染色体制备的基本过程及原理。掌握小鼠骨髓细胞染色体制备步骤及试剂的作用。观察小鼠染色体的形态特征及数目实验原理染色体只有在分裂期的细胞，特别是中期细胞中表现出典型形态便于

2、观察和计数。用秋水仙素处理骨髓细胞后，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，再经低渗处理、固定、滴片、染色等步骤，得到染色体标本。最常用的是骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞。方法与步骤注射秋水仙素（Cochicine）实验前3～4小时，向腹腔内注射秋水仙素。注射浓度随动物种类不同而异。秋水仙素的主要作用是抑制纺锤体的形成，使有丝分裂停于中期，增加中期分裂相的比例。处死小鼠：颈椎脱臼法1、剪取小鼠的后肢，注意不要将股骨两端关节剪断，否则容易造成骨髓细胞的流失。2、将股骨上皮肤、肌肉用剪刀、纱布清除干净，然后将股骨两端的关节剪去，使股骨两端相通。取股骨：用小针筒吸取0.0

3、75mol/LKCl低渗液(5ml)，在培养皿中反复冲洗骨髓腔，使骨髓细胞全部洗脱出来。收集细胞：实验步骤5ml反复冲洗加固定液5滴终止低渗前1～2min秋水仙素颈椎脱臼小白鼠处理实验前3～4h处死、取股骨KCl低渗液收集骨髓细胞37℃静置30min低渗混匀、预固定2000转∕分5min离心、弃上清加固定液5ml、混匀10min固定2000转∕分5min离心、弃上清8-10滴固定液细胞悬液吹打混匀预冷的玻片低渗：0.075mol/LKCl固定：甲醇:冰醋酸3:1滴片：20-30cm的高度(预冷洁净的载玻片)染色：Giemsa染液7min镜检：“U”形染色体2n=4

4、0结果观察结果观察结果观察结果显示小鼠染色体的特点：呈“U”型，全部为端着丝粒染色体；40条（19对常+1对性）小鼠染色体核型图：注意事项：1.把握好秋水仙素的浓度和处理时间。2.控制好离心的速度。3.低渗处理是实验成败的关键，其目的是使细胞体积胀大，染色体松散。低渗处理时间过长，会造成细胞破裂，染色体丢失。低渗处理时间不足，细胞内染色体易聚集在一起，观察时无法准确分辨与计数。4.固定液要现用现配。5.用吸管吹散细胞时用力必须尽量轻柔。6.载玻片要洁净、预冻；滴片要有一定高度。人染色体制备镜下所见染色体非显带染色体G-带染色体染色体G显带制作技术原理：G显带技术是

5、指经胰蛋白酶处理后用Giemsa染色的方法。也是目前最基本最常用的染色体分析技术，它不仅能对染色体数目，而且能对染色体结构畸变进行分析。为什么经胰蛋白酶处理后染色体上会出现深浅不同的带纹呢？这与染色体的化学成份有关。染色体经蛋白水解酶类物质处理后，蛋白质部份被水解，使DNA中碱基暴露。由于DNA中碱基组合的比例不同，对染料结合程度不同，形成深浅不同的带纹。染色体核酸（DNA为主）蛋白质组蛋白非组蛋白实验操作1.将染色体标本放入60-70度烘箱中烤2-3小时，然后放入37度恒温箱中备用。2.把配制成0.042%胰蛋白酶液置室温预温。3.取一张玻片浸入已预温的胰酶溶液

6、中，处理大约20-25秒左右。4.缓冲液冲洗。5.1:10Giemsa液染色8分。6.冲洗，晾干，镜检。ISCN2005预习：实验一醋酸纤维素薄膜电泳的原理？P55：1、2思考题3、简述对本次实验的各个操作及染色体观察的体会？显微镜使用、细胞的基本形态与结构《细胞培养技术》录像动物染色体制备秋水仙素、低渗处理蟾蜍血细胞的体外融合原理、试剂、细胞融合的原理、细胞计数格子AKP的Km测定原理、试剂双缩脲法测定蛋白质含量葡萄糖的酶法测定原理、试剂酶联免疫吸附试验（ELISA）—双抗体夹心法实验原理醋纤薄膜电泳分离血清蛋白实验原理对流免疫电泳鉴定免疫球蛋白实验原理小鼠脾单

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